本發(fā)明涉及一種可同時(shí)檢測(cè)和鑒別口蹄疫病毒(fmdv)、新澤西水泡性口炎病毒(vsv-nj)和印第安型水泡性口炎病毒(vsv-ind)的一步法多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)試劑盒及引物和探針，可實(shí)現(xiàn)一次采樣，一次分析，同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分3種病毒的目的，屬于檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：口蹄疫病毒(fmdv)和水泡性口炎病毒(vsv)是引起牛、羊、豬等多種動(dòng)物感染的病毒性疾病，臨床特征均為口腔粘膜、乳頭皮膚及蹄冠部皮膚出現(xiàn)水泡及糜爛，會(huì)混合感染，臨床癥狀相似，鑒別診斷困難，是危害養(yǎng)殖業(yè)最為嚴(yán)重的幾種病原?？谔阋吆退菪钥谘妆皇澜鐒?dòng)物衛(wèi)生組織(oie)規(guī)定為多種動(dòng)物感染的、跨界傳播病原，也是我國(guó)動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易中重要的檢疫對(duì)象。目前，針對(duì)上述幾種病原建立了多種分子檢測(cè)技術(shù)，如pcr和熒光pcr技術(shù)等，在這些疫病的診斷和防控中發(fā)揮了重要作用。但目前所建立的方法多是針對(duì)一種病原的單目標(biāo)檢測(cè)，在實(shí)際檢測(cè)中需要重復(fù)多次，才能完成檢測(cè)不同病原的目的，檢測(cè)工作量大且時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足大批量動(dòng)物檢疫快速通關(guān)的實(shí)際需要。且難以實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品中大量存在的混合感染以及癥狀相似疫病的鑒別診斷。在建立單目標(biāo)病原檢測(cè)技術(shù)的同時(shí)，各國(guó)獸醫(yī)機(jī)構(gòu)也相繼研制了可同時(shí)檢測(cè)多種病毒的多重pcr，但傳統(tǒng)pcr技術(shù)靈敏度低、結(jié)果不易判定等缺點(diǎn)限制了其在多重檢測(cè)中的應(yīng)用。本研究利用熒光pcr技術(shù)在核酸檢測(cè)方面具有的特異、敏感等特性，建立了fmdv、vsv-nj、vsv-ind三種病毒一步法多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)和鑒別方法并組裝成試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)一次采樣，一次分析，可同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分3種重要病毒的目的，不僅減少了檢測(cè)的工作量和成本，且能在最短的時(shí)間內(nèi)完成疫病的檢測(cè)，為疾病防治贏得時(shí)間。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供特異性強(qiáng)、靈敏度高的同時(shí)檢測(cè)和鑒別口蹄疫病毒(fmdv)、新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)和印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)的多重?zé)晒鈘t-pcr引物和探針。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供快速、準(zhǔn)確、使用方便的同時(shí)檢測(cè)和鑒別口蹄疫病毒(fmdv)、新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)和印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)的一步法多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)試劑盒。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：在序列比對(duì)分析的基礎(chǔ)上，針對(duì)口蹄疫病毒3d基因、新澤西型水泡性口炎病毒l基因和印第安納型水泡性口炎病毒l基因，分別設(shè)計(jì)并篩選出能覆蓋大部分分離株(特別是口蹄疫的引物和探針能夠?qū)崿F(xiàn)7個(gè)血清型通用檢測(cè))，又適合多重檢測(cè)并能進(jìn)行鑒別的引物和探針(序列見(jiàn)表1)?？谔阋卟《?fmdv)各血清型通用檢測(cè)引物對(duì)由2條正向引物、3條反向引物和2條探針組成，新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)引物對(duì)由2條正向引物、1條反向引物和1條探針組成，印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)引物對(duì)由1條正向引物、1條反向引物和1條探針組成，多重反應(yīng)體系中引物混合物是這10條引物組成的混合物，探針是這4條探針組成的混合物，經(jīng)過(guò)一步法多重?zé)晒鈘t-pcr反應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)三種病原的同時(shí)檢測(cè)和鑒別。表1口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒(包括新澤西型和印第安納型)的一步法多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)引物和探針注：胞嘧啶(c)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、腺嘌呤(a)、胸腺嘧啶(t)。簡(jiǎn)并堿基w代表a或t。探針5‘端標(biāo)記有發(fā)光集團(tuán)，探針3‘端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)。我們采用多重?zé)晒鈖cr技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)和鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒(包括新澤西型和印第安納型)的檢測(cè)方法并組裝了試劑盒。檢測(cè)和鑒別口蹄疫病毒、新澤西型水泡性口炎病毒和印第安納型水泡性口炎病毒的一步法多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)試劑盒，包括上述多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)引物和探針。進(jìn)一步地，該試劑盒還包括完成多重?zé)晒鈘t-pcr反應(yīng)所需的材料和試劑，例如，反應(yīng)緩沖液、酶、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照等。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述反應(yīng)液為multiplexrt-pcr反應(yīng)緩沖液；所述酶為multiplex酶；所述陰性對(duì)照為無(wú)核酸滅菌水；所述陽(yáng)性對(duì)照分別為口蹄疫病毒(fmdv)3d基因、新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)l基因、印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)l基因的體外反轉(zhuǎn)錄crna。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)和鑒別口蹄疫病毒、新澤西型水泡性口炎病毒、印第安納型水泡性口炎病毒的一步法多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)方法，包括如下步驟：(1)提取病毒總核酸；(2)配制rt-pcr反應(yīng)體系，其中，所述反應(yīng)體系中包含上述的多重?zé)晒鈘t-pcr引物和探針；(3)進(jìn)行一步法多重?zé)晒鈘t-pcr反應(yīng)；(4)結(jié)果判定；①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照均有s形擴(kuò)增曲線，ct值大約在20左右，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。滿足此條件，視為此次試驗(yàn)有效。②結(jié)果判斷：有擴(kuò)增曲線，且ct值在30以下的判定為陽(yáng)性；有擴(kuò)增曲線，但30<ct值<35的，屬于疑似區(qū)間，需要重新確認(rèn)；沒(méi)有擴(kuò)增曲線或者ct值大于35的，判定為陰性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1)多重性：可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分口蹄疫病毒、新澤西型水泡性口炎病毒和印第安納型水泡性口炎病毒，節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間和成本，有利于疫病特別是混合感染的及時(shí)確診。2)靈敏：此多重?zé)晒鈘t-pcr體系可以同時(shí)檢測(cè)三種病原，其特異性與單個(gè)熒光rt-pcr相當(dāng)。3)特異：設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)充分考慮了病原之間可能存在的干擾，經(jīng)過(guò)篩選保證了引物和探針的特異性和排他性。3)涵蓋性和通用性好：本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物和探針都分別針對(duì)口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒最保守的基因設(shè)計(jì)，對(duì)于每個(gè)病毒，其引物和探針都是多條，而且包含了簡(jiǎn)并引物，基本上覆蓋了genebank中現(xiàn)有該種病毒的所有序列?？谔阋卟《緳z測(cè)引物和探針包含了口蹄疫病毒的7個(gè)血清型，可以實(shí)現(xiàn)通用檢測(cè)，水泡性口炎病毒則可以對(duì)新澤西型和印第安納型2個(gè)血清型進(jìn)行鑒別和區(qū)分?？梢詫?shí)現(xiàn)每種病毒不同亞型或血清型之間的通用檢測(cè)。4)簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化：所有引物和探針的設(shè)計(jì)都是從可以進(jìn)行多重檢測(cè)考慮，不管是dna或rna病毒，都可以使用該一步法程序，省卻了反轉(zhuǎn)錄過(guò)程，省時(shí)省力。附圖說(shuō)明圖1：fmdv單熒光rt-pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2：vsv-nj單熒光rt-pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3：vsv-ind單熒光rt-pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4：fmdv,vsv-nj和vsv-ind多重?zé)晒鈘t-pcr標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5：fmdv單熒光rt-pcr與多重?zé)晒鈘t-pcr的比較。圖6：vsv-nj單熒光rt-pcr與多重?zé)晒鈘t-pcr的比較。圖7：vsv-ind單熒光rt-pcr與多重?zé)晒鈘t-pcr的比較。具體實(shí)施方式為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購(gòu)買得到。實(shí)施例1試劑盒的組成和使用1.試劑盒的配制組成表2試劑盒的組成其中2×multiplexrt-pcr緩沖液和multiplex酶購(gòu)自ab公司產(chǎn)品path-idtmmultiplexone-steprt-pcrkit。引物混合物包括fmdv的2條正向引物、3條反向引物，vsv-nj的2條正向引物、1條反向引物以及vsv-ind的1條正向引物和1條反向引物，引物序列如表1，混合引物的工作濃度為400nm，引物委托大連寶生物公司合成。fmdv探針混合物包括fmdv的2條探針、vsv-nj和vsv-ind分別有1條探針，探針序列如表1，濃度分別為200nm，探針委托大連寶生物公司合成。陰性對(duì)照為無(wú)核酸滅菌水。fmdv陽(yáng)性對(duì)照為口蹄疫病毒(fmdv)3d基因的體外反轉(zhuǎn)錄crna；vsv-nj陽(yáng)性對(duì)照為新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)l基因的體外反轉(zhuǎn)錄crna；vsv-ind陽(yáng)性對(duì)照為印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)l基因的體外反轉(zhuǎn)錄crna?？谔阋卟《?fmdv)3d基因體外轉(zhuǎn)錄rna的制備：回收o型口蹄疫病毒3d基因的rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度1410bp，與pgem-t載體(購(gòu)自promega公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒dna，經(jīng)pcr和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pgem-fmdv-3d。以純化的質(zhì)粒為模板，將質(zhì)粒線性化之后，用promega公司的ribomaxtmlargescalernaproductionsystem-t7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用dnase除去其中的dna模板后經(jīng)trizol提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到口蹄疫病毒3d基因的體外轉(zhuǎn)錄rna，命名為fmdv-3d-crna；口蹄疫病毒3d基因序列如序列表中seqidno：15所示。新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)l基因體外轉(zhuǎn)錄rna的制備：回收新澤西型水泡性口炎病毒l基因的rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度為500bp，與pgem-t載體(購(gòu)自promega公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒dna，經(jīng)pcr和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pgem-vsv-nj-l。以純化的質(zhì)粒為模板，將質(zhì)粒線性化之后，用promega公司的ribomaxtmlargescalernaproductionsystem-t7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用dnase除去其中的dna模板后經(jīng)trizol提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到新澤西型水泡性口炎病毒l基因的體外轉(zhuǎn)錄rna，命名為vsv-nj-l-crna；新澤西型水泡性口炎病毒l基因序列如序列表中seqidno：16所示。印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)l基因體外轉(zhuǎn)錄rna的制備：回收印第安納型水泡性口炎病毒l基因的rt-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度為500bp，與pgem-t載體(購(gòu)自promega公司)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化jm109感受態(tài)細(xì)胞，堿裂解法提取質(zhì)粒dna，經(jīng)pcr和酶切鑒定后獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pgem-vsv-ind-l。以純化的質(zhì)粒為模板，將質(zhì)粒線性化之后，用promega公司的ribomaxtmlargescalernaproductionsystem-t7試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；將體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用dnase除去其中的dna模板后經(jīng)trizol提取后進(jìn)行測(cè)定后，即得到印第安納型水泡性口炎病毒l基因的體外轉(zhuǎn)錄rna，命名為vsv-ind-l-crna；印第安納型水泡性口炎病毒l基因序列如序列表中seqidno：17所示。2.試劑盒的使用方法1)病毒總核酸(rna/dna)的提取病毒核酸的提取采用病毒基因組dna/rna提取試劑盒(tianampvirusdna/rnakit)，步驟如下：carrierrna溶液的配制：(1)carrierrna儲(chǔ)存液：向裝有310μgcarrierrna凍干粉的管子中加入310μlrnase-freeddh2o，將carrierrna徹底溶解，得到終濃度為1μg/μl的溶液，并分裝、置于-20℃儲(chǔ)存。(2)carrierrna工作液：根據(jù)樣品的數(shù)量計(jì)算所需緩沖液gb和carrierrna溶液的體積(計(jì)算公式如下)，將緩沖液gb與carrierrna溶液顛倒混勻，即得到carrierrna工作液；為避免溶液出現(xiàn)起泡現(xiàn)象，請(qǐng)勿使用渦旋振蕩。計(jì)算公式：n×0.22ml＝y(tǒng)mlyml×28μl/ml＝zμl式中n＝同時(shí)提取的樣品個(gè)數(shù)，y＝需要加入緩沖液gb的體積，z＝需要加入carrierrna溶液的體積。操作步驟：(1)用移液器將20μlproteinasek加入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。(2)向離心管中加入200μl血漿/血清/淋巴液或25mg磨碎的組織(樣品需平衡至室溫)，如果樣本體積小于200μl，可加入0.9％nacl溶液補(bǔ)充。(3)加入200μlcarrierrna工作液，蓋上管蓋，渦旋振蕩15sec混勻。(4)56℃孵育15min，簡(jiǎn)短離心以收集附著在管壁及管蓋的液體。(5)加入250μl無(wú)水乙醇，渦旋振蕩15sec，徹底混勻，在室溫(15-25℃)放置5min。(6)簡(jiǎn)短離心，以收集附著在管壁及管蓋的液體。(7)將離心管中的溶液和絮狀沉淀全部轉(zhuǎn)移至rnase-free吸附柱cr2(吸附柱放在收集管中)，蓋上管蓋，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。(8)小心打開(kāi)吸附柱蓋子，加入500μl溶液gd(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，蓋上管蓋，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。(9)小心打開(kāi)吸附柱蓋子，加入600μl溶液pw(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，蓋上管蓋，靜置2min，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。(10)重復(fù)步驟(9)。(11)小心打開(kāi)吸附柱蓋子，加入500μl無(wú)水乙醇，蓋上管蓋，8,000rpm(～6,000×g)離心1min，棄廢液。(12)將吸附柱放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)離心3min，使吸附膜完全變干，棄廢液。(13)將吸附柱放入一個(gè)新的rnase-free離心管(1.5ml)中，小心打開(kāi)吸附柱的蓋子，室溫放置3min，使吸附膜完全變干。向吸附膜的中間部位懸空滴加20-150μlrnase-freeddh2o，蓋上蓋子，室溫放置5min。(14)12,000rpm(～13,400×g)離心1min，收集到的即為病毒總核酸(dna或rna)。2)熒光rt-pcr檢測(cè)分別取檢測(cè)樣品、陽(yáng)陰性對(duì)照，按照下表3配制反應(yīng)體系：表3一步法多重?zé)晒鈘t-pcr反應(yīng)體系：總體積20ul將混合液充分混合后，最后加入模板，簡(jiǎn)短離心，按照下列反應(yīng)程序，進(jìn)行一步法熒光rt-pcr反應(yīng)，見(jiàn)表4：表4多重?zé)晒鈘t-pcr反應(yīng)程序3)結(jié)果描述及判定①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性對(duì)照均有s形擴(kuò)增曲線，ct值大約在20左右，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。滿足此條件，視為此次試驗(yàn)有效。②結(jié)果判斷：有擴(kuò)增曲線，且ct值在30以下的判定為陽(yáng)性；有擴(kuò)增曲線，但30<ct值<35的，屬于疑似區(qū)間，需要重新確認(rèn)；沒(méi)有擴(kuò)增曲線或者ct值大于35的，判定為陰性。實(shí)施例2、試劑盒的敏感性試驗(yàn)1、材料口蹄疫病毒、水泡性口炎病毒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。2、方法1)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的制備如實(shí)施例1所述的方法。2)標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定取制備好的體外轉(zhuǎn)錄crna用無(wú)rna酶的滅菌水分別作200倍稀釋，用紫外分光儀測(cè)定其260nm和280nm的吸光度值(od260和od280)，計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。純r(jià)na：1.7＜o(jì)d260/od280＜2.0(＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存)。rna樣品的濃度(μg/μl)：od260×稀釋倍數(shù)×40/1000，并按以下公式計(jì)算拷貝數(shù)(copies/μl)：標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：將fmdv體外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光rt-pcr，用模板濃度倒數(shù)與對(duì)應(yīng)的熒光ct值做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，pcr擴(kuò)增效率e值、相關(guān)系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明擴(kuò)增效率良好。見(jiàn)圖1。將vsv-nj體外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光rt-pcr，用模板濃度倒數(shù)與對(duì)應(yīng)的熒光ct值做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，pcr擴(kuò)增效率e值、相關(guān)系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明擴(kuò)增效率良好。見(jiàn)圖2。將vsv-ind體外標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光rt-pcr，用模板濃度倒數(shù)與對(duì)應(yīng)的熒光ct值做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，pcr擴(kuò)增效率e值、相關(guān)系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明擴(kuò)增效率良好。見(jiàn)圖3。將fmdv、vsv-nj和vsv-ind體外標(biāo)準(zhǔn)品等量混合后，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，進(jìn)行多重?zé)晒鈘t-pcr，用模板濃度倒數(shù)與對(duì)應(yīng)的熒光ct值做濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，pcr擴(kuò)增效率e值、相關(guān)系數(shù)r2值和曲線斜率slope值都落在可接受范圍內(nèi)，說(shuō)明多重pcr之間沒(méi)有互相干擾，擴(kuò)增效率良好。見(jiàn)圖4。3)一步法多重?zé)晒鈘t-pcr方法檢測(cè)極限的確定將上述定量的rna溶液調(diào)整為濃度大致相當(dāng)，每種各取10μl，充分混勻后，制成陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。將該標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋后，按最佳條件進(jìn)行熒光rt-pcr檢測(cè)，最高稀釋倍數(shù)所能檢測(cè)出的ct值所對(duì)應(yīng)的的濃度即為最低檢測(cè)限。3、結(jié)果1)rna溶液拷貝數(shù)測(cè)定結(jié)果將制備好的體外轉(zhuǎn)錄rna，分別用紫外分光儀測(cè)定其260nm和280nm的吸光度值并推算出拷貝數(shù)，詳見(jiàn)下表5。表5rna純度及含量測(cè)定2)多重?zé)晒鈘t-pcr方法檢測(cè)限的確定利用建立的多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)方法，對(duì)10倍系列稀釋的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果該方法可穩(wěn)定檢測(cè)到的最高ct值為35，所對(duì)應(yīng)的的標(biāo)準(zhǔn)品濃度達(dá)到1-10拷貝數(shù)/反應(yīng)。實(shí)施例3、試劑盒的特異性試驗(yàn)1材料本試驗(yàn)中所用到的病毒如表6。表6特異性試驗(yàn)研究過(guò)程中應(yīng)用到的病毒和核酸病毒來(lái)源口蹄疫病毒(fmdv)本實(shí)驗(yàn)室保存印第安納型水泡性口炎病毒(vsv-ind)本實(shí)驗(yàn)室保存新澤西型水泡性口炎病毒(vsv-nj)本實(shí)驗(yàn)室保存牛地方流行性白血病病毒(bvdv)本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)慰袢《颈緦?shí)驗(yàn)室保存藍(lán)舌病病毒(btv)本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)魅拘晕改c炎病毒(tgev)本實(shí)驗(yàn)室保存2、方法2.1分別用口蹄疫病毒、新澤西型水泡性口炎病毒和印第安納型口蹄疫病毒的引物和探針對(duì)表格中的其他6種病毒核酸進(jìn)行熒光rt-pcr檢測(cè)，以驗(yàn)證引物和探針的特異性。2.2利用建立的多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)方法對(duì)表格中的7種病毒進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證多重?zé)晒鈘t-pcr方法的特異性。2.3進(jìn)行單熒光rt-pcr與多重?zé)晒鈘t-pcr的比較。3、結(jié)果3.1每種病毒的引物和探針只能從自己的病毒核酸中擴(kuò)增出曲線，其他病毒模板的擴(kuò)增均為陰性，表明所設(shè)計(jì)的引物和探針特異性良好。3.2利用建立的多重?zé)晒鈘t-pcr方法對(duì)表格6中的病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果口蹄疫病毒、新澤西型水泡性口炎病毒、印第安納型水泡性口炎病毒有擴(kuò)增曲線，其它病毒均無(wú)特異性的擴(kuò)增信號(hào)，表明所建立的方法特異性良好。表7特異性檢測(cè)結(jié)果3.3將fmdv、vsv-nj和vsv-ind體外標(biāo)準(zhǔn)品等量混合后，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行多重?zé)晒鈘t-pcr和fmdv單熒光pcr，將相同模板濃度對(duì)應(yīng)的熒光ct值進(jìn)行比較，求解回歸方程，二者之間相關(guān)系數(shù)r2值達(dá)到了0.9995，說(shuō)明單熒光rt-pcr和多重?zé)晒鈘t-pcr之間符合性良好，多重?zé)晒鈘t-pcr沒(méi)有產(chǎn)生干擾，沒(méi)有影響擴(kuò)增效率。見(jiàn)圖5。將fmdv、vsv-nj和vsv-ind體外標(biāo)準(zhǔn)品等量混合后，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行多重?zé)晒鈘t-pcr和vsv-nj單熒光pcr，將相同模板濃度對(duì)應(yīng)的熒光ct值進(jìn)行比較，求解回歸方程，二者之間相關(guān)系數(shù)r2值達(dá)到了0.9998，說(shuō)明單熒光rt-pcr和多重?zé)晒鈘t-pcr之間符合性良好，多重?zé)晒鈘t-pcr沒(méi)有產(chǎn)生干擾，沒(méi)有影響擴(kuò)增效率。見(jiàn)圖6。將fmdv、vsv-nj和vsv-ind體外標(biāo)準(zhǔn)品等量混合后，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別進(jìn)行多重?zé)晒鈘t-pcr和vsv-ind單熒光pcr，將相同模板濃度對(duì)應(yīng)的熒光ct值進(jìn)行比較，求解回歸方程，二者之間相關(guān)系數(shù)r2值達(dá)到了0.9994，說(shuō)明單熒光rt-pcr和多重?zé)晒鈘t-pcr之間符合性良好，多重?zé)晒鈘t-pcr沒(méi)有產(chǎn)生干擾，沒(méi)有影響擴(kuò)增效率。見(jiàn)圖7。實(shí)施例4：試劑盒對(duì)臨床樣品檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、材料實(shí)驗(yàn)室收集的已知fmdv陽(yáng)性樣品23份、vsv-nj陽(yáng)性樣品2份、vsv-ind陽(yáng)性樣品3份、bvdv陽(yáng)性樣品10份、tgev陽(yáng)性樣品13份及其他未知樣品35份。2、方法對(duì)上述樣品進(jìn)行多重?zé)晒鈘t-pcr檢測(cè)，用實(shí)際樣品驗(yàn)證方法的敏感性和特異性。3、結(jié)果臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果如表8。由表8可知，23份已知fmdv陽(yáng)性樣品、已知的2份vsv-nj陽(yáng)性樣品及3份vsv-ind陽(yáng)性樣品的檢測(cè)均為陽(yáng)性，符合率100％。而從已知的10份bvdv陽(yáng)性樣品中檢測(cè)出1份fmdv陽(yáng)性，從已知的13份tgev陽(yáng)性樣品中檢測(cè)到2份fmdv陽(yáng)性，這說(shuō)明原來(lái)只檢測(cè)bvdv和tgev的樣品實(shí)際上也存在fmdv的混合感染；另外，隨機(jī)選取了35份臨床樣品進(jìn)行篩查，檢測(cè)到1份fmdv陽(yáng)性。這表明該多重?zé)晒鈘t-pcr方法可以發(fā)現(xiàn)原來(lái)靠單一熒光rt-pcr沒(méi)有進(jìn)行篩查的非目標(biāo)病原，檢出了混合感染，避免了漏檢。表8臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。sequencelisting<110>北京出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心<120>一種能同時(shí)檢測(cè)和鑒別口蹄疫和水泡性口炎的檢測(cè)試劑盒及引物和探針<130><160>17<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工合成引物<400>1actgggttttacaaacctgtgatg24<210>2<211>25<212>dna<213>人工合成引物<400>2ctgggttttataaacctgtgatggc25<210>3<211>21<212>dna<213>人工合成引物<400>3ccacggagatcaacttctcct21<210>4<211>22<212>dna<213>人工合成引物<400>4tgccacagagatcaacttctcc22<210>5<211>22<212>dna<213>人工合成引物<400>5ccacggaaatcaacttctcctg22<210>6<211>19<212>dna<213>人工合成探針<400>6tctcctttgcacgccgtgg19<210>7<211>21<212>dna<213>人工合成探針<400>7tcctctcctttgcacgtcgtg21<210>8<211>21<212>dna<213>人工合成引物<400>8gctctttatgcatgaccctgc21<210>9<211>22<212>dna<213>人工合成引物<400>9tgctttttatgcatgacccwgc22<210>10<211>20<212>dna<213>人工合成引物<400>10cgagacaacgccataccaca20<210>11<211>24<212>dna<213>人工合成探針<400>11ctggtttgcacaccagaacattca24<210>12<211>22<212>dna<213>人工合成引物<400>12tgatgatgcatgatccwgctct22<210>13<211>21<212>dna<213>人工合成引物<400>13acacwcctccaatggaagggt21<210>14<211>21<212>dna<213>人工合成探針<400>14accgggcttgcacagttctac21<210>15<211>1410<212>dna<213>口蹄疫病毒3d基因序列<400>15gggttgatcgttgacaccagagatgtggaggaacgcgtccacgtgatgcgcaaaaccaag60ctcgcgcccaccgtggcacacggtgtgttcaaccctgaattcgggcctgctgctctgtcc120aacaaggacccgcgcctgaaagaaggggtcgtccttgacgacgtcattttctcgaaacac180aagggagatacaaggatgtctgaggaagacaaagcgctgttccggcgctgtgctgccgac240tacgcgtcgcgcctacacagcgtgctagggacggcaaacgccccactgagtgtatacgaa300gccatcaaaggcgtcgacggacttgacgccatggagccagacaccgcacccggtctcccc360tgggctctccagggaaaacgccgaggtgccctgatcgacttcgaaaacggtactgtcggg420cccgaggttgaagcagcactcaagctcatggaaagccgtgggtacaaattcgtctgccaa480acctttctgaaagacgaaattcggccgctagagaaggtgcgcgccggcaagacgcgcatt540gtcgacgttttgcctgtagaacacattctctataccagaatgatgattggtagattctgt600gctcagatgcactcaaacaacggaccgcaaattggctcagcggtcggttgtaaccctgac660gttgattggcaaagatttggcacacatttcgctcagtacaagaacgtgtgggatgtggac720tactcagccttcgatgcaaaccactgcagcgatgcgatgaacatcatgttcgaagaggtg780ttccgcacggagtttgggttccacccgaatgccgagtggattctgaagactctggttaac840acggagcacgcttacgagaacaagcgcatcactgtggaaggtgggatgccgtccggttgt900tccgcaacaagtatcatcaacacaattttgaacaacatctacgtgctctacgctctgcgt960aggcactatgagggagttgagctggacacctacaccatgatctcctatggagacgacatc1020gtggtggcaagtgactacgacctggactttgaggctctcaagccccacttcaagtccctc1080ggtcagaccatcactccagccgacaaaagcgacaaaggttttgttcttggtcactccata1140actgatgtcactttcctcaaaagacacttccacatggactacggaactgggttttacaaa1200cctgtgatggcctcgaagaccctcgaggctatcctctcctttgcacgccgtgggaccata1260caggagaagttgatctccgtggcaggactcgccgtccactccggacctgacgagtaccgg1320cgtctctttgagcctttccaaggtctcttcgagattccaagctacagatcactttacctg1380cgatgggtgaacgccgtgtgcggtaatcac1410<210>16<211>500<212>dna<213>新澤西型水泡性口炎病毒l基因序列<400>16gcgagtgacatgtgttacaaatgatcaaattccgacatgtgccaatttgatgtcttcagt60ctctaccaacgcattaactgttgctcattttgcagaaaaccccataaacgcaatgattca120atataattattttgggacctttgctcgattattgctctttatgcatgaccctgcaataag180acattctctgtatacagtccaggaaaagatacctggtttgcacaccagaacattcaaata240tgctgtgttatatctagatccttcaatcggaggggtgtgtggtatggcgttgtctcgatt300cttaatcagagcatttccagatccagtaacagagagcctttcattctggaaatttattta360tgaacatgcctctgagcctcatcttaaaaagatggctgtaatgtttggggaccctccaat420tgccaaattcagaatagagcatatcaataagttattagaggaccccacctctttaaacat480ctcaatggggatgagccctg500<210>17<211>500<212>dna<213>印第安納型水泡性口炎病毒l基因序列<400>17aattatggaaaaataccgattttccgtggagtgattagagggttagagaccaagagatgg60tcacgagtgacttgtgtcaccaatgaccaaatacccacttgtgctaatataatgagctca120gtttccacaaatgctctcaccgtagctcattttgctgagaacccaatcaatgccatgata180cagtacaattattttgggacatttgctagactcttgttgatgatgcatgatcctgctctt240cgtcaatcattgtatgaagttcaagataagataccgggcttgcacagttctactttcaaa300tacgccatgttgtatttggacccttccattggaggagtgtcgggcatgtctttgtccagg360tttttgattagagccttcccagatcccgtaacagaaagtctctcattctggagattcatc420catgtacatgctcgaagtgagcatctgaaggagatgagtgcagtatttggaaaccccgag480atagccaagtttcgaataac500當(dāng)前第1頁(yè)12