本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體是涉及一種檢測寨卡病毒的引物、試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

寨卡(Zika)病毒主要通過埃及伊蚊叮咬傳播，患者、隱性感染者和感染寨卡病毒的非人靈長類動物是該病的傳染源。寨卡病毒疫情通過蚊蟲叮咬傳播，感染后癥狀與登革熱相似，包括發(fā)燒、疹子、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉疼痛、頭痛和結(jié)膜炎(紅眼)。寨卡病毒感染者中，只有約20％會表現(xiàn)輕微癥狀，如發(fā)燒、皮疹、關(guān)節(jié)疼痛和結(jié)膜炎等，癥狀通常不到一周即可消失。然而，如果孕婦感染，胎兒可能會受到影響，導致新生兒小頭癥甚至死亡。有研究發(fā)現(xiàn)寨卡病毒也可以通過母嬰途徑傳播，包括胎兒宮內(nèi)感染或者在分娩過程中受到感染，有報道發(fā)現(xiàn)在乳汁中可以檢測到寨卡病毒的核酸。目前，全球超過150萬人感染寨卡病毒，中國感染人數(shù)較少，但感染人數(shù)不斷增加，寨卡病毒感染已成為威脅人類健康的一個嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題。寨卡病毒感染一年四季均可發(fā)病，也可存在某個地區(qū)或者季節(jié)蚊蟲孳生繁殖快而導致爆發(fā)感染的可能。我們需要予以重視，并且要研發(fā)一種快速、準確的方法用作其檢測方法。

寨卡病毒的核酸是由三個結(jié)構(gòu)基因和五個非結(jié)構(gòu)基因組成，具有10,794個核苷酸的ss(+)RNA基因組。寨卡病毒有原型MR766和ZIKA EC 2007兩個全基因組序列在GenBank中公開，它們的序列具有89％的同源性，具有97％的氨基酸相似性。

環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)(Real-time loop mediated isothermal amplification，Real-time LAMP)是21世紀初期研發(fā)的一種新技術(shù)，是一項適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術(shù)，針對靶序列上6或8個特異區(qū)域設(shè)計4或6條特異引物，在鏈置換Bst DNA聚合酶下快速擴增目的片段，擴增時間只需60min。目前，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)已廣泛應用于國內(nèi)外各種病毒、細菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進出口快速診斷中。

實時熒光LAMP技術(shù)是LAMP技術(shù)的優(yōu)化，該技術(shù)可直接用臨床血液樣本提取核酸，然后便可進行擴增，與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，該技術(shù)的優(yōu)勢除了高特異性、高靈敏度外，操作簡單、快速，對儀器設(shè)備要求低，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現(xiàn)反應，通過檢測熒光信號強弱可判斷檢測結(jié)果，適用于對疾病的快速診斷。將其用于寨卡病毒的快速診斷，可大大地縮短檢驗報告時間，更加快速地提供診斷寨卡病毒感染的依據(jù)，而后及時給予患者適當?shù)闹委?，以免耽誤病程。

Rea-LAMP作為一種擴增基因的檢測技術(shù)，也有其缺陷，例如氣溶膠的污染是不可避免的，這也是導致Rea-LAMP出現(xiàn)假陽性的主要原因；Rea-LAMP比PCR通用性差，Rea-LAMP主要用作診斷或檢測技術(shù)，不用于克隆目的；Rea-LAMP反應體系加入中引物數(shù)量較多，增加了引物與引物之間的相互作用，例如形成二聚體機會增加；Rea-LAMP檢測技術(shù)不如PCR成熟。

到目前為止，尚未有研究對Real-time LAMP檢測寨卡病毒進行系統(tǒng)的評價與分析。為檢測寨卡病毒提供新的檢測技術(shù)，我們試行運用Real-time LAMP技術(shù)檢測寨卡病毒，尋找高特異性的檢測寨卡(Zika)病毒的Real-time LAMP試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測寨卡(Zika)病毒的試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種檢測寨卡病毒的試劑盒，包括有序列組成為SEQID.NO.1-SEQID.NO.2的內(nèi)引物，序列組成為SEQID.NO.3-SEQID.NO.4的外引物。

在其中一個實施例中，還包括有序列組成為SEQID.NO.5-SEQID.NO.6的環(huán)引物。

在其中一個實施例中，在檢測體系中，所述內(nèi)引物的濃度為40±0.5μM、所述環(huán)引物的濃度為20±0.5μM、所述外引物的濃度為5±0.5μM。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測寨卡病毒的引物。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種檢測寨卡病毒的引物，包括有序列組成為SEQID.NO.1-2的內(nèi)引物，序列組成為SEQID.NO.3-4的外引物。

在其中一個實施例中，還包括有序列組成為SEQID.NO.5-6的環(huán)引物。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測寨卡病毒的方法。

實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。

一種檢測寨卡病毒的方法，采用上述檢測試劑盒，包括以下步驟：

(1)提取待檢測樣品的基因組；

(2)配置引物和反應體系，進行環(huán)介導恒溫擴增；

(3)檢測擴增產(chǎn)物。

在其中一個實施例中，在反應體系中，所述內(nèi)引物的濃度為40±0.5μM、所述環(huán)引物的濃度為20±0.5μM、所述外引物的濃度為5±0.5μM。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明經(jīng)過發(fā)明人精心篩選到的一套針對檢測寨卡病毒RNA的引物，選取8株常見病原菌做陰性對照，結(jié)果顯示均為陰性，只有寨卡病毒出現(xiàn)典型的陽性結(jié)果，顯示特異性強；且檢測寨卡病毒RNA的靈敏度較高，可達3.3ng/μl。進一步地，本發(fā)明所篩選到的引物，因為還具有特異性的環(huán)引物，除有特異性強，靈敏度高的優(yōu)點之外，還具有檢測時間短，陽性結(jié)果可在35min內(nèi)檢測完成的優(yōu)點。本發(fā)明所述的檢測試劑盒可用于寨卡病毒感染的早期診斷。

附圖說明

圖1 NS5-1加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖2 NS5-2加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖3 NS5-3加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖4 NS5-4加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖5 NS5-1不加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖6 NS5-2不加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖7 NS5-3不加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖8 NS5-4不加環(huán)引物的引物篩選試驗(上)及其溶解曲線(下)；

圖9 Rea-LAMP檢測NS5基因的特異性結(jié)果示意圖；

圖10 Rea-LAMP檢測NS5的靈敏度試驗結(jié)果示意圖；

圖11 Rea-LAMP檢測NS5的重復性試驗結(jié)果示意圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產(chǎn)品。

除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。

實施例1

1.1材料

1.1.1病毒核酸或菌株來源病毒核酸購自北京市普瑞麥迪實驗室有限公司。另選取常見的病原菌作為對照菌，包括銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、陰溝腸桿菌、肺炎鏈球菌，均為廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院檢驗科微生物室分離菌株，于-20℃保存。

1.1.2 DNA提取試劑及儀器設(shè)備細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，試劑包括：緩沖液GA(Buffer GA)、緩沖液GB(Buffer GB)、緩沖液GD(Buffer GD)、漂洗液PW(Buffer PW)、洗脫緩沖液TE(Buffer TE)、Proteinase K、吸附柱CB3(spin Columns CB3)、收集管(Collection Tubes 2ml)；-20℃、-80℃冰箱，DAYA-204，Thermo Fisher Scientific；高速離心機，PICO17，Thermo Fisher Scientific；ESE-Quant Tube Sanner，廣州迪澳生物科技有限公司；加樣槍10ul、200μl、1000μl，德國Eppendorf公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-1，常州澳華儀器有限公司；漩渦混合器，MS2，德國IKA公司；超凈工作臺，SW-CJ-1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；熒光分光光度計，F(xiàn)96PRO。

1.1.3細菌基因組DNA提取及濃度、純度的測定將-20℃保存的菌株接種于血平板，在37℃溫箱培養(yǎng)18-24h，取平板上的細菌混于生理鹽水，配制成,3-4麥氏單位的細菌，取1ml菌懸液，其余具體按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.1.4引物的設(shè)計與合成引物包括正向外引物F3、正向內(nèi)引物FIP、反向內(nèi)引物BIP、反向外引物B3、正向環(huán)引物LoopF、反向環(huán)引物LoopB，由天根生化科技(北京)有限公司合成，分別是NS5-1、NS5-2、NS5-3和NS5-4，見表1，2，3，4。

表1 zika virus Real-LAMP檢測體系引物NS5-1

表2 zika virus Real-LAMP檢測體系引物NS5-2

表3 zika virus Real-LAMP檢測體系引物NS5-3

表4 zika virus Real-LAMP檢測體系引物NS5-4

1.1.5引物配制將裝有引物干粉的離心管放進離心機，12000rpm離心1min；根據(jù)引物干粉的摩爾總量加超純水溶解干粉，室溫下放置5min，振蕩混勻；將已溶解的引物放進離心機，12000rpm離心1min；引物工作液配制：配制70μl引物工作液，所配引物工作液各組分濃度為：40μM內(nèi)引物、20μM環(huán)引物、5μM外引物具體如表5。

表5引物工作液配制

1.1.6 Real-LAMP反應體系配制按照Real-RT-LAMP擴增試劑盒的說明書配制LAMP反應體系，注意在冰盒上操作，具體如表6，配制完體系后加入一滴密封液(石蠟油)，混勻離心，蓋緊管蓋。熒光通道選擇SYBR。

表6反應體系配制

1.2方法

1.2.1引物篩選和引物二聚體排查先篩選出四套引物，分別是NS5-1、NS5-2、NS5-3和NS5-4，并且分別用上述工作液，以zika virus的RNA為模板，設(shè)置反應程序為63℃15s，63℃45s作為一個循環(huán)，做60個循環(huán)，95℃15s終止反應，于63℃45s處收集熒光信號，同時對各反應管做溶解曲線檢測，比較四套引物的擴增效率，最終篩選出擴增效率最高并且不存在二聚體影響的一套引物(NS5-1,SEQ ID NO.1-6)，以下靈敏度和特異性以及重復性試驗中所用的引物為NS5-1(SEQ ID NO.1-6)。

1.2.2環(huán)引物增強反應速率的驗證以篩選出來的引物配制工作液，分別配制加環(huán)引物工作液和不加環(huán)引物工作液，將兩份工作液分別加入LAMP反應體系，對zaka virus基因NS5進行擴增，觀察擴增曲線，比較加與不加環(huán)引物對擴增的影響。

1.2.3引物靈敏度測定zika virus的RNA濃度，先用1μl TE buffer對Thermo Scientific Nanodrop 2000微量分光光度計調(diào)0，再加1μl zaka virus的RNA提取液，測量RNA模板濃度。取10μl RNA原液用超純水進行10倍梯度稀釋4次，得到5個不同濃度的RNA模板，加入Real-LAMP體系中反應，觀察擴增曲線，檢測引物對zika virus的檢測靈敏度。

1.2.4引物特異性提取zika virus及其他陰性病原菌的基因組DNA，按照Real-LAMP的反應條件進行擴增，分析檢測的信號，評價該引物的特異性。

1.2.5重復性試驗用Real-LAMP對1份陽性菌株及3份陰性菌株各進行3次重復試驗，所有菌株重復性試驗所用引物一樣，以評價其重復性試驗的可靠性。

2.結(jié)果

2.1引物篩選試驗在開始反應后約15min，引物NS5-3的體系出峰，在反應約21min引物NS5-1的體系出峰，Bio-Rad CFX Manager檢測到NS5基因的擴增信號，NS5-2和NS5-4兩套引物無出峰，雖然引物NS5-3對zika virus NS5基因有相對高的擴增效率，但是結(jié)合溶解曲線，可見陰性對照曲線的熒光強度有明顯下降，可能存在二聚體的影響；四套引物不加環(huán)引物擴增的結(jié)果顯示，在開始反應后約39min，引物NS5-3的體系出峰，在反應約31min引物NS5-1的體系出峰，擴增效率均比加環(huán)引物的低。同樣，NS5-2和NS5-4兩套引物均無出峰。故選擇引物NS5-1做后續(xù)試驗，見圖1，2，3，4，5，6，7，8。

2.2特異性試驗本試驗選取的臨床常見病原菌作為陰性對照，均未出現(xiàn)擴增，而zika virus RNA可擴增出來，出現(xiàn)典型的“S”曲線，說明該引物對zika virus RNA檢測的特異性比較好，所設(shè)計的Rea-LAMP引物NS5-1具有良好的特異性，與非目標菌不存在交叉反應，見圖9。

2.3靈敏度試驗經(jīng)微量分光光度計測量，本實驗的寨卡病毒核酸濃度為33ng/μl，經(jīng)4次梯度稀釋，得到的濃度是：3.3ng/μl、0.33ng/μl、33pg/μl、3.3pg/μl。分析本試驗的檢測靈敏度可達到3.3ng/μl，試驗結(jié)果可靠，見圖10。

2.4重復性實驗取zika virus NS5做3個重復試驗，其中2個約23min出峰，另外一個約20min出峰，三次出峰時間相差約3min，說明Rea-LAMP用于檢測zika virus的重復性一般，見圖11。

本發(fā)明選取NS5基因作為寨卡病毒檢測是靶基因，8株臨床常見病原菌作為陰性對照，理論上應該選取黃熱病毒屬的病毒作為陰性對照進行擴增，但由于其在臨床上罕見，不易獲得，故選取常見病原菌代替。將NS5基因和陰性對照同時進行LAMP擴增，僅有NS5基因出現(xiàn)陽性擴增，表現(xiàn)為典型的“S”型曲線，其余8株陰性對照菌均未出現(xiàn)陽性擴增，說明所選取的引物對具有較強的特異性，不與非目標基因發(fā)生擴增反應。此外，反應體系中加與不加環(huán)引物的擴增效率比較，結(jié)果顯示加環(huán)引物可明顯縮短反應時間，加環(huán)引物的反應在約22min出峰，不加環(huán)引物出峰時間相對慢約10min，整個反應過程在35min內(nèi)可完成相比PCR，檢測時間可明顯縮短，這有利于臨床對寨卡病毒感染的快速診斷，及時發(fā)現(xiàn)寨卡病毒感染，及時給予治療，避免耽誤病程。

所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院

<120> 檢測寨卡病毒的引物、試劑盒和方法

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctatgactg acaccacac 19

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<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accttggatc attcacagc 19

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<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccagctcctt ccacagccca agaaggtact cgccag 36

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taagcggcca cgtgtctgaa tattgctccc agtgctg 37

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aggaagcgac catgttcatt 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gaagagttca tcaacaaggt gc 22

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catcttccct cgtgaatgg 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

accttgttga tgaactcttc tt 22

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggtgtggtg tcagtcatag cggttgttag actcctgtca aa 42

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gacaccaggg tgccagacgg aagcgaccat gttcat 36

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<212> DNA

<213> 人工序列

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cctgtaactc cagtcaccac 20

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<212> DNA

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<212> DNA

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gccaacaaag agtcttcaaa g 21

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<212> DNA

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acaactatgg cactctcct 19

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<212> DNA

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agacacgtgg ccgcttacgc caggtaatga acatggt 37

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gcagcactgg gagcaatatt tgaccttgga tcattcacag c 41

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gacaccaggg tgccagacgg aagcgaccat gttcat 36

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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