技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明總體上提供了可用于通過檢測生物標(biāo)志物概況中基因的改變甲基化水平而診斷、預(yù)后和治療評價結(jié)腸直腸癌、特別是早期診斷、預(yù)后和治療評價的組合物和方法。
背景技術(shù)：
結(jié)腸直腸癌(CRC)可以大致分為遺傳性(或家族性)形式和單個發(fā)生形式(sporadic form)。遺傳性非息肉病性結(jié)腸直腸癌(HNPCC)或Lynch綜合征在美國僅占結(jié)腸癌病例的2至3％。家族性腺瘤性息肉病(FAP)發(fā)生在1/20,000的活新生兒中，且占結(jié)腸癌病例的少于1％。相反，結(jié)腸癌的單個發(fā)生形式，其不具有強(qiáng)烈的基因或遺傳性組分，占所有病例的超過80％。工業(yè)化國家似乎在它們的人口中具有CRC的最大風(fēng)險，而癌癥發(fā)病率仍在增加。CRC現(xiàn)在是全球癌癥死亡的最主要原因之一。在美國，它是第三大常見癌癥，且是所有癌癥患者中癌癥死亡的第二大常見原因。原因之一是缺乏有效的測試方法用于檢測腫瘤和確定腫瘤對治療的響應(yīng)。
此外，一旦已經(jīng)診斷結(jié)腸癌，則將癌癥分期以便相應(yīng)地計劃治療也是重要的。結(jié)腸癌的階段包括0期、I期、II期、III期和IV期。CT掃描、MRI(磁共振成像)、PET掃描(正電子發(fā)射斷層掃描)、胸部X光、手術(shù)、淋巴結(jié)活檢、紅和白血細(xì)胞的全血計數(shù)、血小板、血紅蛋白等或癌胚抗原(CEA)測定是經(jīng)常用于分期的測試和程序。
無論各種可用治療的效率，已經(jīng)顯示CRC的早期階段或者甚至癌前病變的篩選通常是最有效的，特別是用于降低疾病相關(guān)的死亡率和成本。然而，最常用的早期篩選方法不具有足夠的靈敏度和特異性，并且它們經(jīng)常是侵入且復(fù)雜的，因此患者接受度較差。盡管最近的研究進(jìn)展已經(jīng)顯示，表觀遺傳甲基化大量存在于各種癌癥中，且已經(jīng)廣泛研究了甲基化在癌癥中的作用，然而，許多基于與結(jié)腸直腸癌相關(guān)的表觀遺傳甲基化的測試僅可適用于腫瘤活檢組織中。因此，這些測試使用有限，因為，如眾所周知，用于結(jié)腸直腸癌的傳統(tǒng)手術(shù)活檢和成像技術(shù)具有許多限制，因為它們是侵入性的，對經(jīng)歷所述程序的患者造成感染和持續(xù)不利影響的風(fēng)險。因此，非常需要以靈敏和依從的方式診斷和評價CRC及其易患性的篩選測試。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個方面提供了使用生物標(biāo)志物概況的方法，對于所述生物標(biāo)志物概況而言，甲基化水平在評估CRC階段、發(fā)展和對治療響應(yīng)中是重要且顯著的。更重要地，基于這種標(biāo)志物概況的測試方法允許檢測全血、血清或血漿中的循環(huán)甲基化生物標(biāo)志物，這提供了用于診斷CRC和監(jiān)測癌癥進(jìn)展和對治療的響應(yīng)的非侵入性的期望方法。在本發(fā)明中，獲得可用血液樣品操作的測定不僅對于臨床環(huán)境中此類方法的各種優(yōu)點、而且同樣對于克服行業(yè)面臨的困難是至關(guān)重要的，所述困難為：因為可能的降解，不是所有生物標(biāo)志物在血液中是完整的，以及不是所有生物標(biāo)志物對于不同類型的樣品都具有類似令人滿意的表現(xiàn)。
本發(fā)明總體上提供了評價受試者中的結(jié)腸直腸癌(CRC)的方法。所述方法包括：(1)從所述受試者獲得血液樣品；(2)使所述血液樣品經(jīng)受一定條件，所述條件允許核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生對于血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況中至少一種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物；和(3)鑒定對于血液樣品中可操作的甲基化CRC生物標(biāo)志物特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中此類擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述受試者中存在CRC，并且其中此類擴(kuò)增產(chǎn)物的不存在表明所述受試者中不存在CRC。在該方法中，血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況包含PROM1、SARP1、MSF1及其組合。因此，在一個實施方案中，可以產(chǎn)生對于PROM1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。在另一個實施方案中，可以產(chǎn)生對于SARP1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。在又一個實施方案中，可以產(chǎn)生對于MSF1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。在又一個實施方案中，可以產(chǎn)生對于PROM1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物和對于SARP1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。在又一個實施方案中，可以產(chǎn)生對于PROM1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物和對于MSF1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。在一個其他實施方案中，可以產(chǎn)生對于MFS1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物和對于SARP1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。在又一個實施方案中，可以產(chǎn)生對于PROM1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物、對于SARP1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物和對于MFS1的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，以便評價患者中的CRC。
在本文提供的方法中，PROM1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的PROM1特異性的引物對的引物混合物來檢測，并且此類引物混合物可以進(jìn)一步包含對于未甲基化的PROM1特異性的引物對。如本文所提供，對于甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.1的引物和另一個包含SEQ ID NO.3的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.5的引物和另一個包含SEQ ID NO.7的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.9的引物和另一個包含SEQ ID NO.11的引物的引物對。此外，對于未甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.2的引物和另一個包含SEQ ID NO.4的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.6的引物和另一個包含SEQ ID NO.8的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.10的引物和另一個包含SEQ ID NO.12的引物的引物對。
在本文提供的方法中，SARP1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的SARP1特異性的引物對的引物混合物來檢測，并且此類引物混合物可以進(jìn)一步包含對于未甲基化的SARP1特異性的引物對。如本文所提供，對于甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.13的引物和另一個包含SEQ ID NO.15的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.17的引物和另一個包含SEQ ID NO.19的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.21的引物和另一個包含SEQ ID NO.23的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.25的引物和另一個包含SEQ ID NO.27的引物的引物對。此外，對于未甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.14的引物和另一個包含SEQ ID NO.16的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.18的引物和另一個包含SEQ ID NO.20的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.22的引物和另一個包含SEQ ID NO.24的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.26的引物和另一個包含SEQ ID NO.28的引物的引物對。
在本文提供的方法中，MSF1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的MSF1特異性的引物對的引物混合物來檢測，并且此類引物混合物可以進(jìn)一步包含對于未甲基化的MSF1特異性的引物對。如本文所提供，對于甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.29的引物和另一個包含SEQ ID NO.31的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.33的引物和另一個包含SEQ ID NO.35的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.37的引物和另一個包含SEQ ID NO.39的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.45的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.47的引物的引物對。此外，對于未甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.30的引物和另一個包含SEQ ID NO.32的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.34的引物和另一個包含SEQ ID NO.36的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.38的引物和另一個包含SEQ ID NO.40的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.42的引物和另一個包含SEQ ID NO.44的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.46的引物和另一個包含SEQ ID NO.48的引物的引物對。
當(dāng)使用上述方法來關(guān)于CRC評估受試者時，甲基化的PROM1或SARP1或MSF1或其任何組合表明受試者中存在某一階段的CRC。使用本方法確定的CRC的存在可以通過臨床和/或病理觀察進(jìn)一步驗證。然而，當(dāng)受試者中沒有CRC的任何可檢測的臨床和/或病理存在時，受試者中CRC的存在是發(fā)展CRC的增加風(fēng)險。通過使用如本文提供的方法評估受試者中的CRC，還可以評價所述受試者經(jīng)歷的治療的有效性，其中血液中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況中的一種或多種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)隨著治療進(jìn)程的變化，例如從甲基化變?yōu)槲醇谆模瑥妮^高甲基化水平變?yōu)檩^低甲基化水平，表明對治療的響應(yīng)。
本發(fā)明的另一方面提供了用于評估受試者中的結(jié)腸直腸癌(CRC)的試劑盒，并且所述試劑盒包含至少一個引物對，所述引物對允許核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生對于所述受試者的血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況中至少一種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況包含PROM1、SARP1、MSF1及其任何組合，且甲基化的PROM1、SARP1或MSF1與受試者中CRC的存在相關(guān)。相比之下，未甲基化的PROM1、SARP1和MSF1表明所述受試者中不存在CRC。
為了檢測甲基化的PROM1，所述試劑盒提供了包含至少一個對于甲基化的PROM1特異性的引物對的引物混合物；并且此類對于甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.1的引物和另一個包含SEQ ID NO.3的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.5的引物和另一個包含SEQ ID NO.24的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.9的引物和另一個包含SEQ ID NO.11的引物的引物對。
為了檢測甲基化的SARP1，所述試劑盒提供了包含至少一個對于甲基化的SARP1特異性的引物對的引物混合物；并且此類引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.13的引物和另一個包含SEQ ID NO.15的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.17的引物和另一個包含SEQ ID NO.19的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.21的引物和另一個包含SEQ ID NO.23的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.25的引物和另一個包含SEQ ID NO.27的引物的引物對。
為了檢測甲基化的MSF1，所述試劑盒提供了包含至少一個對于甲基化的MSF1特異性的引物對的引物混合物；并且此類引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.29的引物和另一個包含SEQ ID NO.31的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.33的引物和另一個包含SEQ ID NO.35的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.37的引物和另一個包含SEQ ID NO.39的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.45的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.47的引物的引物對。
所述試劑盒可以進(jìn)一步包含對于未甲基化的PROM1、SARP1和/或MSF1特異性的引物對，本文描述了所述引物對。
下面更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的其他方面和重復(fù)。
具體實施方式
本公開提供了對于使用血液樣品的結(jié)腸直腸癌診斷、預(yù)后和治療評價特異性的表觀遺傳生物標(biāo)志物概況。本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測樣品中結(jié)腸直腸癌的易患性或發(fā)生率的方法，所述方法包括檢測選自血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況的至少一種基因的甲基化狀態(tài)，所述概況包含PROM1、SARP1和MSF1。在所述方法中，所述概況中至少一個選擇基因的甲基化狀態(tài)變化通過測定所述基因的甲基化水平來檢測。CRC生物標(biāo)志物概況中的至少一種基因的甲基化表明各個階段的CRC腫瘤細(xì)胞的存在或結(jié)腸直腸癌的易患性。本文提供的方法是方便的，患者友好的，高度靈敏且特異性的，且適合于快速鑒定與結(jié)腸直腸癌的各個階段相關(guān)的腫瘤細(xì)胞類型。
I.CRC生物標(biāo)志物概況和DNA甲基化
不涉及核苷酸序列變化的對癌細(xì)胞基因組的表觀遺傳修飾是普遍的。表觀遺傳變化受基因的初始核苷酸序列改變以外的機(jī)制介導(dǎo)。這些表觀遺傳修飾可能導(dǎo)致或可能不導(dǎo)致癌性細(xì)胞基因表達(dá)模式的改變?；蛑械谋碛^遺傳改變、變化或修飾包括，但不限于，DNA甲基化、乙?；⒘姿峄?、泛素化、sumo化(sumolyation)、組蛋白甲基化和乙?；?、RNA干擾和DNA結(jié)合蛋白的異常調(diào)節(jié)。本發(fā)明的基因標(biāo)志物的表觀遺傳變化通常涉及異常的DNA甲基化。通過檢測血液樣品中包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況中至少一種基因的甲基化狀態(tài)，可以如本文所提供在受試者中進(jìn)行CRC的診斷、預(yù)后或治療評價。
CRC的存在或其易患性可以由一種或多種生物標(biāo)志物的存在指示。在一些實施方案中，與對照相比樣品中生物標(biāo)志物的差異水平也可以用作診斷或預(yù)后指示。本發(fā)明提供了包含PROM1、SARP1和MSF1基因的CRC相關(guān)的生物標(biāo)志物概況。具體而言，在一個實施方案中，所述概況中任一種生物標(biāo)志物的甲基化表明CRC的存在或易患性。在其他實施方案中，所述概況中任兩種生物標(biāo)志物的甲基化表明CRC的存在或CRC的易患性。因此，在一個實施方案中，PROM1和SARP1的甲基化是CRC診斷或預(yù)后指示。在另一個實施方案中，PROM1和MSF1的甲基化是CRC診斷或預(yù)后指示。在又一個實施方案中，SARP1和MSF1的甲基化是CRC診斷或預(yù)后指示。在又一個實施方案中，PROM1、SARP1和MSF1的甲基化是CRC診斷或預(yù)后指示。選自CRC生物標(biāo)志物概況的越多基因被甲基化，則CRC診斷或預(yù)后的確定性越高。包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況中一種或多種基因的甲基化狀態(tài)可以通過PCR、雜交、測序或本領(lǐng)域中已知的任何其他方法來確定。因為基因的甲基化經(jīng)常導(dǎo)致基因沉默，所以，在一個實施方案中，使用包含PROM1、SARP1和MSF1的生物標(biāo)志物概況診斷或預(yù)后CRC的方法包括評價所述概況中一種或多種基因的表達(dá)水平。此類表達(dá)可以通過本領(lǐng)域中目前使用和還待開發(fā)的任何多種方法來評價。
PROM1編碼跨膜糖蛋白Prominin-1(PROM1；UniProtKB/Swiss-Prot號O43490)。已經(jīng)顯示PROM1結(jié)合含有膽固醇的質(zhì)膜微結(jié)構(gòu)域中的膽固醇。還提出PROM1在上皮細(xì)胞的頂端質(zhì)膜組織中發(fā)揮作用。在早期視網(wǎng)膜發(fā)育過程中，PROM1充當(dāng)盤形態(tài)發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。已知PROM1參與各種形式的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良。PROM1參與MAPK和Akt信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，PROM1以RET依賴性方式抑制細(xì)胞分化，諸如神經(jīng)突增生。PROM1基因位于染色體4p15.32。
SARP1編碼分泌的卷曲相關(guān)蛋白2(frizzled-related protein 2)(SARP1；UniProtKB/Swiss-Prot號Q96HF1)，其發(fā)揮通過與Wnts直接相互作用的Wnt信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)劑的功能。它們在調(diào)節(jié)特定細(xì)胞類型中的細(xì)胞生長和分化中具有作用。SFRP2可以對于眼視網(wǎng)膜發(fā)育和對于肌肉發(fā)生是重要的。編碼SARP1的基因位于染色體4q31.3。
MSF1編碼隔蛋白-9(MSF1；UniProtKB/Swiss-Prot號Q9UHD8)，其是參與胞質(zhì)分裂和細(xì)胞周期控制的蛋白。編碼MSF1蛋白的基因位于染色體17q25，且是卵巢腫瘤抑制基因的候選。該基因中的突變引起遺傳性肌萎縮神經(jīng)痛，也稱為具有肱偏好的神經(jīng)炎(neuritis with brachial predilection)。涉及染色體17上的該基因和染色體11上的MLL基因的染色體易位導(dǎo)致急性骨髓單核細(xì)胞白血病。
通過許多篩選、檢測和測定設(shè)計，本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，不僅血液樣品中CRC生物標(biāo)志物概況中基因的DNA保持完整，而不是降解，而且血液中這些基因的甲基化狀態(tài)以高靈敏度和特異性表明CRC或其易患性。因此，本發(fā)明的一個方面提供了所述概況中選擇生物標(biāo)志物中至少一種的甲基化狀態(tài)可用于CRC診斷和預(yù)后。具體地，選自所述概況的至少一種甲基化基因的存在表明CRC診斷和預(yù)后。此外，看起來選自所述概況的基因標(biāo)志物的甲基化水平與CRC的階段相關(guān)。一旦鑒定CRC或其易患性相關(guān)的生物標(biāo)志物，則各種方法可用于篩選樣品以特異性和選擇性地檢測所述生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)，以進(jìn)行診斷、預(yù)后或治療評價。下面詳述了一些示例性方法。
如本發(fā)明中使用的“甲基化狀態(tài)”是指目標(biāo)核酸或基因內(nèi)一個或多個CpG二核苷酸中甲基化胞嘧啶殘基的存在或不存在。在一些實施方案中，甲基化狀態(tài)通過測量甲基化水平來描述，用于測量甲基化水平的各種定量方法是本領(lǐng)域已知的。CpG島可通過一系列技術(shù)鑒定，包括測序和在計算機(jī)芯片上預(yù)測方法。CpG島可以在多個區(qū)域的核酸序列中發(fā)現(xiàn)，包括編碼區(qū)域的上游的調(diào)節(jié)區(qū)域(包括啟動子區(qū)域)中，編碼區(qū)域(例如外顯子)中，編碼區(qū)域的下游，例如增強(qiáng)子區(qū)域中，和內(nèi)含子中。適當(dāng)時，可以評價所有這些區(qū)域，以確定它們的甲基化狀態(tài)。當(dāng)啟動子區(qū)域中的CpG分布相當(dāng)稀少時，可以評價內(nèi)含子和/或外顯子區(qū)域中的甲基化水平。用于評價的區(qū)域可以是包含內(nèi)含子和外顯子序列兩者，從而重疊兩個區(qū)域的區(qū)域。在一個實施方案中，所研究的CpG島在剛剛在啟動子的上游開始且向下游延伸至轉(zhuǎn)錄區(qū)域的啟動子區(qū)域中。在另一個實施方案中，所研究的CpG島圍繞基因的編碼區(qū)的5'區(qū)域以及編碼區(qū)的3'區(qū)域。因此，在某些實施方案中，基因的甲基化狀態(tài)通過確定基因的啟動子、內(nèi)含子、外顯子1和/或外顯子2區(qū)域中的甲基化水平來評價?！皢幼印笔寝D(zhuǎn)錄起始位點(TSS)上游的區(qū)域，其從TSS延伸約10Kb、4Kb、3Kb、1Kb、500bp、300bp、150bp之間或任何其范圍。更具體地，本發(fā)明的方法研究TSS周圍的一個或多個相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)。
血液中的基因組DNA主要由DNase降解使開發(fā)在血液樣品中可檢測的有用標(biāo)志物更加困難和復(fù)雜。一些基因組區(qū)域更易受到DNase降解。例如，啟動子、增強(qiáng)子、抑制子、絕緣子和基因座控制區(qū)都已經(jīng)顯示與DNase高敏位點(DHS)相關(guān)。此外，基因的上游和下游2kb內(nèi)和第一外顯子、第一內(nèi)含子、CpG島和高度保守區(qū)域中檢測到DHS的富集。因此，如果基因或其部分處于那些可降解區(qū)域之一中，則其就血液樣品中生物標(biāo)志物的存在或不存在而言是不可靠的指示。此外，為了在基因序列內(nèi)選擇甲基化狀態(tài)與CRC、CRC分期、和/或CRC易患性相關(guān)的擴(kuò)增子(擴(kuò)增產(chǎn)物)用于基于PCR的甲基化測定，要求對于可靠性、重現(xiàn)性、靈敏度和特異性的甚至更嚴(yán)格的驗證。
術(shù)語“樣品”或“生物樣品”以其最廣泛的含義使用。根據(jù)本發(fā)明的實施方案，例如，樣品可以包含體液，包括全血、血清、血漿、尿、糞便、唾液、腦脊髓液、精液、陰道液、肺液、淚液、汗液、粘液等；細(xì)胞提取物、從細(xì)胞分離的染色體、細(xì)胞器或膜；細(xì)胞；溶液中或結(jié)合至基底的基因組DNA、RNA或cDNA；結(jié)腸直腸組織；從活受試者整體或部分分離的結(jié)腸直腸組織印物(print)或任何其他結(jié)腸直腸材料。在一些實施方案中，生物樣品還可以包括結(jié)腸直腸組織的切片，諸如活檢和尸檢樣品，和獲取用于組織學(xué)目的的冷凍切片，諸如血液、血漿、血清、痰、糞便、淚液、粘液、毛發(fā)、皮膚等。生物樣品還包括外植體，和源自患者結(jié)腸直腸組織的原代和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物。生物樣品通常獲得自真核生物，最優(yōu)選哺乳動物，諸如靈長類動物，例如人。優(yōu)選地，本發(fā)明中的生物樣品是全血、血漿或血清。將如本文所提供的生物標(biāo)志物概況與使用方法應(yīng)用于除了血液以外的生物樣品也可理解地在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明中描述的方法中獲得用于使用的生物樣品。最經(jīng)常，這將通過從受試者取出樣品來進(jìn)行，但也可以通過使用先前分離的樣品(例如，由另一人在另一時間和/或用于其他目的來分離)，或通過在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明的方法來進(jìn)行。具有治療或結(jié)果歷史的存檔結(jié)腸直腸組織、血液或血清將是特別有用的。
術(shù)語“受試者”以其最廣泛的含義使用。在一個優(yōu)選的實施方案中，受試者是哺乳動物。哺乳動物的非限制性實例包括人。優(yōu)選地，受試者包括能夠發(fā)展結(jié)腸直腸癌的任何人，包括懷疑具有結(jié)腸直腸癌的人，已經(jīng)診斷具有結(jié)腸直腸癌的人，或具有結(jié)腸直腸癌家族史的人。鑒定懷疑具有癌癥的受試者的方法，包括但不限于：身體檢查、家族醫(yī)療史、受試者醫(yī)療史、內(nèi)膜活檢或多種成像技術(shù)。
樣品可以通過現(xiàn)在已知或尚未公開的任何和所有方法收集，所述方法以保存生物材料諸如DNA或者更具體地甲基化DNA用于分析的方式收集體液。
II.用于確定選擇生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的方法
本發(fā)明提供了用于診斷結(jié)腸直腸癌或其易患性的方法，所述方法包括檢測選自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況的至少一種基因的甲基化，其中受試者的血液樣品中至少一種基因的甲基化表明CRC或其易患性。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的方法可以包括確定CRC生物標(biāo)志物概況的基因或基因組合的甲基化狀態(tài)，基本上由其組成或由其組成。可以將CRC生物標(biāo)志物概況中一種或多種基因的甲基化狀態(tài)與來自也不具有CRC易患性的健康個體的對照血液樣品的甲基化狀態(tài)進(jìn)行比較?？梢愿鶕?jù)需要采用陽性對照。在具體實施方案中，甲基化狀態(tài)使用多重甲基化特異性PCR來確定。在某些實施方案中，CRC生物標(biāo)志物概況中基因的甲基化狀態(tài)通過在基因啟動子區(qū)域的甲基化來表示。在其他實施方案中，CRC生物標(biāo)志物概況中基因的甲基化狀態(tài)通過在選擇CpG島的甲基化來表示。在一個實施方案中，檢測結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸癌的易患性的方法包括檢測包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況中至少兩種基因的甲基化。因此，在一個實施方案中，所述方法包括檢測PROM1和SARP1的甲基化。在另一個實施方案中，所述方法包括檢測PROM1和MSF1的甲基化。在又一個實施方案中，所述方法包括檢測SARP1和MSF1的甲基化。在又一個實施方案中，檢測結(jié)腸直腸癌或結(jié)腸直腸癌的易患性的方法包括檢測PROM1、SARP1和MSF1的甲基化。
存在各種使用不同方法來評價甲基化狀態(tài)的技術(shù)，諸如超甲基化或低甲基化，甲基化變化，和/或測量甲基化水平。亞硫酸氫鹽測序、MSP(甲基化特異性PCR)、MS-SnuPE(甲基化敏感的單核苷酸引物延伸)、COBRA(聯(lián)合亞硫酸氫鹽限制性分析)、MethylLight(亞硫酸氫鈉依賴性定量實時PCR)、QMSP(定量甲基化特異性PCR)、MALDI-TOF MS(基質(zhì)輔助激光解吸/電離、飛行時間質(zhì)譜法)和甲基化焦磷酸測序都用于定性或定量分析各種發(fā)育樣品和腫瘤中的基因座和經(jīng)常多基因座特異性甲基化。其他示例性技術(shù)包括，但不限于，熔解曲線甲基化特異性PCR、用或不用硫酸氫鹽處理的MLPA(多重連接依賴性探針擴(kuò)增)、QAMA(甲基化等位基因的定量分析)、MSRE-qPCR(基于甲基敏感的限制酶的定量PCR)、ConLight-MSP(使用定量PCR的DNA甲基化的轉(zhuǎn)化特異性檢測)、BS-MSP(亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化特異性甲基化特異性PCR)、MS-SSCA(甲基化敏感的單鏈構(gòu)象分析)、McCOBRA(熔解曲線組合亞硫酸氫鹽限制性分析)、ERMA(酶促區(qū)域甲基化測定)。其他技術(shù)還包括定量PCR測序和基于寡核苷酸的微陣列系統(tǒng)，諸如Meth-DOP-PCR，用于從體液提取的痕量DNA的甲基化概況分析的方法和MALDI-TOF-MS陣列分析。
上述甲基化特異性PCR、測序或陣列技術(shù)中的一些包括使用內(nèi)切核酸酶，所述內(nèi)切核酸酶相對于甲基化位點優(yōu)先切割未甲基化位點，反之亦然。切割模式的差異表明甲基化的CpG二核苷酸的存在或不存在。切割模式進(jìn)而可以因為產(chǎn)物修飾而直接檢測，或在生成對于改變的大小或電荷可區(qū)分的產(chǎn)物的進(jìn)一步反應(yīng)后進(jìn)行檢測，所述產(chǎn)物可以通過包括但不限于電泳、色譜和質(zhì)譜的方法來檢測。
或者，甲基化CpG二核苷酸的鑒定可以利用MeCP2MBP、MBP2、MBP4、聚-MBD蛋白或抗體的甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)選擇性結(jié)合至甲基化DNA序列的能力。可以將MBD固定至固相基質(zhì)，且用于制備型柱層析來分離高度甲基化的DNA序列。變體形式諸如表達(dá)的His標(biāo)簽的甲基化CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用來選擇性結(jié)合至甲基化的DNA序列。最終，使限制性內(nèi)切核酸酶消化的基因組DNA與表達(dá)的His標(biāo)簽的甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域接觸。其他方法是本領(lǐng)域眾所周知的，且包括甲基化的CpG島回收測定(methylated-CpG island recovery assay)(MIRA)。另一種方法，MB-PCR，使用固定化在PCR容器的壁上以捕獲甲基化DNA的重組的二價甲基CpG結(jié)合多肽和隨后通過PCR檢測結(jié)合的甲基化DNA。
用于檢測甲基化CpG二核苷酸基序的進(jìn)一步方法使用選擇性修飾CpG二核苷酸基序的甲基化或未甲基化的形式的化學(xué)試劑。合適的化學(xué)試劑包括肼和亞硫酸氫根離子。例如，用亞硫酸氫鈉處理DNA樣品將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而保持甲基化的胞嘧啶，且所得尿嘧啶具有胸苷的堿基配對行為，其不同于胞嘧啶堿基配對行為。這種轉(zhuǎn)化最終導(dǎo)致初始DNA序列的可檢測變化。
一些技術(shù)使用用于評價在CpG二核苷酸的甲基化狀態(tài)的引物。可以設(shè)計引物，從而使得它們不含DNA甲基化的任何潛在位點，而在差異甲基化位點的可檢測序列變異位于兩個引物之間。此類引物可以用于亞硫酸氫鹽基因組測序、COBRA、Ms-SnuPE和幾種其他技術(shù)?；蛘?，可以設(shè)計與甲基化或未甲基化的目標(biāo)序列特異性雜交的引物。雜交之后，可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，使用本領(lǐng)域已知的任何檢測系統(tǒng)測定擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述樣品與引物雜交。所述引物的特異性表明DNA是否已經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾，其進(jìn)而表明DNA是否已被甲基化。如果與目標(biāo)具有足夠的互補(bǔ)區(qū)域，例如12、15、18或20個核苷酸，則所述引物還可含有不干擾雜交但可用于其他操作的額外核苷酸殘基。此類其他殘基的實例可以是限制性內(nèi)切核酸酶切割位點，配體結(jié)合位點或者因子結(jié)合或接頭或重復(fù)。
其他區(qū)分經(jīng)甲基化和未甲基化核酸的方法是使用寡核苷酸探針。此類探針可以在擴(kuò)增或不擴(kuò)增的情況下直接與經(jīng)修飾核酸雜交?；谔结樀臏y定利用了寡核苷酸與特異性序列的雜交以及隨后對該雜交物的檢測?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的檢測系統(tǒng)標(biāo)記寡核苷酸探針。這些包括但不限于：熒光部分、放射性同位素標(biāo)記部分、生物發(fā)光部分、發(fā)光部分、化學(xué)發(fā)光部分、酶、底物、受體或配體。例如，MSP(甲基化特異性PCR)方法使用引物對擴(kuò)增DNA，所述引物對經(jīng)設(shè)計通過利用由于亞硫酸氫鈉處理導(dǎo)致的序列差異來區(qū)分甲基化DNA和未甲基化DNA。例如，亞硫酸氫根離子修飾未甲基化的胞嘧啶堿基，將它們變?yōu)槟蜞奏A基。在雜交條件下，尿嘧啶堿基與腺嘌呤堿基雜交。因此，包含替代鳥嘌呤堿基的腺嘌呤堿基的寡核苷酸引物會與亞硫酸氫根修飾的DNA雜交，而含有鳥嘌呤堿基的寡核苷酸引物會與DNA中未修飾的(甲基化的)胞嘧啶殘基雜交。使用DNA聚合酶和第二引物的擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，所述擴(kuò)增產(chǎn)物可以容易觀察到，這進(jìn)而表明DNA是否已經(jīng)被甲基化。盡管PCR是優(yōu)選的擴(kuò)增方法，但在該基本技術(shù)上的變異，諸如嵌套PCR、多重PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、自我維持序列復(fù)制(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、用Qβ復(fù)制酶擴(kuò)增也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。在本發(fā)明中，用于評價相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)的優(yōu)選實施方案需要擴(kuò)增以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。
使用PCR，可能將樣品中單一拷貝的特定目標(biāo)序列擴(kuò)增至可通過幾種不同方法檢測的水平。擴(kuò)增產(chǎn)物的存在可以使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法直接評價。它們可以在合適的凝膠諸如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠上可視化。檢測可以涉及，例如，特定染料(諸如插入雙鏈DNA的溴化乙錠)的結(jié)合和在UV照射器下DNA條帶的可視化。用于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的另一種方式包括熒光或能量轉(zhuǎn)移，其可以進(jìn)行測量以確定甲基化DNA的存在。或者，在一些實施方案中，與標(biāo)記的寡核苷酸探針的雜交促進(jìn)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測。例如，標(biāo)記的探針在延伸相過程中釋放其熒光標(biāo)簽，從而使得可以檢測或測量熒光水平。通常，探針與上游或下游引物的下游的目標(biāo)序列內(nèi)的序列是互補(bǔ)的。探針可以包括一個或多個標(biāo)記。標(biāo)記可以是能夠幫助機(jī)器、檢測器、傳感器、設(shè)備或增強(qiáng)或未增強(qiáng)的人眼區(qū)分未標(biāo)記的組合物和標(biāo)記的組合物的任何物質(zhì)。標(biāo)記的實例包括但不限于：放射性同位素或其螯合物，染料(熒光或無熒光)，染劑，酶，或非放射性金屬。特定實例包括，但不限于：熒光素，生物素，地高辛，堿性磷酸酶，生物素，鏈霉親和素，3H，14C，32P，35S，或能夠發(fā)射輻射的任何其他化合物，羅丹明，4-(4′-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(“Dabcyl”)；4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯磺酸(磺酰氯)(“Dabsyl”)；5-((2-氨基乙基)-氨基)-萘(naphthalene)-1-磺酸(“EDANS”)；補(bǔ)骨脂素衍生物，半抗原，青色素，吖啶，熒光對甲氨基酚衍生物，膽固醇衍生物；乙二胺四乙酸(“EDTA”)和其衍生物，或可以差異檢測的任何其他化合物。標(biāo)記還可以包括一種或多種經(jīng)優(yōu)化用于基因分型的熒光染料。促進(jìn)目標(biāo)擴(kuò)增的讀出的染料的實例包括，但不限于：CAL-Fluor Red 610、CAL-Fluor Orange 560、dR110、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ+、Gold540和LIZ。PCR促進(jìn)目標(biāo)擴(kuò)增的讀出。
MSP技術(shù)的另一種應(yīng)用被稱為實時定量MSP(QMSP)，其允許實時或在端點可靠定量甲基化的DNA。實時方法一般是基于連續(xù)光學(xué)監(jiān)測擴(kuò)增程序，并且利用熒光標(biāo)記的試劑，所述試劑在產(chǎn)物中的摻入可以進(jìn)行定量，并且其定量表明模板中該序列的拷貝數(shù)。一種此類試劑是熒光染料，SYBR Green I，其優(yōu)先結(jié)合雙鏈DNA，且雙鏈DNA的結(jié)合大大增強(qiáng)了其熒光?；蛘?，標(biāo)記的引物和/或標(biāo)記的探針可用于定量。它們代表了眾所周知的市售實時擴(kuò)增技術(shù)的具體應(yīng)用，諸如MOLECULAR和PlexorTM等。在實時PCR系統(tǒng)中，可以在指數(shù)期過程中監(jiān)測PCR反應(yīng)，在所述指數(shù)期過程中，PCR產(chǎn)物的量的首先顯著增加與目標(biāo)模板的初始量相關(guān)。
實時PCR檢測反應(yīng)過程中擴(kuò)增子(擴(kuò)增產(chǎn)物)的積累。當(dāng)分析來證實樣品中是否存在目標(biāo)DNA時，可以在已經(jīng)完成擴(kuò)增反應(yīng)之后實施端點驗證。在本發(fā)明中，此類分析優(yōu)選用于檢測患者中結(jié)腸直腸癌的易患性或發(fā)病率。端點PCR熒光檢測技術(shù)可以使用與廣泛用于實時PCR中的相同的方法。例如，儀器諸如"Gene"檢測器("Gene-Machine")允許直接測量PCR管(Bioron GmbH,Ludwigshafen,German)中的熒光。使用實施PCR對甲基化的定量可以采用絕對基礎(chǔ)，或者可以相對于組成型甲基化DNA標(biāo)準(zhǔn)品，或者可以相對于未甲基化的DNA標(biāo)準(zhǔn)品。甲基化狀態(tài)可通過使用所研究標(biāo)志物的信號與參照基因的信號之間的比率來測定(其中參照基因中的甲基化狀態(tài)是已知的)，或者通過使用所述甲基化標(biāo)志物和甲基化及非甲基化標(biāo)志物的總和之間的比率來測定?；蛘?，可測定甲基化標(biāo)志物基因的絕對拷貝數(shù)。
本發(fā)明的一個方面提供了多重PCR測定以確定所述概況中多于一種基因標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)。多重PCR是用于在單一PCR實驗中擴(kuò)增多個目標(biāo)的技術(shù)。在多重測定中，可以在反應(yīng)混合物中使用多個引物對擴(kuò)增多于一種目標(biāo)序列。作為PCR實際使用的延伸，該技術(shù)具有在實驗室內(nèi)相當(dāng)大節(jié)約時間和精力的潛力，而又不影響實驗的效用。除了對于這些引物所需的差異甲基化檢測，設(shè)計特異性引物組對于成功的多重反應(yīng)是必不可少的，并且待考慮的因素包括引物長度、熔解溫度、特異性和引物二聚化。
在一些形式的多重PCR測定中，相對定量經(jīng)常用來確定多個樣品間基因的甲基化水平的變化，并且描述相對于內(nèi)部對照樣品的水平的甲基化水平。對照樣品可以對于多重測定在相同混合物中共同擴(kuò)增，或者可以在單獨(dú)混合物中擴(kuò)增。可以需要并入合適的對照，以確保選擇的方法正確且可靠地工作。合適的對照可以包括評價已知被甲基化的基因的甲基化狀態(tài)。還可以包括陽性對照以幫助確保不會獲得假陰性結(jié)果。所述基因可以是已知在所研究的樣品中被甲基化的基因，或者其可以已經(jīng)被人工甲基化。
在某些實施方案中，MSP(甲基化特異性PCR)引物用于本發(fā)明的方法中。在一些實施方案中，當(dāng)在樣品中同時分析多于一種基因的甲基化狀態(tài)時，使用多重甲基化特異性實時PCR。本發(fā)明提供了可用于MSP中的示例性引物以確定CRC生物標(biāo)志物概況中基因的甲基化狀態(tài)，如下表1中所示。這些引物可以包含(任何)表中所示的核苷酸序列，基本上由其組成或由其組成。在表1中，指定為“甲基化”的引物優(yōu)選被設(shè)計為結(jié)合至CRC生物標(biāo)志物概況中基因的基因組序列中完全甲基化的目標(biāo)區(qū)域，且產(chǎn)生對于甲基化生物標(biāo)志物或其部分特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物；然而指定為“未甲基化的”的引物優(yōu)選被設(shè)計為結(jié)合至CRC生物標(biāo)志物概況中基因的基因組序列中相同但未甲基化的目標(biāo)區(qū)域，由此產(chǎn)生對于未甲基化生物標(biāo)志物或其部分特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，通過指定為“甲基化”的引物或通過指定為“未甲基化的”引物擴(kuò)增的擴(kuò)增子的量提供了給定樣品中選擇基因的目標(biāo)區(qū)域的甲基化狀態(tài)的測量。
這些引物的其他特征，諸如通過測定特異性評價的表現(xiàn)，總結(jié)在實驗部分中。注意這些序列的變體可用于本發(fā)明。具體而言，可根據(jù)需要添加其他側(cè)翼序列，例如用以改善結(jié)合特異性。變體序列優(yōu)選地與本文所示引物的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的核苷酸序列同一性。所述引物適當(dāng)時可以摻入合成核苷酸類似物，或者可以是基于DNA、RNA或PNA的，或其混合物。類似地，適當(dāng)時可利用替代的熒光供體和受體部分/FRET對。除了用熒光供體和受體部分標(biāo)記以外，所述引物可以包含經(jīng)修飾的寡核苷酸以及其他附加基團(tuán)和標(biāo)記，條件是不損害作為本發(fā)明方法中引物的功能。
為了基于甲基化目標(biāo)序列相對于足夠參考序列的拷貝數(shù)計算甲基化的水平，建立各種數(shù)學(xué)模型。計算基于通過各種方法測定的獨(dú)特循環(huán)的比較，例如，在恒定熒光水平的交叉點(Cp)和循環(huán)閾值(Ct)；或者根據(jù)建立的數(shù)學(xué)算法的Cp獲取。
用于實時PCR中Ct值的算法計算每個PCR擴(kuò)增達(dá)到顯著閾值的循環(huán)。計算的Ct值與樣品中存在的目標(biāo)拷貝數(shù)成正比，且Ct值是任何樣品中發(fā)現(xiàn)的拷貝的精確定量測量。換言之，Ct值表示引物組經(jīng)設(shè)計以識別的各自目標(biāo)的存在。如果目標(biāo)在樣品中丟失，則實時PCR反應(yīng)中不應(yīng)當(dāng)存在擴(kuò)增。
或者，可以利用Cp值。Cp值表示熒光增加最高且PCR的對數(shù)期開始的循環(huán)。480軟件(Roche Applied Science,Penzberg,Germany)計算整個擴(kuò)增曲線的二階導(dǎo)數(shù)，并且確定該值在何處最大。二階導(dǎo)數(shù)算法當(dāng)熒光相對低時能夠收集數(shù)據(jù)，且因此獲得的數(shù)據(jù)更加可靠且可重復(fù)。
因此，所述概況的一種或多種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)可以通過上述方法中的一種或多種來確定。在一個實施方案中，測定中PCR或?qū)崟rPCR甲基化產(chǎn)物的存在可以表明CRC發(fā)病或易患性的存在。在一個實施方案中，PCR或?qū)崟rPCR產(chǎn)物可以通過與PCR反應(yīng)同時或隨后進(jìn)行的雜交進(jìn)一步鑒定或區(qū)分。在另一個實施方案中，可以測序PCR或?qū)崟rPCR產(chǎn)物，以確認(rèn)表明CRC或其易患性的具有甲基化的特定等位基因的存在。
III試劑盒
本發(fā)明的又一個方面涵蓋用于經(jīng)由鑒定選自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況的基因的甲基化狀態(tài)診斷CRC或其易患性的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含用于檢測選自所述概況的至少一種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的引物組。在另一個實施方案中，試劑盒包含用于檢測選自所述概況的至少兩種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的引物組。在又一個實施方案中，試劑盒包含用于檢測選自所述概況的至少三種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的引物組。如上表1中所提供，用于使用甲基化特異性PCR方法檢測至少PROM1的甲基化狀態(tài)的試劑盒中可以包括包含SEQ ID NOs:1、2、3、和4的引物，或包含SEQ ID NOs:5、6、7、和8的引物，或包含SEQ ID NOs:9、10、11、和12的引物。進(jìn)一步，用于使用甲基化特異性PCR方法檢測至少SARP1的甲基化狀態(tài)的試劑盒中可以包括包含SEQ ID NOs:13、14、15、和16的引物，或包含SEQ ID NOs:17、18、19、和20的引物，或包含SEQ ID NOs:21、22、23、和24的引物，或包含SEQ ID NOs:25、26、27、和28的引物。此外，用于使用甲基化特異性PCR方法檢測至少M(fèi)SF1的甲基化狀態(tài)的試劑盒中可以包括包含SEQ ID NOs:29、30、31、和32的引物，或包含SEQ ID NOs:33、34、35、和36的引物，或包含SEQ ID NOs:37、38、39、和40的引物，或包含SEQ ID NOs:41、42、43、和44的引物。
用于經(jīng)由鑒定選自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況的基因的甲基化狀態(tài)診斷CRC或其易患性的試劑盒可以進(jìn)一步包含以下中的一種或多種：核酸提取試劑、對照、一次性盒、標(biāo)記試劑、酶、PCR擴(kuò)增試劑或一種或多種其他促進(jìn)甲基化特異性PCR的試劑。
在另一個實施方案中，試劑盒可以進(jìn)一步包含可用于標(biāo)記引物寡核苷酸的標(biāo)記。標(biāo)記可以是能夠幫助機(jī)器、檢測器、傳感器、設(shè)備或增強(qiáng)或未增強(qiáng)的人眼區(qū)分展示高甲基化相比于低甲基化的樣品與用于比較的對照樣品的任何物質(zhì)。標(biāo)記的實例包括但不限于：放射性同位素或其螯合物，染料(熒光或無熒光)，染劑，酶，或非放射性金屬。特定實例包括，但不限于：熒光素，生物素，地高辛，堿性磷酸酶，生物素，鏈霉親和素，3H，14C，32P，35S，或能夠發(fā)射輻射的任何其他化合物，羅丹明，4-(4′-二甲基氨基-苯偶氮基)苯甲酸(“Dabcyl”)；4-(4'-二甲基氨基-苯偶氮基)苯磺酸(磺酰氯)(“Dabsyl”)；5-((2-氨基乙基)-氨基)-萘(naphthalene)-1-磺酸(“EDANS”)；補(bǔ)骨脂素衍生物，半抗原，青色素，吖啶，熒光對甲氨基酚衍生物，膽固醇衍生物；乙二胺四乙酸(“EDTA”)和其衍生物，或在標(biāo)記核酸存在的情況下傳導(dǎo)信號的任何其他化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，標(biāo)記包括一種或多種經(jīng)優(yōu)化用于基因分型的染料。此類染料的實例包括但不限于：dR110、5-FAM、6FAM、dR6G、JOE、HEX、VIC、TET、dTAMRA、TAMRA、NED、dROX、PET、BHQ+、Gold540、和LIZ。
在又一個實施方案中，試劑盒中的引物可以已經(jīng)標(biāo)記，且可以在沒有標(biāo)記過程的情況下用于PCR，測序反應(yīng)，或結(jié)合至固體基底，諸如寡核苷酸陣列。用于經(jīng)由鑒定選自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況的基因的甲基化狀態(tài)診斷CRC或其易患性的試劑盒還可以包含使用說明書。在一個實施方案中，所述試劑盒可以進(jìn)一步包含將試劑盒提供的測定的輸出與特定結(jié)果相聯(lián)系的指示。例如，指示可以提供將選自CRC生物標(biāo)志物概況的一種或多種甲基化基因的存在與CRC診斷或預(yù)后相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。例如，指示可以進(jìn)一步提供將選自CRC生物標(biāo)志物概況的一種或多種甲基化基因的存在與CRC診斷或預(yù)后的置信水平相關(guān)聯(lián)的指導(dǎo)。所述指示可以含有經(jīng)配置以定量基因生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定的輸出可以是特定序列、特定基因型、實時定量PCR反應(yīng)中的特定Ct水平、熒光或放射性衰變的水平、從標(biāo)準(zhǔn)曲線或從陽性或陰性對照推導(dǎo)的值、或這些和其他輸出的任意組合的形式。所述指示可以被打印為書面材料，所述書面材料可以包括在試劑盒中，或者它可以在互聯(lián)網(wǎng)上發(fā)布，或嵌入軟件包中。所述書面材料可以包括結(jié)果的圖形描繪，諸如顯微照片或擴(kuò)增曲線。
用于經(jīng)由鑒定選自包含PROM1、SARP1和MSF1的CRC生物標(biāo)志物概況的基因的甲基化狀態(tài)診斷CRC或其易患性的試劑盒可以進(jìn)一步包含用于收集樣品的裝置。此類裝置可以包括但不限于：拭子、針、血液收集管、紙巾、或可用于從患者或從現(xiàn)在已知或尚待公開的環(huán)境收集生物樣品的任何其他裝置。優(yōu)選地，所述試劑盒包含用于收集血液樣品的裝置。
此外，本發(fā)明還包括以下實施方案：
1.用于評價受試者中的結(jié)腸直腸癌(CRC)的引物混合物，所述引物混合物包含選自以下(1)至(3)項中的一者或多者：
(1)對于甲基化的PROM1特異性的引物對；
和任選地，對于未甲基化的PROM1特異性的引物對；
(2)對于甲基化的SARP1特異性的引物對；
和任選地，對于未甲基化的SARP1特異性的引物對；和
(3)對于甲基化的MSF1特異性的引物對；
和任選地，對于未甲基化的MSF1特異性的引物對。
2.實施方案1的引物混合物，其中所述對于甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.1的引物和另一個包含SEQ ID NO.3的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.5的引物和另一個包含SEQ ID NO.7的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.9的引物和另一個包含SEQ ID NO.11的引物的引物對。
3.實施方案1或2的引物混合物，其中所述對于未甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.2的引物和另一個包含SEQ ID NO.4的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.6的引物和另一個包含SEQ ID NO.8的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.10的引物和另一個包含SEQ ID NO.12的引物的引物對。
4.前述實施方案中任一項的引物混合物，其中所述對于甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.13的引物和另一個包含SEQ ID NO.15的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.17的引物和另一個包含SEQ ID NO.19的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.21的引物和另一個包含SEQ ID NO.23的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.25的引物和另一個包含SEQ ID NO.27的引物的引物對。
5.前述實施方案中任一項的引物混合物，其中所述對于未甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.14的引物和另一個包含SEQ ID NO.16的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.18的引物和另一個包含SEQ ID NO.20的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.22的引物和另一個包含SEQ ID NO.24的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.26的引物和另一個包含SEQ ID NO.28的引物的引物對。
6.前述實施方案中任一項的引物混合物，其中所述對于甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.29的引物和另一個包含SEQ ID NO.31的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.33的引物和另一個包含SEQ ID NO.35的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.37的引物和另一個包含SEQ ID NO.39的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.45的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.47的引物的引物對。
7.前述實施方案中任一項的引物混合物，其中所述對于未甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.30的引物和另一個包含SEQ ID NO.32的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.34的引物和另一個包含SEQ ID NO.36的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.38的引物和另一個包含SEQ ID NO.40的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.42的引物和另一個包含SEQ ID NO.44的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.46的引物和另一個包含SEQ ID NO.48的引物的引物對。
8.對于血液樣品中可操作的甲基化CRC生物標(biāo)志物特異性的引物在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于通過包括以下步驟的方法的評價受試者中的結(jié)腸直腸癌(CRC)：
從所述受試者獲得血液樣品；
使所述血液樣品經(jīng)受一定條件，所述條件允許核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生對于血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況中至少一種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物；和
鑒定對于血液樣品中可操作的甲基化CRC生物標(biāo)志物特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中此類擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述受試者中存在CRC。
9.實施方案8的用途，其中所述血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況包含PROM1、SARP1、MSF1及其組合。
10.實施方案8或9的用途，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物對于PROM1的甲基化狀態(tài)是特異性的。
11.實施方案8-10中任一項的用途，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物對于SARP1的甲基化狀態(tài)是特異性的。
12.實施方案8-11中任一項的用途，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物對于MSF1的甲基化狀態(tài)是特異性的。
13.實施方案10的用途，其中所述PROM1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的PROM1特異性的引物對的引物混合物來檢測。
14.實施方案13的用途，其中所述引物混合物進(jìn)一步包含對于未甲基化的PROM1特異性的引物對。
15.實施方案13或14的用途，其中所述對于甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.1的引物和另一個包含SEQ ID NO.3的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.5的引物和另一個包含SEQ ID NO.7的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.9的引物和另一個包含SEQ ID NO.11的引物的引物對。
16.實施方案14或15的用途，其中所述對于未甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.2的引物和另一個包含SEQ ID NO.4的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.6的引物和另一個包含SEQ ID NO.8的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.10的引物和另一個包含SEQ ID NO.12的引物的引物對。
17.實施方案11的用途，其中所述SARP1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的SARP1特異性的引物對的引物混合物來檢測。
18.實施方案17的用途，其中所述引物混合物進(jìn)一步包含對于未甲基化的SARP1特異性的引物對。
19.實施方案17或18的用途，其中所述對于甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.13的引物和另一個包含SEQ ID NO.15的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.17的引物和另一個包含SEQ ID NO.19的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.21的引物和另一個包含SEQ ID NO.23的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.25的引物和另一個包含SEQ ID NO.27的引物的引物對。
20.實施方案18或19的用途，其中所述對于未甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.14的引物和另一個包含SEQ ID NO.16的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.18的引物和另一個包含SEQ ID NO.20的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.22的引物和另一個包含SEQ ID NO.24的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.26的引物和另一個包含SEQ ID NO.28的引物的引物對。
21.實施方案12的用途，其中所述MSF1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的MSF1特異性的引物對的引物混合物來檢測。
22.實施方案21的用途，其中所述引物混合物進(jìn)一步包含對于未甲基化的MSF1特異性的引物對。
23.實施方案21或22的用途，其中所述對于甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.29的引物和另一個包含SEQ ID NO.31的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.33的引物和另一個包含SEQ ID NO.35的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.37的引物和另一個包含SEQ ID NO.39的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.45的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.47的引物的引物對。
24.實施方案22或23的用途，其中所述對于未甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.30的引物和另一個包含SEQ ID NO.32的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.34的引物和另一個包含SEQ ID NO.36的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.38的引物和另一個包含SEQ ID NO.40的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.42的引物和另一個包含SEQ ID NO.44的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.46的引物和另一個包含SEQ ID NO.48的引物的引物對。
25.實施方案8-24中任一項的用途，其中當(dāng)所述受試者不具有CRC的可觀察的臨床指示時，所述受試者中CRC的存在是發(fā)展CRC的增加風(fēng)險。
26.用于評價受試者中的結(jié)腸直腸癌(CRC)的試劑盒，所述試劑盒包含：至少一個引物對，所述引物對允許核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生對于所述受試者的血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況中至少一種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中所述血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況包含PROM1、SARP1、MSF1及其組合；且其中甲基化的PROM1、SARP1或MSF1與所述受試者中CRC的存在相關(guān)。
27.實施方案26的試劑盒，其中所述甲基化的PROM1可通過包含至少一個對于甲基化的PROM1特異性的引物對的引物混合物來檢測；并且其中所述對于甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.1的引物和另一個包含SEQ ID NO.3的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.5的引物和另一個包含SEQ ID NO.24的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.9的引物和另一個包含SEQ ID NO.11的引物的引物對。
28.實施方案26或27的試劑盒，其中所述甲基化的SARP1可通過包含至少一個對于甲基化的SARP1特異性的引物對的引物混合物來檢測；并且其中所述對于甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.13的引物和另一個包含SEQ ID NO.15的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.17的引物和另一個包含SEQ ID NO.19的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.21的引物和另一個包含SEQ ID NO.23的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.25的引物和另一個包含SEQ ID NO.27的引物的引物對。
29.實施方案26-28中任一項的試劑盒，其中所述甲基化的MSF1可通過包含至少一個對于甲基化的MSF1特異性的引物對的引物混合物來檢測；并且其中所述對于甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.29的引物和另一個包含SEQ ID NO.31的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.33的引物和另一個包含SEQ ID NO.35的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.37的引物和另一個包含SEQ ID NO.39的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.45的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.47的引物的引物對。
30.試劑盒，所述試劑盒包含實施方案1-7中任一項的引物混合物。
31.評價受試者中的結(jié)腸直腸癌(CRC)的方法，所述方法包括
從所述受試者獲得血液樣品；
使所述血液樣品經(jīng)受一定條件，所述條件允許核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生對于血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況中至少一種生物標(biāo)志物的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物；和
鑒定對于血液樣品中可操作的甲基化CRC生物標(biāo)志物特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中此類擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表明所述受試者中存在CRC。
32.實施方案31的方法，其中所述血液樣品中可操作的CRC生物標(biāo)志物概況包含PROM1、SARP1、MSF1及其組合。
33.實施方案31的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物對于PROM1的甲基化狀態(tài)是特異性的。
34.實施方案31的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物對于SARP1的甲基化狀態(tài)是特異性的。
35.實施方案31的方法，其中所述擴(kuò)增產(chǎn)物對于MSF1的甲基化狀態(tài)是特異性的。
36.實施方案33的方法，其中所述PROM1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的PROM1特異性的引物對的引物混合物來檢測。
37.實施方案36的方法，其中所述引物混合物進(jìn)一步包含對于未甲基化的PROM1特異性的引物對。
38.實施方案36的方法，其中所述對于甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.1的引物和另一個包含SEQ ID NO.3的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.5的引物和另一個包含SEQ ID NO.7的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.9的引物和另一個包含SEQ ID NO.11的引物的引物對。
39.實施方案37的方法，其中所述對于未甲基化的PROM1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.2的引物和另一個包含SEQ ID NO.4的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.6的引物和另一個包含SEQ ID NO.8的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.10的引物和另一個包含SEQ ID NO.12的引物的引物對。
40.實施方案34的方法，其中所述SARP1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的SARP1特異性的引物對的引物混合物來檢測。
41.實施方案40的方法，其中所述引物混合物進(jìn)一步包含對于未甲基化的SARP1特異性的引物對。
42.實施方案40的方法，其中所述對于甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.13的引物和另一個包含SEQ ID NO.15的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.17的引物和另一個包含SEQ ID NO.19的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.21的引物和另一個包含SEQ ID NO.23的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.25的引物和另一個包含SEQ ID NO.27的引物的引物對。
43.實施方案41的方法，其中所述對于未甲基化的SARP1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.14的引物和另一個包含SEQ ID NO.16的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.18的引物和另一個包含SEQ ID NO.20的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.22的引物和另一個包含SEQ ID NO.24的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.26的引物和另一個包含SEQ ID NO.28的引物的引物對。
44.實施方案35的方法，其中所述MSF1的甲基化狀態(tài)可通過包含至少一個對于甲基化的MSF1特異性的引物對的引物混合物來檢測。
45.實施方案44的方法，其中所述引物混合物進(jìn)一步包含對于未甲基化的MSF1特異性的引物對。
46.實施方案44的方法，其中所述對于甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.29的引物和另一個包含SEQ ID NO.31的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.33的引物和另一個包含SEQ ID NO.35的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.37的引物和另一個包含SEQ ID NO.39的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.45的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.41的引物和另一個包含SEQ ID NO.47的引物的引物對。
47.實施方案45的方法，其中所述對于未甲基化的MSF1特異性的引物對選自具有一個包含SEQ ID NO.30的引物和另一個包含SEQ ID NO.32的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.34的引物和另一個包含SEQ ID NO.36的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.38的引物和另一個包含SEQ ID NO.40的引物的引物對；具有一個包含SEQ ID NO.42的引物和另一個包含SEQ ID NO.44的引物的引物對；和具有一個包含SEQ ID NO.46的引物和另一個包含SEQ ID NO.48的引物的引物對。
48.實施方案31的方法，其中當(dāng)所述受試者不具有CRC的可觀察的臨床指示時，所述受試者中CRC的存在是發(fā)展CRC的增加風(fēng)險。
盡管本文所述的發(fā)明易于進(jìn)行各種改變和替代迭代，但上文已經(jīng)更詳細(xì)地描述了其具體實施方案。然而，應(yīng)當(dāng)理解，CRC生物標(biāo)志物概況和其用途的詳細(xì)描述不意欲將本發(fā)明限制到所公開的具體實施方案。相反，應(yīng)該理解的是，本發(fā)明意欲覆蓋落在如權(quán)利要求語言所定義的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有改變、等價方案和替代方案。
實施例
以下實施例說明本發(fā)明的某些方面，而不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1-方法與材料
患者選擇和臨床樣本：所有受試者均通過病理學(xué)分析診斷為具有CRC。臨床和病理學(xué)數(shù)據(jù)獲得自相關(guān)患者記錄并總結(jié)在表2中。分析的CRC組織獲得自手術(shù)切除(包括結(jié)腸鏡檢查)，新鮮冷凍，并儲存在-80℃。在結(jié)腸鏡檢查之前或之后最少一周從健康個體和CRC患者抽血并獲得血清樣品。CRC的臨床診斷通過組織學(xué)分析證實，且結(jié)腸鏡檢查證實健康個體不具有任何結(jié)腸相關(guān)疾病。樣品為亞利桑那州(Arizona)的斯科茨代爾醫(yī)療保健中心(Scottsdale Medical Health Center)從2010年至2012年的歸檔樣品。從斯科茨代爾醫(yī)療保健中心的倫理委員會獲得研究的倫理學(xué)批準(zhǔn)。授予倫理批準(zhǔn)用于回顧性分析組織樣本。
血液樣品制備：將2ml血液收集在標(biāo)準(zhǔn)實驗室tiger-頂SST(血清分離管)管中。使具有樣品的管在室溫下直立放置，最少30分鐘，最多2小時。通過在室溫或4℃下以1300xg離心15分鐘而分離凝塊。取出血清并轉(zhuǎn)移至冷凍小瓶。通過將冷凍小瓶置于干冰中而立即快速冷凍樣品，然后將小瓶儲存在-80℃冰箱中，或進(jìn)行實驗方案的DNA提取。
血清DNA提?。菏褂肣iagen的QIAamp DNA血液試劑盒根據(jù)制造商的說明書(Qiagen,Valencia,CA)提取總DNA。簡而言之，200μl血清用于開始提取。對于該程序，遵循制造商的說明書。提取DNA之后，繼續(xù)亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化測定，或儲存在-80℃用于更長儲存。
亞硫酸氫鹽修飾和甲基化特異性實時PCR：使用Qiagen的EpiTect Bisulfite試劑盒(Qiagen,Gaithersburg,MD)將作為對照的來自細(xì)胞系的基因組DNA(500ng)和血液樣本(50ng)亞硫酸氫鹽修飾。CpGenome通用甲基化DNA和未甲基化DNAs(Chemicon International,Temecula,CA)用作陽性對照。通過使用Qiagen HotStar Taq PCR試劑盒和Roche 480熱循環(huán)儀(Roche,Indianapolis,IN)在受試者中的甲基化特異性PCR(MSP)分析啟動子甲基化。對于所有基因設(shè)計與修飾的甲基化DNA和修飾的未甲基化DNA兩者互補(bǔ)的PCR引物組(表3)。進(jìn)行四十五個循環(huán)的PCR(95℃15分鐘用于熱啟動；45個循環(huán)的95℃30秒，59℃30秒和72℃60秒)。β-肌動蛋白用作內(nèi)部對照。
統(tǒng)計分析：該研究以批次模式運(yùn)行，使用陽性和陰性對照用于每次DNA提取。數(shù)據(jù)收集包括提取后總基因組DNA的回收和實時PCR測量。所有PCR結(jié)果通過目視檢查PCR曲線進(jìn)行證實。每次PCR運(yùn)行包括校準(zhǔn)樣品和至少一種無模板對照樣品。通過使用二階導(dǎo)數(shù)法線性回歸交叉點值而從校準(zhǔn)曲線測定DNA濃度(標(biāo)志物的甲基化和未甲基化DNA)。對于臨床樣品，處理和分析來自128個癌癥病例(主要是I–IV期)和92個非癌癥對照的血清樣品。使用多種算法分析所得數(shù)據(jù)以計算優(yōu)化的靈敏度和特異性值。
實施例2–標(biāo)志物選擇
總之，評估通常從GenBanks、NCBI和Sanger的癌癥數(shù)據(jù)庫引用的多于800種癌癥標(biāo)志物。如本文公開的用于CRC生物標(biāo)志物概況的候選標(biāo)志物選擇基于包括但不限于癌性等位基因的頻率的發(fā)現(xiàn)、全基因組生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和關(guān)聯(lián)評分系統(tǒng)以及在發(fā)現(xiàn)過程中進(jìn)行的多次獨(dú)立鑒定實驗中開發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。為了解決面對CRC診斷的問題且為了使測試簡單而有效，在體液諸如血液中表現(xiàn)良好的標(biāo)志物是發(fā)現(xiàn)中的焦點之一。然而，血液中的基因組DNA主要被DNase降解。一些基因組區(qū)域更易受到DNase降解。例如，啟動子、增強(qiáng)子、抑制子、絕緣子和基因座控制區(qū)都已經(jīng)顯示與DNase高敏位點(DHS)相關(guān)。此外，基因的上游和下游2kb內(nèi)和第一外顯子、第一內(nèi)含子、CpG島和高度保守區(qū)域中檢測到DHS的富集。因此，如果基因或其部分處于那些可降解區(qū)域之一中，則其就血液樣品中生物標(biāo)志物的存在或不存在而言不是可靠的指示。此外，為了在基因標(biāo)志物內(nèi)選擇對于與CRC、CRC分期、和/或CRC易患性相關(guān)的甲基化狀態(tài)特異性的擴(kuò)增子用于基于PCR的甲基化測定，要求對于可靠性、重現(xiàn)性、靈敏度和特異性的甚至更嚴(yán)格的驗證。篩選后選擇PROM1、SARP1和MSF1。如本申請中公開的所選標(biāo)志物均在血液樣品中進(jìn)行驗證，以確保它們的存在和準(zhǔn)確度。開發(fā)多重PCR以測量單獨(dú)或與一種或多種其他標(biāo)志物組合的每種所選CRC標(biāo)志物。測試每種測定法的靈敏度和特異性。
實施例3-測定開發(fā)和驗證
如本申請中公開的所選標(biāo)志物均在血液樣品中進(jìn)行驗證，以確保它們的存在和準(zhǔn)確度。開發(fā)多重PCR以使用來自如表2中顯示的患者的血液樣品測量每種所選CRC標(biāo)志物?；跍y定中樣品、對照和測試組的臨床數(shù)據(jù)，在表3中提供和比較所述標(biāo)志物中的一種或兩種或三種的陽性率和特異性率。已顯示所有測定都具有滿意的靈敏度和特異性，范圍分別為約71％至約92％之間，和69％至95％之間。通常，所有具有兩種生物標(biāo)志物組合的測定的表現(xiàn)明顯好于任何基于單一生物標(biāo)志物的測定。PROM1/MSF1在所有兩種標(biāo)志物組合中具有最高的靈敏度和特異性，且與3種標(biāo)志物組合測定相當(dāng)?；谒腥N生物標(biāo)志物的測定提供了基于所提供的CRC生物標(biāo)志物概況的所有測定中的最好表現(xiàn)，具有高達(dá)92％的靈敏度和高達(dá)95％的特異性(參見表3)。
1.數(shù)據(jù)獲得自128個CRC患者和92個健康對照。
2.數(shù)據(jù)獲得自139個具有8種其他主要實體腫瘤的患者。
使用具有三種標(biāo)志物組合的測定測試為陽性的樣品在不同CRC階段間的分布顯示于表4中。
如表4中所示，使用任何三種生物標(biāo)志物的測定可以鑒定所有階段的CRC，包括早I期。此外，每個階段的測定結(jié)果在生物標(biāo)志物概況中的一種或多種基因的甲基化水平中具有可辨別的差異，其可以進(jìn)一步用于CRC分期。最令人驚訝地，所述測定還鑒定了對照組中的五個陽性受試者，他們基于臨床數(shù)據(jù)被認(rèn)為是健康的。在基于所述測定顯示陽性結(jié)果的五個健康受試者中，兩個受試者分別在測試后六個和九個月被診斷為CRC。這表明，如本文公開的測定可用于早期診斷，甚至在癌細(xì)胞形成和臨床可檢測之前的早期診斷。醫(yī)師跟進(jìn)其他3個測試陽性受試者的發(fā)展CRC的潛在較高風(fēng)險，其結(jié)果將可用于進(jìn)一步證實所述測定用于CRC早期診斷和預(yù)后的效率。在包含生物標(biāo)志物概況中的一種或多種基因的測定法下，沒有CRC易患性的健康個體在他們的血液樣品不具有甲基化的PROM1、SARP1或MSF1。
此外，已經(jīng)在8種其他主要癌癥中使用該測試，并觀察到7/139陽性患者，或95％的特異性，與其他報道的方法相比最高。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，本文所述的方法、組合物和產(chǎn)品代表示例性實施方案，并且不意欲作為對本發(fā)明范圍的限制。對于本公開技術(shù)人員將顯而易見的是，可以對本文公開的本公開內(nèi)容進(jìn)行各種置換和改變，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。
本說明書中提到的所有專利和出版物表明本公開涉及的領(lǐng)域中技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物通過引用并入本文，其程度等同于每個單獨(dú)出版物被具體且單獨(dú)地通過引用并入。
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