本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的引物對、探針、試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

大鼠疑似泰勒氏病毒(Rat Theiler's-like virus,TLV)，TLV屬于小RNA病毒科心病毒屬成員，代表株為NGS910，基因組大小為8.021kb。其L基因的開放性閱讀框(ORF)與泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒(Theiler’s murine encephalomyelitis virus,TMEV)有72％同源，與腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)同源性為55％～56％。TLV主要侵害大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)，多數(shù)呈隱性感染，有時表現(xiàn)腦脊髓炎、腦膜炎和后肢麻痹等癥狀。一旦污染了TLV，將會對實驗大鼠及其生物技術(shù)產(chǎn)品造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

巴西JC Jo等1995-2012年收集的樣品中TLV抗體陽性率為9％，為第二常見病毒。2000-2003年的檢測數(shù)據(jù)顯示：TLV陽性率在2.3％，僅次于細(xì)小病毒。王翠娥等(2014)利用血清學(xué)檢測和免疫熒光試驗(IFA)發(fā)現(xiàn)：國標(biāo)SPF登記要求檢測范圍以外的TLV、K病毒、大鼠呼吸道病毒(RRV)等出現(xiàn)陽性。有此可見，TLV是非常重要的待檢病原。在國內(nèi)該病的研究亦幾乎處于空白。

目前，國際上常用的TLV檢測方法是血清學(xué)檢測，其中大鼠的采血，血清分離都是特別繁瑣和耗時，且現(xiàn)如今市場上有的大鼠疑似泰勒氏病毒感染檢測ELISA試劑盒，大部分為進(jìn)口試劑盒，價格都在2000-3000元左右，而且僅可以檢測96乘以2個樣。因此，傳統(tǒng)的方法存在著繁瑣、局限性、靈敏度低、價格高等不足，急需開發(fā)一種簡便、快速、準(zhǔn)確檢測TLV的方法和試劑盒產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的引物對、探針、試劑盒及方法，該試劑盒及方法能快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異地對TLV病毒進(jìn)行檢測。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):

在本發(fā)明的一個方面，提供了一種熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的引物對，所述引物對具有如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的堿基序列。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的探針，所述探針具有如SEQ ID No:3所示的堿基序列。

優(yōu)選的，所述探針的5’結(jié)合有FAM，所述探針的3’結(jié)合有BHQ1。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的試劑盒，所述試劑盒包括如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示的引物對、以及SEQ ID No:3所示的探針。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括：含有大鼠疑似泰勒氏病毒TLV NGS910毒株SEQ ID No:4所示部分基因序列的陽性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的方法，包括以下步驟：以大鼠腦組織的cDNA為模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2為引物，SEQ ID No:3為探針，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，采集熒光信號。

在其中一些實施例中，所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq 10μL、ROX Reference Dye II 0.2μL、cDNA模板2μL、SEQ ID No:1引物0.4μL、SEQ ID No:2引物0.4μL、SEQ ID No:3探針0.8μL、加滅菌蒸餾水至20μL。

在其中一些實施例中，所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，40個循環(huán)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明通過設(shè)計出特異性的引物對和探針，優(yōu)化熒光定量RT-PCR檢測方法的反應(yīng)條件，從而快速、準(zhǔn)確、特異性地針對大鼠疑似泰勒氏病毒(TLV)進(jìn)行檢測，不僅可以實現(xiàn)對實驗大鼠的大樣本篩查，也可以對細(xì)胞系和生物原材料進(jìn)行外源因子檢測；

2、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法只需收集能提取到微量的cDNA的組織即可，且僅需要合成引物對，探針，便可方便快捷的檢測幾千個樣本，便捷廉價；

3、本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢測方法的最低可檢測模板濃度為30拷貝/μL，約100fg DNA，比常規(guī)的PCR方法高出近100倍，其它常見的大鼠病毒株均無特異性擴(kuò)增，沒發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1％，說明本發(fā)明的檢測方法和試劑盒靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1是本發(fā)明實施例1的普通PCR檢測結(jié)果圖；

圖2是本發(fā)明實施例1的TLV TaqMan熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔點(diǎn)曲線圖；

圖3是本發(fā)明實施例2的TLV TaqMan探針qPCR動力學(xué)曲線圖；

圖4是本發(fā)明實施例3的TLV Taqman熒光定量PCR檢測方法的特異性結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明實施例4臨床樣品檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南》(薩姆布魯克J，拉塞爾D W，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.分子克隆實驗指南，第3版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。

實施例1大鼠疑似泰勒氏病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立

1.引物和探針的設(shè)計

根據(jù)大鼠疑似泰勒氏病毒TLV NGS910毒株的全基因組序列(Genbank登錄號為：AB090161.1)，選取3622～3729nt這一段特異區(qū)域序列：ggctttggatacaagggaacacttcagtggctgtgagagttaggtataagaaaatgaaagttttctgtccccgtcccactctcttccttccttggccctcgaccaccactaccagaatccatgcagataacccagtgt(SEQ ID NO：4)。

與pUC57載體連接，構(gòu)建TLV的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

在3622～3729nt處設(shè)計引物和TaqMan特異性探針：

qTLV-F:5’-CTTCAGTGGCTGTGAGAGTTAG-3’(SEQ ID NO：1)；

qTLV-R:5’-ATCTGCATGGATTCTGGTAGTG-3’(SEQ ID NO：2)；

FAM-TLV:5’-FAM-CCGTCCCACTCTCTTCCTTCCTTG-3’-BHQ1(SEQ ID NO：3)。

2.pUC-TLV108質(zhì)粒合成及普通PCR結(jié)果

送GENEWIZ公司合成獲得的pUC-TLV108質(zhì)粒，以10倍倍比稀釋，最終濃度分別在3×10⁶～3×10⁰拷貝數(shù)/μL，利用qTLV-F和qTLV-R引物PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示，普通PCR最低可以檢測到3×10³拷貝數(shù)/μL。圖1中，1-6號孔：模板濃度依次為3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹拷貝數(shù)。

3.熒光定量PCR反應(yīng)體系

熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μL，其中：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)使用量為10μL，ROX Reference Dye II(50×)使用量為0.2μL，模板使用量2μL，qTLV-F、qTLV-R上、下游引物(10μmol/L)各0.4μL，F(xiàn)AM-TLV探針(10μmol/L)0.8μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足20μL。

反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，并采集熒光40個循環(huán)。

4.熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將構(gòu)建的pUC-TLV108質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10倍倍比稀釋，最終濃度分別在3×10⁷～3×10⁰拷貝數(shù)/μL，進(jìn)行TLV染料法SYBR Green I熒光定量PCR，同時進(jìn)行熔點(diǎn)曲線分析，由圖2B的熔點(diǎn)曲線顯示，單一峰，無非特異性熒光，說明擴(kuò)增產(chǎn)物中無引物二聚體，本發(fā)明設(shè)計的引物是特異的，且退火溫度合適。

隨后，根據(jù)上述反應(yīng)條件進(jìn)行TLV探針法TaqMan熒光定量PCR，起始模板濃度的對數(shù)值和相應(yīng)的Ct值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2A)，結(jié)果顯示：相關(guān)系數(shù)R²＝0.9994，這表明不同梯度定量模板的對數(shù)值與Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線直線性好。擴(kuò)增效率E＝2.1826，這表明了該熒光定量PCR的擴(kuò)增處于理想狀態(tài)。

實施例2靈敏度與重復(fù)性檢測

以pUC-TLV108質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，按3×10⁷～3×10⁰拷貝數(shù)/μL倍比稀釋，分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，Ct值大于35視為陰性。繪制不同濃度的模板下三組樣品的擴(kuò)增曲線。結(jié)果顯示：該方法具有很高的靈敏度，最低可檢測模板濃度為30拷貝/μL(圖3)，約100fg DNA，比普通PCR方法高100倍。圖3中，1-8號對應(yīng)模板拷貝數(shù)依次分別為：3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹、3×10⁰；9.陰性對照。

以pUC-TLV108質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中的3×10⁶和3×10⁴拷貝數(shù)/μL兩個稀釋度的DNA作為模板，對這兩個稀釋度在不同時間段進(jìn)行2次重復(fù)測定，每次對同一模板同時進(jìn)行3次重復(fù)測定及設(shè)置3個重復(fù)孔，按照上述的擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行實時熒光定量PCR。結(jié)果表明：批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于1％，說明建立的TLV熒光定量PCR方法具有較好的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定可靠(表1)。

表1.TLV Taqman熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

實施例3大鼠疑似泰勒氏病毒實時熒光定量PCR方法的特異性實驗

用于特異性檢測的所有模板cDNA濃度統(tǒng)一稀釋為50ng/μL，反應(yīng)條件和反應(yīng)體系均參照上述實施例1方法進(jìn)行。結(jié)果見圖4：通過建立的TLV TaqMan熒光定量PCR檢測方法，分別對大鼠細(xì)小病毒KRV株、大鼠細(xì)小病毒H1株、仙臺病毒和鼠痘病毒進(jìn)行檢測，除標(biāo)準(zhǔn)品有陽性擴(kuò)增曲線外，其他病毒均沒有擴(kuò)增曲線。這說明該方法與待檢的其他大鼠病毒病原體無交叉反應(yīng)(圖4)。

實施例4采用本發(fā)明建立的大鼠疑似泰勒氏病毒的TaqMan實時熒光定量PCR方法檢測大鼠疑似泰勒氏病毒

采集62份來自上海實驗動物研究所的大鼠腦樣品病料，利用已經(jīng)建立的TLV Taqman熒光定量PCR檢測方法檢測。實驗具體步驟為：

1.取部分大鼠的腦腦樣品病料，加PBS加鋼珠放入震蕩器中震蕩1min左右，離心4000rpm，2min，吸去上清提取RNA。RNA提取方法參照TIANamp Virus RNA Kit提取盒說明書。

2.提取的核酸RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA:模板為提取的病毒RNA，引物為OligdT18，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系(40μL)為RNA模板20μL，引物2μL，5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 8μL，d NTP(10mmol/L)4μL，Ribonuclease Inhibitor(40U/μL)1μL，Prime Script反轉(zhuǎn)錄酶(200U)1μL，DEPC水4μL。42℃水浴1h，70℃水浴10min，冰浴4min。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.運(yùn)用本發(fā)明實施例1設(shè)計的引物和探針，進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR檢測。熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20μL，其中：Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2×)使用量為10μL，ROX Reference Dye II(50×)使用量為0.2μL，cDNA模板使用量2μL，qTLV-F、qTLV-R上、下游引物(10μmol/L)各0.4μL，F(xiàn)AM-TLV探針(10μmol/L)0.8μL，用滅菌蒸餾水補(bǔ)足20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30sec；95℃變性5sec，60℃退火延伸34sec，并采集熒光40個循環(huán)。檢測結(jié)果見圖4

4.檢測結(jié)果見圖5，沒有特意擴(kuò)增和Ct值大于35的均視為陰性，由圖5可知，所有62份大鼠樣品無陽性擴(kuò)增曲線，說明上海實驗動物研究所送檢的62份大鼠中均無TLV的感染。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

序 列 表

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所

<120> 熒光定量RT-PCR檢測大鼠疑似泰勒氏病毒的引物對、探針、試劑盒及方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cttcagtggc tgtgagagtt ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atctgcatgg attctggtag tg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccgtcccact ctcttccttc cttg 24

<210> 4

<211> 138

<212> DNA

<213> 大鼠疑似泰勒氏病毒

<400> 4

ggctttggat acaagggaac acttcagtgg ctgtgagagt taggtataag aaaatgaaag 60

ttttctgtcc ccgtcccact ctcttccttc cttggccctc gaccaccact accagaatcc 120

atgcagataa cccagtgt 138