專利名稱：對(duì)作為癌癥治療特別是結(jié)腸直腸癌治療靶標(biāo)的磷脂酶a2的鑒定及其作用機(jī)制的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及組織樣品的體外分析測(cè)試，并且更加具體而言涉及癌 癥中基因表達(dá)方面。
背景技術(shù)：
"心血管疾病血漿多肽"(CPP)、 CPP的片段以^L翻譯后修飾的形式 以較低水平存在于患有冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)的個(gè)體血漿中.CPP是分泌的 因子，因此是容易檢測(cè)的并且可用于藥物開發(fā)、心血管疾病的診斷和預(yù)防. 參閱于2004年7月15日提出的PCT/EP2004/007842, "SECRETED POLYPEPTIDE SPECIES REDUCED IN CARDIOVASCULAR DISORDERS", GeneProt公司(瑞士，日內(nèi)瓦)在Ajfir漿中檢測(cè)到了磷脂 酶A2(PLA2)的片段并且合成了該片段，該肽被命名為GP—1221076 (還稱 作CPP-51或GPA071).
在本領(lǐng)域還需要關(guān)于磷脂酶A2及其片M血漿中的功能的額外信息。
發(fā)明簡(jiǎn)述
將分泌的磷脂酶A2，即GPA071肽注射人小鼠中。獲得了許多器官中 的基因表達(dá)鐠，令人驚奇地是，GPA071肽顯示出對(duì)肝臟中的基因表達(dá)調(diào)
節(jié)具有顯著的作用。所影響的基因是整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑、wnt途徑以及 PTEN途徑的成員。基因表達(dá)的改變通常預(yù)示著，GPA071肽和PLA2對(duì) 細(xì)胞的增殖和侵襲具有積極作用，經(jīng)基因注釋指向了結(jié)腸直腸癌。據(jù)我們 所知，這是第一次發(fā)現(xiàn)分泌的磷脂酶A2對(duì)整聯(lián)蛋白信號(hào)具有上游刺激作 用。
因此，本發(fā)明提供了多肽(分泌磷脂酶A2，如GPA071肽)用于制造治 療增殖性疾病或病癥，如癌癥，特別是結(jié)腸直腸癌的藥物的用途，
在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及治療增殖性疾病或病癥，如癌癥，特別 是結(jié)腸直腸癌的方法，其包括向患有疾病或病癥的包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物 施用有效量的如上所定義的多肽。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于增殖性疾病或病癥，如癌癥，特別是 結(jié)腸直腸癌的藥物組合物，其包含有效量的如上所定義的多肽以及可藥用 栽體。
在另一個(gè)方面，4^發(fā)明涉^L磷脂酶A2用作癌癥治療，特別是結(jié)腸直 腸癌治療靶標(biāo)的用途，
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
使用Velocegenomics方法(描述于2004年11月11日提出的 PCT/EP2004/012572， "USE OF ORGANIC COMPOUND"),將GPA071 肽注射人小鼠中。獲得了許多器官中的基因表達(dá)譜.令人驚奇地是， GPA071肽顯示出對(duì)肝臟中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)具有顯著的作用。所影響的基 因是整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑、wnt途徑以及PTEN途徑的成員。見表l。
表1
變化基因基因名稱
倍數(shù)
1.33Actnl輔肌動(dòng)蛋白，al
0.81Atf4激活轉(zhuǎn)錄因子4
0.74Atf5激活轉(zhuǎn)錄因子5
0.78Ape腺瘤性結(jié)腸息肉
0.82膜聯(lián)蛋白A7基因表達(dá)的改變通常預(yù)示著，GPA071肽和PLA2對(duì)細(xì)胞的增殖和侵 襲具有積極作用，經(jīng)基因注釋指向了結(jié)腸直腸癌.
Catnb聯(lián)蛋白j8
Cdl51CD151抗原
Ccl28趨化因子(C-C基序)配體28
Ccl9趨化因子(C-C基序)配體9
Crsp3Spl轉(zhuǎn)錄激活所需的輔因子，亞基3
Cttn皮層肌動(dòng)蛋白
Pscdlcytohesin 1 (血小板白細(xì)胞C激酶底物同系物，Sec7以及巻
曲結(jié)構(gòu)域1)
Dvlldishevelled, dsh同系物1 (Drosophila)
Dst肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白
FAK黏著斑激酶(PTK2蛋白質(zhì)酪氨酸激酶2)
IhhIndian hedgehog
IkbkgKB激酶抑制劑了
Ilk整聯(lián)蛋白偶聯(lián)激酶 B jSi 沾浙jS&
Ick Lifr鵬剤肥雙辨 白血病抑制因子受體
Madh4MAD同系物4 (Drosophila)
Mapkapk2MAP激酶活化的蛋白激酶2
MknklMAP激酶相互作用絲氨斷蘇氨酸激酶l
Mtal轉(zhuǎn)移相關(guān)1
BC024131轉(zhuǎn)移抑制基因1
Mapk8 Map3kl2絲裂原活化蛋白激酶8
絲^L^活化蛋白激酶激酶激酶12
Prkcl蛋白激酶C, X
Prkcl蛋白激酶C， X
Ppp2rla蛋白礴酸酶2(以前為2A),調(diào)節(jié)亞基A(PR65), a同種型
Arhuras同系物基因家族，成員U
5133400C09RikRIKEN cDNA 5133400C09基因
Sstr2促生長(zhǎng)素抑制素受體2
SoslSon of sevenless同系物1 (Drasfip/^/a)
Shcl包含src同系物2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)4t蛋白CI
Socs4細(xì)胞因子信號(hào)抑制蛋白4
Aktl胸腺瘤病毒原癌基因1
Tgfa轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子a
Tgm2轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2, C多舦
Usf2上游轉(zhuǎn)錄因子2
Crkv-crk肉瘤病毒CT10癌基因同系物(鳥類)
Crkv-crk肉瘤病4"CT10癌基因同系物(鳥類)
Wntll無翅相關(guān)MMTV整合位點(diǎn)11
9731583 1030058587382797 Jc^gp55f5^35SSJgg^s25ccnsis
磷脂酶A2多核苷酸和多肽的結(jié)構(gòu)是已知的。磷脂酶A2超家族信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)酶日益增加Dennis EA, Trends in Biochemical Sciences 22:1 (1997)。 從人血漿中分離的GPA071的肽序列(識(shí)別號(hào)GP_1221076)是
參閱于2004年7月15日提出的PCT/EP2004/007842， "SECRETED POLYPEPTIDE SPECIES REDUCED IN CARDIOVASCULAR DISORDERS"(在此引用作為參考)。所合成的124個(gè)氨基酸的小鼠 GPA071 的 肽 序 列 是
EDFICNCDREAAICFSKVPYNKEYKNLDTGKFC (SEQ ID NO:2)。
基于該基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A2通過活化黏著斑復(fù)合物和整聯(lián) 蛋白信號(hào)途徑而起作用。這可通過增加膽汁酸的釋放直接發(fā)生，反過來膽 汁酸激活了黏著斑激酶和下游信號(hào)事件，導(dǎo)致潛在的netto促增殖和促遷 移作用。Debruyne PR等，Oncogene 21(44): 6740-50 (2002年10月3日)。 在膽汁酸和整聯(lián)蛋白之間可能存在連接的證據(jù)由Haussinger D等， Gastroenterology 124(5): 1476-87 (2003年5月)證明。然而，基因表達(dá)的改 變可以源于補(bǔ)償性作用并且掩蓋了抗增殖作用(見下文)。體內(nèi)驗(yàn)證試驗(yàn)， 例如本文提供的那些試驗(yàn)是必需的。
通過注射GPA071影響到了結(jié)腸直腸癌所涉及的許多基因，例如P-聯(lián) 蛋白(參閱Waterman ML， Cancer Metastasis Rev. 23(1-2): 41-52 (2004年 1-6月))、APC、 wntll(腸癌)。雖然認(rèn)為分泌的磷脂酶A2可起到保護(hù)作用 避免患有結(jié)腸直腸肺瘤，但是磷脂酶A2還是將結(jié)腸直腸癌與APC信號(hào)連 接起來。Kennedy BP等，Cancer Res. 58(3): 500-3 (1998年2月1日)。
Velocegenomics方法描述于2004年ll月 11日提出的 PCT/EP2004/012572， "USE OF ORGANIC COMPOUND，，(在此引用作為 參考)中。以300、 600或1000 Mg/天的劑量向雄性C57BL/6小鼠皮下4吏用 肽(在這里為GPA071)7-14天。處理階段結(jié)束時(shí)，將來自所有器官的樣品 速凍并用GeneCWp⑧分析表達(dá)鐠。
使用TRIzol試劑(Life Technologies)并根據(jù)產(chǎn)品說明書從這些水凍組 織中提取總RNA。通過X = 260 nm (A260nm)的吸收將總RNA定量，并 且通過A260nm/A280nm比值評(píng)價(jià)純度。通過變性凝膠電永險(xiǎn)查完整性。 將RNA儲(chǔ)存于-80。C直至分析。使用Superscript Choice System (Life Technologies)將質(zhì)量好的總RNA合成雙鏈cDNA。然后，將cDNA體外轉(zhuǎn) 錄(MEGAscriptT" T7試劑盒，Ambion)形成生物素標(biāo)記的cRNA。接著， 將12-15 mg標(biāo)記cRNA與Affymetrix Mouse MOE430A表達(dá)探針列陣于 45°C雜交16小時(shí).然后按照EukGE-WS2方法(Affymetrix)洗滌陣列， 并用10mg/ml鏈霉親和素-藻紅蛋白綴合物(MolecularProbes)染色。用2 mg/ml乙?；疊SA (Life Technologies)、 100 mM MES、 1 M [Na+、0.05 % Tween20、 0.005 % Antiofoam (Sigma) 、 0,1mg/ml山羊IgG和0.5 mg/ml 生物素化抗體將信號(hào)放大，然后用鏈霉親和素溶液再次染色。洗滌后，用 GeneArray 掃描儀(Affymetrix)掃描陣列兩次。
通過將用給定的寡核苷酸探針對(duì)測(cè)量的信號(hào)強(qiáng)度的差異平均(AvgDiff 值)，來評(píng)估表達(dá)水平。在該研究中使用的圖像獲得和數(shù)字轉(zhuǎn)換軟件是 Affymetrix Microarray Suite第5版(MAS5)。為了鑒定受處理影響的基因， 在第一次波動(dòng)分析中將數(shù)據(jù)集初次過濾以排除其數(shù)值系統(tǒng)性地處于試驗(yàn)噪 音高情況下的低表達(dá)范圍(在許多次試驗(yàn)中AvgDiff值為50，對(duì)應(yīng)于任何試 驗(yàn)點(diǎn)的最小拷貝數(shù))的基因。在第二輪的選擇中，閾值t-檢驗(yàn)p4(0.05)基 于雙組M差模型(總體誤差模型(Global Error Model))并且(如果可能)使 用多假設(shè)檢驗(yàn)的逐步下I^^正(Benjamini和Hochberg 4^iL現(xiàn)率 )鑒定在 處理與非處理之間具有不同數(shù)值的基因.
然后使用Fisher，s精確檢驗(yàn)將所選擇的基因集與已經(jīng)建立的對(duì)于途徑
和細(xì)胞成分的基因集相比較。使用Venn圖表鑒定在不同的器官之間共同 的基因改變。高度相關(guān)基因的表達(dá)鐠用于使用幾種距離度量(標(biāo)準(zhǔn)，Pearson) 發(fā)現(xiàn)在各個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)具有相關(guān)改變的基因。
與如上所述統(tǒng)計(jì)學(xué)算法的結(jié)合以及與共同生物學(xué)主題所涉及的其它被調(diào)節(jié) 基因的關(guān)系。
如本文所使用，術(shù)語"多肽"指蛋白質(zhì)、肽、寡肽或合成寡肽。這些術(shù) 語可互換使用。這些術(shù)語中的任何一個(gè)是指通過肽鍵或酰胺鍵連接在一起 的兩個(gè)或多個(gè)M酸的鏈，而不管翻譯后的修飾如糖基化或磷酸化。多肽 還可以由一個(gè)以上的亞基組成，其中每一亞基由分開的DNA序列編碼。
本發(fā)明的多肽可包括具有SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的>11^^ 列的GPA071。本發(fā)明多肽還包括本發(fā)明多肽的功能活性多肽片段。如本 文所示，功能活性可通it^L模型系統(tǒng)中測(cè)量肽調(diào)節(jié)基因表達(dá)的活性，例如 通過Velocegeneomics方法來證明。如本文所使用，術(shù)語"生物活性的" 指分子引起或影響生物事件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，GPA071或其片 段的生物活性水平通過檢測(cè)表1中所列一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)水平來測(cè) 量。優(yōu)選地，確定表l中多數(shù)基因的表達(dá)。本發(fā)明的"生物活性多肽"包 括GPA071及其片段。還包括其絲紗列與GPA071及其功能活性片段 的同一性至少50%的同系物。
此種多肽片段意思是指這樣的多肽，即其M酸序列與本發(fā)明多肽的 M酸序列的部分(并非4^P)完全相同。此類多肽片段可以是"無支撐的" 或者可以是更長(zhǎng)多肽的部分，其中此類多肽部分形成了所述更長(zhǎng)多肽的一 部分或區(qū)域，最優(yōu)選作為單一連續(xù)區(qū)域。片段可以包含至少10個(gè)氨基酸、 優(yōu)選至少15、 20或25個(gè)氨基酸。更優(yōu)選地，片段包含至少30個(gè)氨基酸。 另一優(yōu)選片段包含至少40、 50、 60、 65、 70或75個(gè)#^酸.最優(yōu)選地， 片段包含SEQIDNO:l或SEQIDNO:2的12、 22、 32、 35、 39、 66、 72
此類多肽還可以是這樣的片段，例如通過蛋白酶如胰蛋白酶產(chǎn)生的水 解產(chǎn)物。本發(fā)明的多肽或多肽片段可包含SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2 的C末端片段。此C末端片段可包含C末端的至少IO個(gè)M酸、優(yōu)選至 少20或25個(gè)氨基酸、甚至更優(yōu)選至少30個(gè)M酸或者至少65、 70或75 個(gè)氨基酸。至少10個(gè)氨基酸可以包含最C末端的至少10個(gè)氨基酸。多肽 可包含SEQ ID NO:l或SEQ ID NO:2的至少32、 35、 39、 66、 72或75 個(gè)最C末端的M酸。片段還可包含內(nèi)部片段。
多肽還可以具有這樣的^^酸序列，即其與上述多肽如SEQIDNO:l 或SEQ ID NO:2中任意一個(gè)的^J^酸序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、 更優(yōu)選至少70%或80%并且最優(yōu)選至少卯％ ，如95%、 97%或99%的 同一'性。
氨基酸^在此以標(biāo)準(zhǔn)的單字母或三字母符號(hào)表示A (Ala)丙氨酸； C (Cys)半胱氨酸；D (Asp)天冬氨酸；E (Glu)谷氨酸；F (Phe)苯丙氨酸； G (Gly)甘氨酸；H (His)組氨酸；I (lie)異亮氨酸；K (Lys)賴氨酸；L (Leu)亮氨酸；M (Met)蛋氨酸；N (Asn)天冬跣胺；P (Pro)脯氨酸；Q (Gin)谷氨跣胺；R (Arg)精氨酸；S (Ser)絲氨酸；T (Thr)蘇氨酸；V (Val) 纈氨酸；W (Trp)色氨酸；Y (Tyr)酪氨酸.
用于比較參照序列和另一序列(即"候選"序列)的術(shù)語"同一性百分 比(％)"或相似術(shù)語意思是指兩個(gè)序列間的最佳比對(duì)，候選序列與相當(dāng)于 所指出百分比的亞單位位置中的參照序列相同，對(duì)于多核苷酸比較而言亞 單位為核苷酸，對(duì)于多肽比較而言為氨基酸，如本文所使用，所比較序列 的"最佳比對(duì)"是使亞單位間的匹配最大化和使建立比對(duì)時(shí)所采用缺口的 數(shù)量最小化的比對(duì)。同一性百分比可使用商業(yè)可得的運(yùn)算執(zhí)行工具確定， 如Needleman和Wunsch， J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)所述算法 (Wisconsin序列分析包中的"GAP，，程序，Genetics Computer Group, Madison, WI)。本領(lǐng)域中用于構(gòu)建比對(duì)和計(jì)算同一性百分比或其它的相似 性度量的其它軟件包包括"BestFit"程序，該程序基于Smith & Waterman,
Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)的算法(Wisconsin序列 分析包，Genetics Computer Group, Madison, WI)。同一性百分比還可 通過WU-BLAST-2產(chǎn)生。Altschul等，Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)。 WU-BLAST-2使用幾種搜索^lt，其中大多數(shù)^lt^L設(shè)置成默認(rèn) 值。將可調(diào)整的M設(shè)置成如下值重疊跨度=1，重疊片段=0.125，字開 端(T)-ll 。 M酸序列同 一性百分比通過匹配的相同殘基數(shù)量除以比對(duì)區(qū) 戎基總數(shù)確定。例如，為了得到具有與參照>^酸序列具有至少95%同一 性的MM列的多肽，在參照序列中，不多于5%的#^酸殘基被刪除 或者被另外的M酸取代，或者參照序列總^H基酸殘基中不多于5%的氨 基酸數(shù)量被插入到參照序列中。參照序列的這些改變可以發(fā)生在參照#* 酸序列的^J^末端或g末端位置或者這些末端位置間的任何位置，或者 單獨(dú)散布于參照序列的瓶基當(dāng)中，或者以一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)散步于參照 序列中。應(yīng)當(dāng)理解，在與本發(fā)明的參照序列比較過程中，候選序列可以是 較長(zhǎng)多肽或多核苷酸的組成成分或片段，并且以計(jì)算百分比同一性為目的 的此種比較可以相對(duì)于相關(guān)組成成分或片段開展。
本發(fā)明還包括本文所述的多肽或多肽片段的功能保守性變體。此類變 體可以^使用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生，例如通過保守M酸替代。 一般地，此 類替化lL Ala、 Val、 Leu和lie間的替代；Ser和Thr間的替^ ;酸性殘 基Asp和Glu間的替代；Asn和Gin間的替代；和堿性^t^ Lys和Arg 間的替代；或者芳香族殘基Phe和Tyr間的替代，特別優(yōu)選的是其中幾個(gè)、 5-10、 1-5或2個(gè)氨基酸以任意組合被取代、刪除或加入的變體.
在多個(gè)其它實(shí)施方案中，多肽或其片段或多肽變體或同系物可以是線 性的或分支的，其可包含修飾的氨基酸，其可被非氨基酸中斷，和/或其可 以裝配成一個(gè)以上多肽鏈的復(fù)合物。如本領(lǐng)域眾所周知，多肽可以是天然 修飾或者通過介入修飾；例如形成二硫鍵、糖基化、脂質(zhì)化、乙酰化、磷 酸化或任意其它操作或修飾，例如與標(biāo)記成分綴合。在一些實(shí)施方案中， 多肽或多肽片段包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等) 以及本領(lǐng)域已知的其它修飾。
本發(fā)明的多肽或多肽片段包括分離的天然存在多肽。優(yōu)選地，此天然
存在多肽在所選擇群體中的頻率為至少5%，最優(yōu)選至少10%。所選擇群 體可以是群體遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的任何認(rèn)可群體。優(yōu)選地，所選擇群體是高 加索人、黑人或亞洲人。更加優(yōu)選地，所選擇^^是法國(guó)人、德國(guó)人、英 國(guó)人、西班牙人、瑞士人、中國(guó)人、日本人、韓國(guó)人、華M加J^A、冰 島人、北美洲人、以色列人、阿拉伯人、土耳其人、希臘人、意大利人、 波蘭人、太平洋島人或印度人。
農(nóng)時(shí)重逸合成
本發(fā)明的多肽或其片段還包括重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽以及 此類本發(fā)明多肽和其片段的組合。制備此類多肽的方法在本領(lǐng)域眾所周知。 例如，本發(fā)明的多核苷酸片段或多肽可以從體液(包括但不限于血清、尿 和腹水)分離，所述體液或者通過化學(xué)或生物學(xué)方法合成(例如細(xì)胞培養(yǎng)、 重組基因表達(dá))。在本文中，如果沒有明確說明，"分離的"包括含義"從 共存材料中分離"。
本發(fā)明的重組多肽可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法從包含表達(dá)系統(tǒng)的 基因工程宿主細(xì)胞制備。因此，在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及通過重組技
術(shù)產(chǎn)生多肽，涉及包含編碼本發(fā)明多肽的一個(gè)或多個(gè)核酸的表達(dá)系統(tǒng)，涉 及用此類表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行基因工程^tit的宿主細(xì)胞，以及涉及分離多肽的方 法。
術(shù)語"核酸"意思是指天然的或半合成的或合成的或修飾的核酸分子。
苷酸序列、寡核苷酸或多核苷酸r這些術(shù)語旨在互換使用。RNA可以丄 tRNA (轉(zhuǎn)移RNA)、 snRNA (小核RNA)、 rRNA (核糖體RNA)、 mRNA (信 使RNA)、反義RNA和核酶形式。DNA可以是質(zhì)粒DNA、病毒DNA、 線性DNA、染色體或基因組DNA、 cDNA或者它們的衍生物。此外，這 些DNA和RNA可以是單鏈的、雙鏈的、三鏈的或四鏈的。術(shù)語還包括PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯和天然核酸磷酸主鏈的其它變體。
雜交反應(yīng)的"嚴(yán)*件"可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地確定，一 般是基于探針長(zhǎng)度、洗滌溫度以及鹽濃度進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)計(jì)算。通常，較長(zhǎng)的探 針需要較高的溫度來正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交一般 取決于已變性核酸與環(huán)境中的互4hM在大約但低于解鏈溫度下重新退火的
能力。探針與可雜交序列之間的同源性程;^逸高，可4吏用的相對(duì)溫度就越 高。結(jié)果，由此可見，較高的相對(duì)溫度將使反應(yīng)M更加嚴(yán)格，而較低的 溫度則使反應(yīng)條件嚴(yán)格程度較差。此外，嚴(yán)格性與鹽濃度成反比。"嚴(yán)格
條件"示例如下(l)洗滌時(shí)用低離子強(qiáng)度和高溫度條件，例如0.015 M氯 化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1。/。十二烷1^危酸鈉，50°C; (2)使用變性劑，例 如甲酰胺，例如50%(體積/體積)甲跣胺和0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液(pH 6.5)和750 mM氯 化鈉、75mM檸檬酸鈉，42°C。備選地，嚴(yán)M件可以是50%甲酰胺， 5xSSC(0.75MNaCl， 0.075 M檸檬酸鈉)，50 mM磷酸鈉(pH6.8)， 0.1% 焦磷酸鈉，5xDenhardt，s溶液，超聲降解的鮭精DNA (50 pg/ml)， 0.1% SDS 以及10%硫酸葡IMt， 42。C;于42。C在0.2xSSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)和 50%甲Sfe^， 55。C洗滌；接著用由包含EDTA的O.lxSSC組成的高嚴(yán)格 洗滌液于55°C洗滌。對(duì)于雜^應(yīng)嚴(yán)格性的額外細(xì)節(jié)和解釋參見Ausubel 等，Protocols in Molecular Biology (1995)。
多肽可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法在諸多表達(dá)系統(tǒng)中的任何系統(tǒng)中重組 表達(dá)。Ausubel等編，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley Sons, New York, 1990)。此類表達(dá)系統(tǒng)包括染色體、附加體和病桊時(shí)生 的系統(tǒng)，例如從細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母附加體、插入元件、酵 母染色體元件、病毒如桿狀病毒、乳多空病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、 禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病桊時(shí)生的載體，以及從它們的組合衍 生的病毒，例如從質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件衍生的那些栽體，例如粘粒和嗟 菌粒.
表達(dá)系統(tǒng)還包^節(jié)和引M達(dá)的控制區(qū)。 一般，可以使用能夠使核
酸在宿主中維持、增殖或表達(dá)以產(chǎn)生多肽的任何系統(tǒng)或載體。適宜的核苷
酸序列可以通過任何多種眾所周知的和常規(guī)的技術(shù)，如描述于Sambrook 等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.， 1989)中的那些插 入到表達(dá)系統(tǒng)中。通常，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入到適宜的限 制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。
載體成分一般包括但不限于一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)、 一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志基 因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子、信號(hào)序列或分泌序列以及轉(zhuǎn)錄終止序列。
表達(dá)載體可有兩個(gè)復(fù)制系統(tǒng)，因此允許其維持于兩種生物中，例如用 于表達(dá)的哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞中和用于克隆和擴(kuò)增的原核宿主中。眾所周 知多種細(xì)菌、酵母菌抹和病毒的此類序列。
優(yōu)選地，表達(dá)栽體包含用于篩選所轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的標(biāo)志基因。選擇基 因在本領(lǐng)域眾所周知并且隨著所使用的宿主細(xì)胞而變化。表達(dá)和克隆栽體 通常包M擇基因，其也稱作選擇標(biāo)記。 一般，選擇基因編碼(a)賦予抵抗 抗生物和其它毒素如氨節(jié)青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四環(huán)素的蛋白質(zhì)，
(b)補(bǔ)足營(yíng)養(yǎng)缺陷的蛋白質(zhì)，或者(c)供應(yīng)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物的蛋白質(zhì)，如D-丙氨 酸消旋酶基因。
啟動(dòng)子序列或者編碼組成型啟動(dòng)子，或者編碼誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子 可以是天然存在的啟動(dòng)子或者雜合啟動(dòng)子。雜合啟動(dòng)子組合了 一個(gè)以上啟 動(dòng)子的元件，其在本領(lǐng)域是已知的并且可用于本發(fā)明。此外，對(duì)于整合表 達(dá)栽體，表達(dá)載體包含至少一個(gè)與宿主細(xì)胞基因組同源的序列，優(yōu)選包含 位于表達(dá)構(gòu)建體側(cè)翼的兩個(gè)同源序列。通過將適宜同源序列插入到栽體中 可將整合栽體靶向宿主細(xì)胞的特定基因座。整合載體的構(gòu)建在本領(lǐng)域眾所 周知。
適宜分泌信號(hào)可整合到目的多肽中，允許多肽分泌至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、周質(zhì) 空間或細(xì)胞外環(huán)境中。這些信號(hào)可以4一相對(duì)多肽而言為內(nèi)源的，或者是外 源的。信號(hào)序列可以是選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸 毒素II前導(dǎo)序列的原核生物信號(hào)序列。對(duì)于酵母分泌，信號(hào)序列可以是例
如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、a因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)和克 魯維酵母酵母屬(KluyveromycesJa-因子前導(dǎo)序列)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系 統(tǒng)鐘，來自同一物種或相關(guān)物種的分泌多肽的哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒 分泌信號(hào)前導(dǎo)序列可用于指導(dǎo)肽、其變體或同系物的分泌。適宜的宿主細(xì) 胞包括酵母、細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌、以及昆蟲和動(dòng)物細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物 細(xì)胞，例如原代細(xì)胞，包括但不限于干細(xì)胞。適宜宿主的M性實(shí)例包括 細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌(E.coli)、鏈球菌屬(Streptococci)、葡萄球菌屬 (Staphylococci)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis); 真菌細(xì)胞，例如酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、其它酵母 細(xì)胞或曲霉屬(AspergiUus);昆蟲細(xì)胞，如果錄(Drosophila)S2和灰翅^M 屬(Spodoptera)Sf9細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、 COS、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293以及Bowes黑素瘤細(xì)胞；以及植物細(xì)胞.
可根據(jù)其調(diào)節(jié)所插入序列表達(dá)的能力或者以所希望的方式加工所表達(dá) 多肽的能力選擇宿主細(xì)胞株。此類多肽修飾包括但不限于乙跣化、g化、 糖基化、磷酸化、脂質(zhì)化和酰基化。剪切"前多肽原"形式的翻譯后加工 對(duì)于正確的插入、折疊和/或功能也是重要的。
轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞包括但不限于用重組噬菌體、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化的微生物如細(xì)菌；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；和用重組昆蟲病 毒(例如桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。
用于肽表達(dá)的適當(dāng)條件會(huì)隨著表達(dá)栽體和宿主細(xì)胞的選擇而變化，并 且可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易地確定。例如，在表達(dá)栽體中使 用組成型啟動(dòng)子會(huì)要求對(duì)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖進(jìn)行優(yōu)化，而使用可誘導(dǎo) 啟動(dòng)子則需要用于誘導(dǎo)的適當(dāng)生長(zhǎng)糾.此外，在一些實(shí)施方案中，重要 的是收獲時(shí)機(jī)。與昆蟲細(xì)胞一同使用的桿狀病毒系統(tǒng)是裂解病毒，因此收 獲時(shí)機(jī)的選擇對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)量而言是至關(guān)重要的。
目的GPA071肽片段不但可以通過重組方法直接產(chǎn)生，而且還可以作 為與異源多肽的融合多肽產(chǎn)生.此類異源多肽一般置于GPA071肽或其片 段的^^末端或^末端，并且提供了用于抗標(biāo)簽抗體選擇性結(jié)合的表位
標(biāo)簽。因此，此標(biāo)簽使得能夠通過使用抗標(biāo)簽抗體或者其它類型的結(jié)合表
位標(biāo)簽的親和基質(zhì)容易地純化肽或其片段。表位標(biāo)簽的實(shí)例是6xHis或 c-myc標(biāo)簽。備選地，GPA071肽或其片段可以以例如GST融合蛋白的形 式表達(dá)。適當(dāng)?shù)臉?gòu)建體一般為本領(lǐng)域已知并且可從商業(yè)供應(yīng)商如 Invitrogen (San Diego， Calif.，美國(guó))、Stratagene (La Jolla， Calif.，美國(guó))、 Gibco BRL (Rockville, Md.，美國(guó))或Clontech (Palo Alto， Calif.,美國(guó)) 獲得。
差厲4迷付一估
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)直接評(píng)估樣品中的基因表達(dá)，
印跡(檢測(cè)DNA) 、 Northern印跡(確定mRNA的轉(zhuǎn)錄)、斑點(diǎn)印跡(DNA 或RNA)或原位雜交。備選地，在分析中可以使用抗體來檢測(cè)核酸，例如 特異雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體和DNA-RNA雜合雙鏈體或 DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。此類抗體可以是標(biāo)記的，并且在雙鏈體結(jié)合至一個(gè)表 面的情況下進(jìn)行分析，因此當(dāng)在表面上形成雙鏈體時(shí)，可以檢測(cè)結(jié)合至雙 ^:體的抗體的存在。M地，基因表達(dá)可通過細(xì)胞或組織切片的免疫組織
的表達(dá)。用于此類免疫分析法的抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體， 并且可以針對(duì)天然磷脂酶A2序列或者基于本文所提供DNA序列的 GPA071片段制備。
摩或這蛋^^時(shí)趟必
所表達(dá)GPA71或GPA71片段可以在表達(dá)后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的多種方法中的任何方法純化或分離。合適的技術(shù)會(huì)取決于GPA71或 GPA71片段的表達(dá)方式而改變。多肽可以例如以分泌蛋白質(zhì)的形式從培養(yǎng) 基回收或者從宿主細(xì)胞裂解液回收.可通過多種物理或化學(xué)手段破壞細(xì)胞， 例如凍融循環(huán)、超聲、；Wfe破壞或使用細(xì)胞裂解劑，而膜結(jié)合的多肽可以
使用適宜去污劑溶液(例如Triton-X 100)或酶解從膜中釋放。用于多肽純化 或分離的適宜技術(shù)也會(huì)取決于樣品中存在什么樣的其它成分而變化。所需 要的純化程度也取決于GPA71或其片段的使用而變化。通過分離或純化 去除的污染物成分是一般干擾多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，包括酶、激 素及其它溶質(zhì)。所選擇的純化步驟會(huì)取決于例如所使用的產(chǎn)生過程的性質(zhì) 和所產(chǎn)生的特定片段。
通常，分離的GPA071或其片殺:會(huì)通過至少一個(gè)純化步驟制備。用于 純化的眾所周知的方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽離子 交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、高效液相色譜、羥磷灰 石色語和凝集素層析。最優(yōu)選地，采用親和層析用于純化。還可使用超濾 和透析以;5U目關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)濃縮。參閱例如，Scopes R， Protein Purification (Springer-Verlag， New York, N.Y., 1982)。在分離或純化過程中多肽變 性的情況下，可使用用于蛋白質(zhì)重折疊的眾所周知的技術(shù)再生活性構(gòu)象。
摩衷這,農(nóng)付標(biāo)記
可以標(biāo)記本發(fā)明的核酸、蛋白質(zhì)和抗體。本文所說的"標(biāo)記的"意思 是指化合物至少具有連接的一個(gè)元件、同位素或化合物使得能夠檢測(cè)化合 物。通常，標(biāo)記為一下三類a)同位素標(biāo)記，其可以是放射性的或者重金 屬同位素；b)免疫標(biāo)記，其可以是抗體或者抗原；以及c)生色或熒光染料。
位置中。
^發(fā)的^夢(mèng),蘭
多肽或其片段不但通過重組方法產(chǎn)生，而且還可使用本領(lǐng)域眾所周知 的化學(xué)方法產(chǎn)生。固相肽合成可以在分批或連續(xù)流動(dòng)加工過程中開展，其 中在該過程中通過連接基團(tuán)向不溶性多肽支持物相繼加入a-M和側(cè)鏈保 護(hù)的氨基酸n。連接基團(tuán)如甲胺衍生化聚乙二醇連接至聚(苯乙烯-共-二乙烯苯)形成支持物樹脂。氨基酸殘基是被酸敏感Boc(叔丁氧^S0或堿
敏感Fmoc(9-藥甲氧aiO進(jìn)行N 保護(hù)的。被保護(hù)氣基酸的氣基與連接基 團(tuán)的胺偶聯(lián)，將殘1^錨定在固相支持物樹脂上。三氟乙酸或腺吱分別用于 去除Boc或Fmoc保護(hù)基。使用偶聯(lián)劑或預(yù)先活化的M酸衍生物，將每 一個(gè)額外JtJ^酸加入到錨定殘基上，洗滌樹脂。通過連續(xù)的脫保護(hù)、衍生 化氨基酸的偶聯(lián)以及用二氯曱烷和/或N，N-二甲基曱酰胺洗滌合成全長(zhǎng)肽。 在肽羧基端和連接基之間將肽水解下來，得到肽酸或酰胺。Novabiochem 1997/98 Catalog and Peptide Synthesis Handbook (San Diego ， Calif.)第 S1-S20頁。還可在機(jī)器如ABI431A肽合成儀(Applied Biosystems)上自動(dòng)
合成。多肽或其片段可以是通過制備型高效、;M目色譜純化的，并且其組成
成分是通過^^酸分析或測(cè)序證實(shí)的(Creighton T.E. Proteins, Structures and Molecular Properties (W H Freeman) ，New York N.Y.， 1984)。
在多種環(huán)境中天然多肽的變體是期望的。例如，某些變體可能會(huì)降低 不良副作用，特別是當(dāng)與副作用活性相關(guān)的部分與多肽的目的活性部分不 同時(shí)。在一些表達(dá)系統(tǒng)中，天然多肽易受蛋白酶的降解。在此情況下，所 選擇的改變易感序列的氨基酸的替代和/或缺失可明顯增加產(chǎn)量。通過消除 對(duì)氧化、?；?、烷基化或其它化學(xué)修飾敏感的氛基酸，變體還可以提高 純化過程的產(chǎn)量和/或提高蛋白質(zhì)的貨架期。優(yōu)選地，此類變體包括(i)構(gòu)象
中性的改變，即將它們?cè)t:計(jì)成與天然多^M目比變體多肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化最 小，以及(ii)抗原性中性的改變，即將它們?cè)O(shè)計(jì)成與天然多W目比變體多肽 的抗原決定簇變化最小。
本Jt坊麟,途
可根據(jù)本發(fā)明將上述多肽用于制造治療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病 癥、特別是癌癥、更加特別是結(jié)腸直腸癌的藥物。
本發(fā)明的另一方面提供了用于治療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的方 法，所述方法包括向患有疾病或病癥的包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物施用有效量
的多肽，其中多肽選自a) GPA71 (SEQ. ID NO:l或SEQ ID NO:2)或 GPA71片段；b)與(a)中任意一個(gè)多肽的^J^^列具有至少50%同一性
的生物活性多肽；或者c)(a)或(b)的任意一個(gè)多肽的生物活性變體。因此， 可以施用如上所述的多肽。多肽優(yōu)選包含GPA71或其片段。
用于治療目的的"哺乳動(dòng)物"指作為哺乳動(dòng)物(包括人、家養(yǎng)動(dòng)物和農(nóng) 場(chǎng)動(dòng)物)以及動(dòng)物園動(dòng)物、體育動(dòng)物或?qū)櫸飫?dòng)物(例如狗、馬、貓、綿羊、 豬、牛等)分類的任何動(dòng)物。優(yōu)選地，哺乳動(dòng)物是人。
術(shù)語"治療"指治療性治療和預(yù)防性或防御性措施。需要治療者是已 經(jīng)患有疾病或者預(yù)防其發(fā)生疾病的那些。
"疾病"或"病癥"是將從上面所定義以及下面進(jìn)一步定義的GPA71 或GPA71片段受益的任何狀況。這包括慢性和急性疾病和病癥，以及傾 向于所述疾病或病癥的那些病理狀況。
病，特別是癌癥，并且更加特別地是結(jié)腸直腸癌。過度增殖疾病的實(shí)例包 括但不限于位于下列部位的腫瘤結(jié)腸、腹、骨、乳房、消化系統(tǒng)、肝臟、 胰腺、腹膜、內(nèi)分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、 甲狀腺)、眼、頭頸部、神經(jīng)(中樞和外周)、淋巴系統(tǒng)、骨盆、皮膚、軟組 織、脾、胸和泌尿生殖器。其它過度增殖性疾病、紊亂和/或病癥包括但不 限于高丙種球蛋白血癥；淋巴增生性疾病、紊亂和/或病癥；副球蛋白血 癥；紫癜；結(jié)節(jié)??；塞澤里綜合癥；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；戈謝?。?組織細(xì)胞增多病.其它過度增殖性疾病是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
在本發(fā)明的另一方面，GPA71或GPA71片段作為適宜治療細(xì)胞過度 增殖相關(guān)疾病或病癥的治療劑提供，所述治療包括向患有該疾病的包括人 在內(nèi)的哺乳動(dòng)物施用有效量的GPA71或其片段。
藥物組合物可用于前述治療方法中。此類組合物優(yōu)選是無菌的并M 適宜向患者施用的單位重量或體積內(nèi)包含用于誘導(dǎo)目的反應(yīng)的有效量的 GPA71或其片段或者編碼多肽或其片段的核酸.
GPA71或其片段、化合物或藥物組合物的"有效量"是足以產(chǎn)生有利 結(jié)果或目的結(jié)果，包括如細(xì)胞增殖性疾病的臨床結(jié)果的量。此量也將取決 于健康從業(yè)者已知的待治療特定病癥、病癥的嚴(yán)重性、各個(gè)患者>#*包括
年齡、身體狀況、個(gè)體大小和體重、治療持續(xù)時(shí)間、同時(shí)治療(如果有的話) 的種類、特定施用途徑等因素。這些因素是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周 知的，并且僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)即可找到。
有效量可一次施用或者多次施用，并且可以與或不與另一藥物、化合 物或藥物組合物聯(lián)合施用達(dá)到。因此，在施用一種或多種治療劑的情況下 可以考慮"有效量"，并且如果單一藥劑與一種或多種其它藥劑聯(lián)合實(shí)現(xiàn) 了目的結(jié)果，則認(rèn)為所給出的單一藥劑的量是有效量。
有效量的包含單獨(dú)的本發(fā)明多肽或者包含本發(fā)明多肽以及其它藥物、
化合物或藥物組合物的GPA71或GPA71片段或者藥物組合物可通過任何 常規(guī)途徑施用，包括注射或者隨時(shí)間逐漸灌注。施用可以是例如口服、靜 脈內(nèi)、皿內(nèi)、肌內(nèi)、腔內(nèi)、皮下、局部或經(jīng)皮施用。
當(dāng)施用時(shí)，本發(fā)明的藥物組合物以可藥用制刑的形式施用。如本文所 使用的術(shù)語"可藥用栽體"意思是指適宜向包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物施用的 一種或多種兼容的固體或液體填充物、稀釋劑或包封物質(zhì)。術(shù)語"栽體" 表示活性成分與之結(jié)合以利于使用的天然或合成的有機(jī)或無機(jī)成分。
術(shù)語"可藥用"意思是指不干擾活性成分的生物學(xué)活性效力的無毒物 質(zhì)。此制劑可常規(guī)包含可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、兼容的載體、 輔助免疫增強(qiáng)劑如佐劑和細(xì)胞因子以及任選的其它治療劑。
在醫(yī)藥中使用的鹽應(yīng)該是可藥用鹽，但是非藥用鹽可常規(guī)用于制備可 藥用鹽，因此并不排除在本發(fā)明范圍之外。
藥物組合物可以包含適宜的緩沖劑，包括鹽中的醋酸、鹽中的檸檬酸、 鹽中的硼酸以及鹽中的磷酸.
藥物組合物還可任選包含適宜的防腐劑，例如勤L氯銨、氯丁醇、對(duì) 羥基苯甲酸酯和硫柳汞。
向受試者施用的多肽或編碼多肽的核酸的劑量可以仿i&不同的參數(shù)選 擇，特別是依據(jù)所施用的方式和受試者的狀態(tài)選擇。其它因素包括目的治 療階段。在所應(yīng)用的最初劑量不足以使受試者產(chǎn)生反應(yīng)的情況下，可應(yīng)用 患者耐受所允許的較高的劑量(或者是通過更加局部化的不同遞送途徑施
用的有效的較高劑量)。
藥物組合物常規(guī)為單位劑量形式，并且可以通過藥劑學(xué)領(lǐng)域眾所周知 的4壬意方法制備。所有方法均包括將活性劑與構(gòu)成一種或多種輔助成分的 栽體混合的步驟。通常，將活性化合物與液體栽體、細(xì)碎固體栽體或者兩 者均一且均勻地混合然后(如果需要)將產(chǎn)品成型來制備組合物。
適宜口月Mfe用的組合物可以是不連續(xù)的單位形式，例如膠嚢劑、片劑、 錠劑，其中每一種包含預(yù)定量的活性化合物。其它組合物包括水液體或非 水液體混懸劑，例如糖漿劑、酏劑或乳劑。
適宜腸胃外施用的組合物包括多肽或編碼多肽的核酸的無菌水制劑或 無菌非水制劑，其優(yōu)選地與接受者的血液是等滲的。該制劑可以根據(jù)眾所 周知的方法使用適宜分軟劑或潤(rùn)濕劑以及混懸劑配制。無菌注射制劑還可
以是無毒的腸胃外用稀釋劑或溶劑中的無菌注射溶液或混懸液，如1，3-丁 二醇溶液?？梢圆捎玫目捎妹浇槲锖腿軇┦撬inger，s溶液和氯化鈉溶 液。此外，無菌的非揮發(fā)油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。對(duì)于該目的，可采 用任何刺激性小的不揮發(fā)油，包括合成的單或雙甘油酯。此外，脂肪酸如 油酸可用于制備注射劑。
適宜口服、皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)等施用的栽體制劑可在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. ， Easton, PA.)中找到。
本發(fā)明的另一方面提供了細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的預(yù)后或診斷 方法，包括檢測(cè)來自幹*斷受試者的生物學(xué)樣品中的GPA71或其片段水 平，其中水平改變預(yù)示者存在細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥，本發(fā)明的一 個(gè)實(shí)施方面提供了對(duì)受試者中細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的預(yù)后或診斷 方法，包括步驟(i)檢測(cè)來自受試者的生物學(xué)樣品中的GPA71或其片段的 水平，得到第一個(gè)數(shù)值；和(ii)將第一個(gè)數(shù)值與來自無疾病或無病癥受試 者的GPA71或其片段的水平相比較，其中與來自無疾病受試者樣品中的 GPA71或其片段的水平相比，來自受試者的生物學(xué)樣品中GPA71或其片 段水平的改變預(yù)示者受試者易患或者患有細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥，
此類生物學(xué)樣品包括血液、血漿或組織樣品.適宜的組織樣品包括全
血、精液、唾液、眼淚、尿、排泄物、汗、口腔涂片、皮膚、特定器官組 織如肌肉、腦或神經(jīng)組織的活組織檢查以及毛發(fā)。最優(yōu)選地，適宜的生物 學(xué)樣品包括血液或血漿。組織樣品還包括從此生物學(xué)樣品中分離的細(xì)胞和
多種類型細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，GPA71或其片段水平的改變 包括與未患有細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的個(gè)體血漿中本發(fā)明GPA71 或GPA71片段水平相比，GPA71或其片段的血漿水平提高.提高優(yōu)選至 少1.2倍、更優(yōu)選至少1.5倍、2倍、3倍、5倍或10倍。
根據(jù)進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的預(yù) 后或診斷方法，包括i)檢測(cè)自受試者得到的適宜組織樣品中至少一個(gè)在圖 1中所確定基因的表達(dá)水平，得到第一個(gè)數(shù)值；和ii)將第一個(gè)數(shù)值與來 自無疾病受試者的所述基因的表達(dá)水平相比較，其中與來自無疾病受試者 的樣品相比，受試者樣品中表達(dá)水平更高或更低預(yù)示者受試者易患或者患 有細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥.基因表達(dá)可在mRNA或蛋白質(zhì)水平檢 測(cè)。適宜的組織包括但不限于肝臟、心臟、腸如十二指腸、脾、骨號(hào)。MRNA 表達(dá)水平可以通過任何適宜技木險(xiǎn)測(cè)，例如微陣列分析、Northern印跡分 析、反轉(zhuǎn)錄PCR以及實(shí)時(shí)定量PCR。同樣，蛋白質(zhì)水平可通過任何適宜 技本險(xiǎn)測(cè)，例如通過利用蛋白質(zhì)特異性標(biāo)記探針的western印跡。
在上述方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，基因選自表l所列的被上調(diào)或下調(diào)的 基因。優(yōu)選地，基因選自表1所列的上調(diào)1.2倍或更高、1.3倍或更高或者 1.5、 1.7、 1.8、 1.9倍或更高的基因；或者選自表1所列的下調(diào)0.8倍或更 低、0.7倍或itf氐或0.6倍或更低的基因。在上述方面的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方 案中，測(cè)量了至少1、 2、 3、 4、 5、 10、 20、 30個(gè)基因的表達(dá)。在本發(fā)明 的另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)量了選自表l的至少40、 50或60個(gè)基因的表達(dá)。 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，確定了選自表l的大多數(shù)基因的表達(dá)，例如 確定了至少65、 70、 80、 90、 IOO或至少110個(gè)或者表1所列4^P基因的 表達(dá)，
本發(fā)明的另一方面提供了鑒定細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的調(diào)節(jié)物 的方法，包括步驟i)將測(cè)試化合物與GPA71或其片段在允許發(fā)揮GPA71
或GPA71片段的至少一種生物學(xué)活性的樣品條件下接觸；ii)測(cè)定GPA71 /GPA71片段的所述至少一種生物學(xué)活性水平；iii)將所述水平與缺乏所述 測(cè)試化合物的對(duì)照樣品的水平相比較。在優(yōu)選實(shí)施方案中，選擇導(dǎo)致所述 水平變化的所述測(cè)試化合物，進(jìn)一步測(cè)試其能否作為預(yù)防性和/或治療性治 療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的GPA71或GPA71片段調(diào)節(jié)物。在優(yōu)選 的實(shí)施方案中，通過檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)或者多數(shù)個(gè)基因，如表l所列的至少 61、 70或100個(gè)基因的表達(dá)水平，測(cè)量GPA71或GPA71片段的生物學(xué)活 性水平。
細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的調(diào)節(jié)物的實(shí)例包括但不限于反義核苷 酸、核酶、雙鏈RNA和拮抗劑。
至少一個(gè)編碼本發(fā)明多肽的核酸的"雙鏈RNA"，即正義-反義RNA 可用于干擾至少一個(gè)所公開基因的表達(dá)。已經(jīng)在多種生物中表現(xiàn)出通過雙 鏈RNA千擾內(nèi)源基因的功能和表達(dá)，例如秀麗隱桿線蟲(C. elegans)，如 Fire等，Nature 391: 806-811 (1998)中所述；果蠅，如Kennerdell等，Cell 95(7): 1017-1026 (1998)中所述；以及小鼠胚胎，如Wianni等，Nat. Cell Biol. 2(2): 70-75 (2000)所述。此雙鏈RNA可以如下合成以兩個(gè)方向從^t板上 體外轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA，將有義鏈和反義鏈RNA體外退火，雙鏈RNA還 可從cDNA栽體構(gòu)建體合成，其中以相反的方向?qū)⒛康幕蚩寺∪霕?gòu)建體 中，通過倒轉(zhuǎn)重復(fù)隔開。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞之后，RNA被轉(zhuǎn)錄并且互#^重新退 火。
術(shù)語"拮抗劑"指當(dāng)結(jié)合本發(fā)明多肽或其片段時(shí)降低或抑制所述多肽 的至少一種生物學(xué)活性的分子。拮抗劑可以包括但不限于肽、蛋白質(zhì)、糖 類和小分子。
在特別有用的實(shí)施方案中，拮抗劑是磷脂酶A2特異性抗體?？贵w還 可綴合試劑，如化學(xué)治療劑、放射性核素、蓖麻毒蛋白A鏈、霍亂毒素、 百曰咳毒素等，并且還可作為靶向劑起作用。
在另一實(shí)施方案中，拮抗劑用作治療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥， 如癌癥，更加特別地是結(jié)腸直腸癌的治療劑。
術(shù)語"分離的"核酸分子意思是指核酸分子離開其最初環(huán)境(例如，天 然環(huán)境(如果其是天然存在的話))。例如，不分離天然存在的核酸分子，而 是分離與天然系統(tǒng)中的 一些或全部共存物質(zhì)分開的同 一核酸分子，即便是 隨后再將其引入天然系統(tǒng)中也是如此。此類核酸分子可以是栽體的部分或
者組合物的部分，并且仍然是分離的，因?yàn)榇溯d體或組合物不是其天然環(huán) 境的部分。
關(guān)于用核酶或雙鏈RNA分子進(jìn)行治療，方法包括施用治療有效量的 編碼核酶或雙鏈RNA分子的核苷酸序列，其中編碼核酶/雙鏈RNA分子 的核苷酸序列具有降低GPA71或其片段轉(zhuǎn)錄/翻譯的能力。
包含反義核苷酸、編碼核酶的核普酸序列、雙鏈RNA的分離的核酸 分子或者拮抗劑的"治療有效量"是這些治療劑足以治療細(xì)胞過度增殖相 關(guān)疾病或病癥的量。
對(duì)治療有效量的確定是本領(lǐng)域技術(shù)人員力所能及的，對(duì)于任何治療劑， 可以在細(xì)胞培養(yǎng)分析中或者動(dòng)物模型中，通常為小鼠、兔、狗或豬中初步 評(píng)估.動(dòng)物模型還可用于確定合適的濃度范圍以及施用途徑，然后，此類 信息可用于確定向人施用時(shí)的劑量和途徑。
對(duì)于治療應(yīng)用，反義核普酸、編碼核酶的核苷酸序列、雙鏈RNA(不 管是包在脂質(zhì)體中還是位于病毒栽體上)以及抗體優(yōu)選作為包含治療劑和 一種或多種可藥用栽體的藥物組合物施用。組合物可單獨(dú)施用，或者與至 少一種其它試劑如穩(wěn)定化合物一起施用，其可以在任何無菌的生物相容性 藥物栽體中施用，所述栽體包括但不限于鹽、緩沖鹽、葡萄糖和水。組合 物可以單獨(dú)向受試者施用，或者與其它試劑、藥物或激素組合向受試者施 用，
本文引用的所有參考文獻(xiàn)在此全文引用作為參考并適用于任何目的， 這與每一單獨(dú)出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)被明確且單獨(dú)指出全文引用作為參 考并適用于任何目的相同。
本申請(qǐng)不限于本申請(qǐng)所述的特定實(shí)施方案，這些實(shí)施方案旨在單個(gè)說 明本發(fā)明的各個(gè)方面。在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可對(duì)本發(fā)
明做出許多修改和改變，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。根據(jù) 前述描述，除了本文所列舉的那些之外，本發(fā)明范圍內(nèi)的功能等效方法和 裝置對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。此類修改和改變處于后附權(quán) 利要求書范圍內(nèi)。本發(fā)明僅通過后附權(quán)利要求書以及此權(quán)利要求的全部等 效范圍來限制。
權(quán)利要求
1.GPA071多肽用于制造治療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的藥物的用途，其中多肽包含具有選自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2的序列的肽或其生物活性片段。
2. 權(quán)利要求l所述多肽的用途，其中細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥是 癌癥。
3. 權(quán)利要求2所述多肽的用途，其中細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥是 結(jié)腸直腸癌。
4. 治療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的方法，包括向患有細(xì)胞過度增 殖相關(guān)疾病或病癥的哺乳動(dòng)物施用有效量的多肽，所述多肽包含具有選自 SEQIDNO:l、 SEQIDNO:2的序列的肽或其生物活性片段。
5. 權(quán)利要求4所述的方法，其中細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥是癌癥。
6. 權(quán)利要求4所述的方法，其中細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥是結(jié)腸 直腸癌。
7. 權(quán)利要求4所述的方法，其中靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、口服或局部 施用有效量的多肽。
8. 對(duì)受試者中細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的預(yù)后或診斷方法，包括 步驟(i) 檢測(cè)來自受試者的生物學(xué)樣品中的GPA71或其片段的水平， 得到第一個(gè)數(shù)值；和(ii) 將第一個(gè)lt值與來自無疾病或無病癥受試者的GPA71或其片 段的水平相比較，其中與來自無疾病受試者樣品中的GPA71 或其片段的水平相比，來自受試者的生物學(xué)樣品中GPA71或 其片段水平的改變預(yù)示者受試者易患或者患有細(xì)胞過度增殖相 關(guān)疾病或病癥。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中生物學(xué)樣品是血漿.
10. 權(quán)利要求8所述的方法，其中檢測(cè)表1所確定的一個(gè)或多個(gè)基因 的表達(dá)水平。
11. 權(quán)利要求8所述的方法，其中檢測(cè)表1所確定的大多l(xiāng)tt因的表 達(dá)水平。
12. 鑒定細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的調(diào)節(jié)物的方法，包括步驟(i) 將測(cè)試化合物與GPA71或其片段在允許發(fā)揮GPA71或 GPA71片段的至少一種生物學(xué)活性的樣品條件下接觸；(ii) 測(cè)定GPA71或GPA71片段的所述至少一種生物學(xué)活性水 平；(iii) 將所述水平與缺乏所述測(cè)試化合物的對(duì)照樣品的水平相比較； 和(iv) 選擇導(dǎo)致所述水平變化的測(cè)試化合物，進(jìn)一步測(cè)試其能否作為預(yù)防性和/或治療性治療細(xì)胞過度增殖相關(guān)疾病或病癥的GPA71調(diào)節(jié)物。
13. 權(quán)利要求12所述的方法，其中通過確定表l所列一個(gè)或多個(gè)基 因的表達(dá)水平測(cè)量GPA71或GPA71片段的生物學(xué)活性水平。
14. 權(quán)利要求12所述的方法，其中檢測(cè)表1所確定的大多l(xiāng)t^因的 表達(dá)水平。
全文摘要
已經(jīng)在人血漿中檢測(cè)到并且合成了磷脂酶A2的肽。將肽注射入小鼠，并且開展了許多器官的基因表達(dá)譜分析。磷脂酶A2對(duì)肝臟中基因表達(dá)的調(diào)節(jié)具有顯著作用。所影響的基因是整聯(lián)蛋白信號(hào)途徑、wnt途徑以及PTEN途徑的成員?；虮磉_(dá)的改變通常預(yù)示著，磷脂酶A2對(duì)細(xì)胞的增殖和侵襲具有積極作用，經(jīng)基因注釋指向了結(jié)腸直腸癌。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101102790SQ200680002407
公開日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2006年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日
發(fā)明者A·舍爾, R·帕波顏 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司