本發(fā)明涉及一種低危型人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無(wú)被膜包被的、環(huán)狀雙鏈dna病毒，基因組長(zhǎng)約8000堿基對(duì)（bp），分為3個(gè)功能區(qū)，即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（e區(qū)）、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（l區(qū)）和非轉(zhuǎn)錄區(qū)（長(zhǎng)控制區(qū)，lcr）。hpv通過(guò)直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類(lèi)。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，引起人類(lèi)皮膚的多種乳頭狀瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。hpv根據(jù)其基因組核苷酸序列不同，目前已經(jīng)分離出130多種基因型，不同基因型別引起不同的臨床表現(xiàn)。對(duì)于感染生殖道和肛門(mén)的hpv，根據(jù)各基因型別致病力大小或致癌危險(xiǎn)性大小可分為低危型和高危型兩大類(lèi)。低危型hpv一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，極少引起浸潤(rùn)癌，其中最常見(jiàn)的基因型是6和11型，其次是40、42、43、44型。尖銳濕疣是國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定要求監(jiān)測(cè)的八大性傳播疾病之一，它的發(fā)病率僅次于淋病，由于病情易反復(fù)發(fā)作，傳染性極強(qiáng)，已經(jīng)成為嚴(yán)重危及人們正常生活的常見(jiàn)性病之一。由于hpv病毒難于培養(yǎng)，目前臨床上檢測(cè)低危型hpv的常用方法依賴(lài)于分子生物學(xué)核酸檢測(cè)方法，主要是熒光pcr法（cn101251469a）、膜雜交固相芯片法（蔣明軍等，中華皮膚科雜志，2005,38（5）：262-264）和液相懸浮芯片法（cn100582239c），特別是taqman探針熒光pcr法，相對(duì)于其它兩種方法，具有閉管檢測(cè)污染少、操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果靈敏準(zhǔn)確特異的優(yōu)點(diǎn)，適用于尖銳濕疣樣本中低危型hpv的快速檢測(cè)，適合在基層臨床機(jī)構(gòu)推廣使用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種單管低危型人乳頭瘤病毒（hpv）核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，試劑盒所用四對(duì)熒光pcr擴(kuò)增引物序列為seqidno：1～seqidno：8，五條熒光探針序列為seqidno：9～seqidno：13，其中熒光探針seqidno：9和seqidno：10序列5’端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，熒光探針seqidno：11序列5’端標(biāo)記joe或hex或vic熒光基團(tuán)，熒光探針seqidno：12序列5’端標(biāo)記rox熒光基團(tuán)，熒光探針seqidno：13序列5’端標(biāo)記cy5熒光基團(tuán)，這五條探針3’端均標(biāo)記bhq淬滅基團(tuán)。本發(fā)明提供的低危型hpv核酸檢測(cè)試劑盒能實(shí)現(xiàn)在單個(gè)反應(yīng)管中通過(guò)熒光pcr反應(yīng)，檢測(cè)臨床常見(jiàn)的低危型hpv，結(jié)果靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、特異性高，對(duì)尖銳濕疣的診斷和早期預(yù)防具有較大的臨床意義。技術(shù)方案通過(guò)對(duì)genbank中hpv基因型核苷酸序列查詢(xún)，用vectornti、oligo等軟件對(duì)各種hpv基因亞型的l1基因序列進(jìn)行比對(duì)設(shè)計(jì)，按照taqman探針熒光pcr設(shè)計(jì)的原則，優(yōu)選了四對(duì)引物擴(kuò)增hpv6、11、40、42、43、44這六種臨床常見(jiàn)的低危型hpv保守區(qū)域，并同時(shí)優(yōu)選了五條熒光探針檢測(cè)這六種hpv亞型，試劑盒中的這些引物和熒光探針核苷酸序列（5’->3’）如下：上游引物（seqidno：1）：agatgtggcggcctag；下游引物（seqidno：2）：gtctagaactgctrgcatg；上述這對(duì)引物擴(kuò)增hpv6、11、44型基因片段。上游引物（seqidno：3）：atgaaaatcaagtatatttaccac；下游引物（seqidno：4）：gatgtcctatagtcagtaacc；上述這對(duì)引物擴(kuò)增hpv40型基因片段。上游引物（seqidno：5）：caactatttaataaaccatattgg；下游引物（seqidno：6）：tgtatcaccagatgttgc；上述這對(duì)引物擴(kuò)增hpv42型基因片段。上游引物（seqidno：7）：ttggcttttcagaaacaac；下游引物（seqidno：8）：ggttttcagtgtcatcatac；上述這對(duì)引物擴(kuò)增hpv43型基因片段。熒光探針（seqidno：9）：cacagtatatgtgcctcctcc，序列5’端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，檢測(cè)hpv6、11型；熒光探針（seqidno：10）：cgccccagtatccaaag，序列5’端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，檢測(cè)hpv44型；熒光探針（seqidno：11）：acgcctgttgctaccattgttag，序列5’端標(biāo)記joe或hex或vic熒光基團(tuán)，檢測(cè)hpv40型；熒光探針（seqidno：12）：caacaagcacaaggacacaata，序列5’端標(biāo)記rox熒光基團(tuán)，檢測(cè)hpv42型；熒光探針（seqidno：13）：tggttacatcagacactcagc，序列5’端標(biāo)記cy5熒光基團(tuán)，檢測(cè)hpv43型；這五條熒光探針序列3’端均標(biāo)記bhq淬滅基團(tuán)。上述引物和熒光探針輔以pcr反應(yīng)成分一起組成反應(yīng)體系，實(shí)現(xiàn)單管檢測(cè)六種低危型hpv。所述擴(kuò)增試劑反應(yīng)體系各成分組成如下：10mmtris-hcl（ph8.3）、50mmkcl、0.2mmdntps（含datp、dgtp、dctp、dutp）、1.5～5mmmgcl2、各0.1～0.5μm引物和熒光探針（seqidno：1～4）、1～5utaqdna聚合酶和0.01～1uung酶，提取的模板10μl，總反應(yīng)體積30μl。所述低危型hpv熒光pcr檢測(cè)試劑盒擴(kuò)增程序如下：50℃2min、95℃5min后按照95℃10sec、60℃40sec循環(huán)擴(kuò)增40次，循環(huán)步驟中60℃時(shí)采集fam、joe、rox和cy5四個(gè)波長(zhǎng)熒光信號(hào)。所述低危型hpv熒光pcr試劑盒對(duì)照品包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各1個(gè)，陰性對(duì)照采用生理鹽水；分別構(gòu)建四個(gè)含有hpv6、40、42、43型擴(kuò)增產(chǎn)物序列插入puc18t載體上的質(zhì)粒大腸桿菌（各稱(chēng)為hpv6型質(zhì)粒大腸桿菌、hpv40型質(zhì)粒大腸桿菌、hpv42型質(zhì)粒大腸桿菌、hpv43型質(zhì)粒大腸桿菌），將這四種質(zhì)粒大腸桿菌以相同濃度等體積混合（103copy/ml），作為試劑盒陽(yáng)性對(duì)照。本發(fā)明提供了熒光pcr檢測(cè)的試劑盒，優(yōu)化了pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。當(dāng)然本研究領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)熒光pcr的一般要求可以調(diào)整pcr反應(yīng)體系和程序，也同樣能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的目的。有益效果本發(fā)明根據(jù)上述設(shè)計(jì)的引物探針和技術(shù)方案，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件研制成低危型hpv核酸檢測(cè)試劑盒，其主要優(yōu)點(diǎn)和在用于低危型hpv檢測(cè)時(shí)的有益效果如下：（1）通過(guò)序列比對(duì)，精簡(jiǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了四對(duì)特異性擴(kuò)增引物和五條特異性熒光探針，在熒光pcr儀四個(gè)波長(zhǎng)實(shí)現(xiàn)了六種低危型hpv的檢測(cè)，具有準(zhǔn)確性、特異性高的優(yōu)點(diǎn)。（2）六種低危型hpv能在單個(gè)反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)閉管一步法快速檢測(cè)，無(wú)需后處理步驟，提高了工作效率。（3）擴(kuò)增體系中的dutp－ung酶系統(tǒng)更進(jìn)一步避免了因擴(kuò)增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的結(jié)果假陽(yáng)性，提高了試劑盒檢測(cè)的準(zhǔn)確度。（4）試劑盒采用磁珠法原理提取樣本核酸，適合儀器自動(dòng)化操作，節(jié)約人力成本，簡(jiǎn)便快速，可在2小時(shí)內(nèi)報(bào)告檢測(cè)結(jié)果。試劑盒的上述特點(diǎn)，均為采用特異性設(shè)計(jì)的低危型hpv引物探針并與熒光pcr技術(shù)組合應(yīng)用而直接引起，獲得的檢測(cè)結(jié)果可以用于判斷臨床尖銳濕疣患者常見(jiàn)低危型hpv感染病情提供參考依據(jù)，對(duì)尖銳濕疣的診斷和早期預(yù)防具有較大的臨床意義。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)技術(shù)常識(shí)對(duì)本發(fā)明作各種技術(shù)性改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。實(shí)施例1：低危型hpv核酸檢測(cè)試劑盒引物探針的設(shè)計(jì)根據(jù)ncbigenbank數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)的各種基因型hpvl1基因序列，采用vectornti、oligo等引物設(shè)計(jì)軟件，擴(kuò)增各低危型hpvl1基因上123～147bp型特異性片段，優(yōu)選獲得的引物探針序列如表1所示。表1設(shè)計(jì)的低危型hpv試劑盒引物探針以上引物探針委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。實(shí)施例2：低危型hpv核酸檢測(cè)試劑盒配制試劑盒擴(kuò)增試劑，即pcr反應(yīng)緩沖液為自行配制，按表2各成分濃度和體積配制32人份試劑盒pcr反應(yīng)緩沖液，配制的反應(yīng)緩沖液每個(gè)反應(yīng)分裝用量為20μl，加入模板10μl后總反應(yīng)體積為30μl。表2試劑盒反應(yīng)緩沖液配制各組分體積組分初始濃度反應(yīng)終濃度（30μl）32人份體積（μl）tris-hcl(ph8.3)1000mm10mm9.6kcl500mm50mm96datp100mm0.2mm1.92dgtp100mm0.2mm1.92dctp100mm0.2mm1.92dutp100mm0.2mm1.92mgcl2100mm3.5mm33.6seqidno:150μm0.3μm5.76seqidno:250μm0.3μm5.76seqidno:350μm0.25μm4.8seqidno:450μm0.25μm4.8seqidno:550μm0.25μm4.8seqidno:650μm0.25μm4.8seqidno:750μm0.25μm4.8seqidno:850μm0.25μm4.8seqidno:950μm0.2μm3.84seqidno:1050μm0.15μm2.88seqidno:1150μm0.2μm3.84seqidno:1250μm0.2μm3.84seqidno:1350μm0.2μm3.84熱啟動(dòng)taq酶5u/μl2u/反應(yīng)12.8ung酶1u/μl0.5u/反應(yīng)16水----405.76總體積----640試劑盒陰性對(duì)照采用生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照為含hpv6、40、42、43型質(zhì)粒大腸桿菌混合菌液，濃度2.0x103copy/ml，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照按照400μl/管分裝。通過(guò)上述配制的低危型hpv核酸檢測(cè)試劑盒，擴(kuò)增試劑與對(duì)照品要求-20℃保存和運(yùn)輸。試劑盒病毒核酸提取試劑采用上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的磁珠法核酸提取試劑盒，它包括裂解緩沖液、磁珠、清洗緩沖液w1和w2、洗脫緩沖液5個(gè)組分，使用時(shí)試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、標(biāo)本均采用該試劑盒提取核酸。試劑盒擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃2min、95℃10min后按照95℃10sec、60℃40sec循環(huán)擴(kuò)增40次，循環(huán)步驟中60℃時(shí)采集fam、joe、rox、cy5四個(gè)波長(zhǎng)熒光信號(hào)。實(shí)施例3：試劑盒檢測(cè)性能指標(biāo)測(cè)定（1）樣品模板準(zhǔn)備分別取試劑盒構(gòu)建的hpv6、40、42、43型質(zhì)粒大腸桿菌，采用生理鹽水10倍連續(xù)梯度稀釋到4x103copy/ml、4x102copy/ml、4x101copy/ml，吸取上述稀釋梯度樣本各5份、以及試劑盒陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各1份，每份樣品體積400μl，采用上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的磁珠法核酸提取試劑盒在核酸提取儀上進(jìn)行核酸提取，每個(gè)樣品取樣體積400μl，提取后獲得核酸各50μl。采用中國(guó)食品藥品檢定研究院人乳頭瘤病毒l1基因分型國(guó)家參考品（批號(hào)360002-201001）評(píng)價(jià)試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確性和特異性，該國(guó)家參考品由30個(gè)經(jīng)過(guò)序列測(cè)定的hpv基因亞型參考品組成，包括hpv6、11、16、18、36、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、70、72、73、81、83，cp8304基因型，其中高危型14種、中危型3種、其余為低危型，可直接作為模板擴(kuò)增，無(wú)需核酸提取。（2）熒光pcr檢測(cè)將實(shí)施例2中試劑盒擴(kuò)增試劑（反應(yīng)緩沖液）從-20℃冰箱取出凍融、混勻、短暫離心，按20μl/人份將反應(yīng)緩沖液分裝到pcr反應(yīng)管中，然后分別加入上述提取的試劑盒陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照、hpv各亞型質(zhì)粒大腸桿菌稀釋梯度樣品提取的模板、以及中國(guó)食品藥品檢定研究院人乳頭瘤病毒l1基因分型參考品各10μl，每個(gè)反應(yīng)管體積為30μl，將上述反應(yīng)管放到abi7500熒光pcr儀上，設(shè)定每個(gè)反應(yīng)管樣本類(lèi)型，按照50℃反應(yīng)2分鐘，然后94℃保溫5分鐘，再按95℃10秒→60℃40秒循環(huán)40次（在60℃采集fam、joe、rox、cy5四個(gè)波長(zhǎng)熒光信號(hào)）的反應(yīng)程序運(yùn)行。擴(kuò)增結(jié)束后按照儀器軟件和試劑盒說(shuō)明書(shū)分析判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）結(jié)果分析觀察熒光pcr儀四個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)ct值結(jié)果，試劑盒對(duì)4x103copy/ml、4x102copy/ml、4x101copy/ml濃度的樣品分別重復(fù)檢測(cè)5次，前兩個(gè)濃度樣品重復(fù)測(cè)定結(jié)果均為陽(yáng)性，而4x101copy/ml濃度樣品中只有1-2個(gè)陽(yáng)性，因此可以確定試劑盒檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到4x102copy/ml。同時(shí)，試劑盒對(duì)人乳頭瘤病毒l1基因分型國(guó)家參考品30個(gè)hpv亞型檢測(cè)結(jié)果中，6、11和44型參考品在fam波長(zhǎng)為陽(yáng)性、其余3個(gè)波長(zhǎng)為陰性；40型參考品在joe波長(zhǎng)陽(yáng)性、其余3個(gè)波長(zhǎng)為陰性；42型參考品在rox波長(zhǎng)為陽(yáng)性、其余3個(gè)波長(zhǎng)為陰性；43型參考品在cy5波長(zhǎng)陽(yáng)性、其余3個(gè)波長(zhǎng)為陰性；而這6個(gè)亞型以外的24個(gè)hpv亞型參考品在四個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說(shuō)明低危型hpv核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)hpv國(guó)家參考品其它基因亞型無(wú)交叉反應(yīng)，試劑盒檢測(cè)準(zhǔn)確性、特異性良好。實(shí)施例4：試劑盒在尖銳濕疣標(biāo)本低危型hpv檢測(cè)中的應(yīng)用（1）樣本核酸提取取臨床收集的尖銳濕疣患者泌尿生殖道分泌物標(biāo)本10個(gè)，與試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照一起采用實(shí)施例3中的磁珠法核酸提取試劑在核酸提取儀上進(jìn)行病毒dna提取，每個(gè)樣品取樣體積400μl，提取后獲得核酸各50μl。（2）熒光pcr檢測(cè)將實(shí)施例2中試劑盒擴(kuò)增試劑（反應(yīng)緩沖液）從-20℃冰箱取出凍融、混勻、短暫離心，按20μl/人份將反應(yīng)緩沖液分裝到pcr反應(yīng)管中，然后分別加入上述提取的試劑盒陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、以及標(biāo)本提取的模板各10μl。每個(gè)反應(yīng)管體積為30μl，將上述反應(yīng)管放到abi7500熒光pcr儀上，設(shè)定每個(gè)反應(yīng)管樣本類(lèi)型，按照50℃反應(yīng)2分鐘，然后94℃保溫5分鐘，再按95℃10秒→60℃40秒循環(huán)40次（在60℃采集fam、joe、rox、cy5四個(gè)波長(zhǎng)熒光信號(hào)）的反應(yīng)程序運(yùn)行。擴(kuò)增結(jié)束后按照儀器軟件和試劑盒說(shuō)明書(shū)分析判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（3）結(jié)果分析采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)10個(gè)尖銳濕疣泌尿生殖道標(biāo)本，從提取到擴(kuò)增耗時(shí)2小時(shí)，結(jié)果顯示10個(gè)標(biāo)本均為hpv6、11、44型陽(yáng)性（fam通道），同時(shí)有42型復(fù)合感染樣本2個(gè)，40和43型復(fù)合感染樣本1個(gè)，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒在臨床尖銳濕疣患者低危型hpv檢測(cè)中具有顯著的實(shí)用價(jià)值。核苷酸序列表sequencelisting<110>上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司吳大治,夏懿,吳梅<120>一種低危型人乳頭瘤病毒核酸檢測(cè)試劑盒<130>lr-hpv<140>cn<141>2015-12-30<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:1<222>(1)..(16)<400>1agatgtggcggcctag16<210>2<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:2<222>(1)..(19)<400>2gtctagaactgctrgcatg19<210>3<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:3<222>(1)..(24)<400>3atgaaaatcaagtatatttaccac24<210>4<211>21<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:4<222>(1)..(21)<400>4gatgtcctatagtcagtaacc21<210>5<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:5<222>(1)..(24)<400>5caactatttaataaaccatattgg24<210>6<211>18<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:6<222>(1)..(18)<400>6tgtatcaccagatgttgc18<210>7<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:7<222>(1)..(19)<400>7ttggcttttcagaaacaac19<210>8<211>20<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:8<222>(1)..(20)<400>8ggttttcagtgtcatcatac20<210>9<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:9<222>(1)..(23)<223>b=fam;d=bhq<400>9bcacagtatatgtgcctcctccd23<210>10<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:10<222>(1)..(19)<223>b=fam;d=bhq<400>10bcgccccagtatccaaagd19<210>11<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:11<222>(1)..(25)<223>b=joeorhexorvic;d=bhq<400>11bacgcctgttgctaccattgttagd25<210>12<211>24<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:12<222>(1)..(24)<223>b=rox;d=bhq<400>12bcaacaagcacaaggacacaatad24<210>13<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>a<220><221>seq_id_no:13<222>(1)..(23)<223>b=cy5;d=bhq<400>13btggttacatcagacactcagcd23當(dāng)前第1頁(yè)12