專利名稱：：體外診斷結(jié)腸直腸癌的埃茲蛋白測定方法體外診斷結(jié)腸直腸癌的埃茲蛋白測定方法本發(fā)明涉及癌學(xué)領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明提供了通過確定取自患者的生物學(xué)樣品中埃茲蛋白的存在而體外診斷人類患者中的結(jié)腸直腸癌的方法，所述方法可用于早期診斷、篩選、治療隨診以及預(yù)后，還可用于結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)診斷。結(jié)腸直腸癌(CRC)是主要的公共健康問題。據(jù)估計1996年其在世界范圍的新發(fā)病例為875000例^考慮到男女性別，其是最常在西方國家發(fā)生的癌癥，其通常被分類為癌癥所致死亡的前3個主要因素之一?？紤]到所有階段，5年存活率在60%范圍內(nèi)。只有早期診斷才能賦予治愈性治療的希望。然而，目前還沒有血清學(xué)篩選檢驗(yàn)，也沒有早期特異性診斷檢驗(yàn)方法。目前在歐洲使用兩種不同方法篩選結(jié)腸直腸癌首先，使用臨床異常性(paraclinical)檢驗(yàn)，其包括檢查糞便中是否存在血(FaecalOccultBloodTest-FOBT，例如以Hemoccult名稱銷售)。已經(jīng)證實(shí)這個技術(shù)的臨床實(shí)用性。當(dāng)每2年對在50-74歲之間的個體使用該技術(shù)時，可以使結(jié)腸直腸癌導(dǎo)致的死亡率降低15-20%2。為此，一半以上的人群必須定期參與篩選，且必須對陽性檢驗(yàn)事件進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，任選隨后進(jìn)行適當(dāng)治療。然而，這種篩選技術(shù)具有如下一些不利之處這個檢驗(yàn)的主要缺點(diǎn)是其特別是對于腺瘤(癌前異常增生(dysplastic)病變)的靈敏性較差，如果腺瘤較大，將導(dǎo)致1/10的病例發(fā)展為癌癥。這個檢驗(yàn)也不是非常特異性的。糞便中出現(xiàn)血可以與非腫瘤病變相關(guān)潰瘍性結(jié)腸炎、痔瘡、肛瘺等。在這種情況中，必須進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，結(jié)腸鏡檢查的缺點(diǎn)在后文描述。最后，Hemoccult檢驗(yàn)難以解釋；因此其必須在專業(yè)中心由有資格的能勝任的人員詮釋。也已經(jīng)描述了特異于人血紅蛋白的免疫學(xué)檢驗(yàn)(FecaEIA，HemeSelect等)。與Hemoccult相比，它們大概有進(jìn)步，但是基本上還存在相同問題。因此，由Enterix公司銷售的Insure使得可以檢測87%患有CRC的患者，以及47%具有癌前息肉的患者。這是一種檢測糞便中人血紅蛋白、特別是檢測這個分子中的珠蛋白部分的檢驗(yàn)方法。第二種篩選方法是在50歲以后對人系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)腸鏡檢查，這樣在理論上可以降低由于結(jié)腸直腸癌所致死亡率。然而，對于使用內(nèi)窺鏡進(jìn)行篩選的政策，健康個體對這種檢查的可接受性太低而不能降低死亡率(已經(jīng)建立這個篩選計劃的歐洲國家結(jié)腸鏡檢查的順從水平是大約2%)。結(jié)腸鏡檢查存在并非不顯著的結(jié)腸穿孔和出血(0.)及死亡(1/10000)的風(fēng)險，而且對于公共衛(wèi)生事業(yè)也是非常昂貴的。此外，結(jié)腸鏡檢查需要非常嚴(yán)格的預(yù)先結(jié)腸準(zhǔn)備，這在很大程度上解釋了順從性不佳的原因。長久以來已經(jīng)描述了可以通過免疫測定化驗(yàn)結(jié)腸直腸癌的腫瘤標(biāo)記物。所述腫瘤標(biāo)記物特別是癌胚抗原(CEA)和CA19-9。CEA用于隨診。由于其靈敏性和特異性不足而不可用于篩選或者早期診斷結(jié)腸直腸癌。這是因?yàn)樵摌?biāo)記物由其它類型癌癥及在良性病變中表達(dá)。無論如何，通過組合CEA與另一種腫瘤標(biāo)記物如CA19-9或CA72-4可以增加靈敏性而不喪失其特異性。CA19-9的生理學(xué)改變的原因很罕見，但是其它良性病變(肝膽病癥、胰腺病癥)或者惡性病癥可以導(dǎo)致CA19-9增高。因此，單獨(dú)這個標(biāo)記物對于診斷也無意義。然而，由于其血清濃度與腫瘤的大小和存在轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)，因此其也可以用于治療隨診或者早期證實(shí)復(fù)發(fā)。另外，已經(jīng)提議可商購的檢驗(yàn)，如>Colopath,/ColorectAlert皿,由Ambrilia銷售，其是一種快速且相對非侵入性CRC的篩選檢驗(yàn)。Colopath檢測患有結(jié)腸直腸病變個體的直腸粘液中的縮醛磷脂(是磷脂的一部分的復(fù)合脂質(zhì))，而ColorectAlert檢測直腸粘液中的一種復(fù)合糖，即T-抗原。Colopath/ColorectAlert"3檢驗(yàn)包括將直腸粘液涂于檢驗(yàn)條帶上，陽性或陰性結(jié)果基于Schiff反應(yīng)。Ambrilia已經(jīng)研究了1787個個體，證實(shí)Colopath/ColorectAlert■檢測出54%的早期結(jié)腸直腸癌病例和49%所有階段組合病例。>C0LARIS,由MyriadGenetics銷售，是在血液中檢測MLH1和MSH2基因突變以篩選遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HNPCC綜合征)。該檢驗(yàn)的結(jié)果在3周內(nèi)獲得。Myriad使用目前可利用的最靈敏和最特異性的測序技術(shù)。該檢驗(yàn)成本昂貴。>￡說-70，由AMDL銷售，是一種篩詵各種類型癌癥(肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等)的檢驗(yàn)。因此其對于CRC不具有特異性。該檢驗(yàn)的原理是基于雙夾心ELISA技術(shù)(測定DR-70抗原)。通過酶反應(yīng)(抗體與生物素或者鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合)進(jìn)行揭示。生色反應(yīng)表示癌癥的存在。埃茲蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P15311，也稱作p81，Cytovillin或絨毛蛋白_2)是提供細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架肌動蛋白絲之間結(jié)合的蛋白質(zhì)，特別是在腸上皮細(xì)胞的微絨毛中3。w.G.Jiang和S.Hiscox4已經(jīng)揭示了白細(xì)胞介素IL_2、IL_8、IL-10等可以抑制埃茲蛋白在HT29人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)。同一作者5也揭示了HT115和HRT18結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中埃茲蛋白表達(dá)的抑制降低細(xì)胞之間的粘附，且增加細(xì)胞的活動性和侵入行為。他們推斷埃茲蛋白通過與細(xì)胞粘附分子E-鈣粘蛋白和連環(huán)蛋白(0-Catenin)的相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞/細(xì)胞和細(xì)胞/基質(zhì)之間的粘附。他們提出埃茲蛋白在控制癌細(xì)胞的侵潤潛力中可以起重要作用。此外，T.Xiao等6使用ELISA量化肺癌患者的血漿埃茲蛋白。然而，他們未觀測到與對照個體的任何差異。最后，在專利申請W02006/015079中，埃茲蛋白被描述為某些癌癥諸如結(jié)腸癌的診斷標(biāo)記物。但是，僅僅舉例說明了卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌，從而目前沒有可用的利用埃茲蛋白診斷結(jié)腸直腸癌的敏感且特異的診斷方法。本申請人令人驚奇地證實(shí)結(jié)腸腫瘤不僅特異性分泌埃茲蛋白，而且特異性釋放其至癌組織之外，這在后文詳細(xì)描述，且其在本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品中的濃度與在健康人體中確定的參考值相比增加，以及利用具體的抗埃茲蛋白單克隆抗體使得可提供診斷結(jié)腸直腸癌的敏感且特異性的方法。因此，本發(fā)明第一方面是體外診斷結(jié)腸直腸癌的方法，其通過利用至少一種抗埃茲蛋白單克隆抗體確定取自疑似患有結(jié)腸直腸癌的患者的生物學(xué)樣品、優(yōu)選遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品中埃茲蛋白的存在而進(jìn)行診斷，其中所述抗埃茲蛋白單克隆抗體針對選自以下表位序列的埃茲蛋白表位SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4+SEQIDNo.5，SEQIDNo.6+SEQIDNo.7和SEQIDNo.8。本發(fā)明還涉及這種方法在結(jié)腸直腸癌的早期診斷、篩選、治療隨診及預(yù)后中以及在結(jié)腸直腸癌的復(fù)發(fā)診斷中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法因此可以通過簡便的檢驗(yàn)方法特異性且早期診斷結(jié)腸直腸癌，所述檢驗(yàn)方法包括檢查取自患者的生物學(xué)樣品、優(yōu)選遠(yuǎn)離潛在腫瘤的生物學(xué)樣品中埃茲蛋白的存在。在遠(yuǎn)離或非遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品中確定埃茲蛋白的存在使得可以推斷查找的病變。本發(fā)明方法的一個優(yōu)勢是可以使用遠(yuǎn)離潛在腫瘤的樣品作為診斷樣品，從而可以進(jìn)行簡便且非侵入性診斷，而組織學(xué)診斷需要進(jìn)行侵入性活組織檢查。事實(shí)上，例如對組織切片進(jìn)行的組織標(biāo)記物的研究(免疫組織化學(xué))也許具有預(yù)后意義，但是對于篩選或者診斷結(jié)腸直腸癌無意義。短語“確定腫瘤標(biāo)記物的存在”是指利用至少一種抗埃茲蛋白單克隆抗體確定所述蛋白質(zhì)的存在，其中所述抗埃茲蛋白單克隆抗體針對選自以下表位序列的埃茲蛋白表位SEQIDNo.1,SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4+SEQIDNo.5，SEQIDNo.6+SEQIDNo.7和SEQIDNo.8。術(shù)語“表位”意指這樣的多肽，其具有至少序列SEQIDNO:1_8定義的序列以及至多10，8，6或4個分布在所考慮序列任一側(cè)或僅僅位于一側(cè)的另外的同種或非同種氨基酸以及其類似物和同源物。通常，術(shù)語“類似物”指與天然分子相比具有顯示一或多個氨基酸添加、取代(通常是保守性質(zhì)的)和/或缺失的序列和天然多肽結(jié)構(gòu)的肽，其中所述修飾不會破壞抗原反應(yīng)性。所述具體優(yōu)選的類似物包括保守取代，例如相同氨基酸家族中的取代。具體的，氨基酸通常分為4個家族(1)酸性氨基酸，諸如天冬氨酸和谷氨酸，(2)堿性氨基酸諸如賴氨酸，精氨酸和組氨酸，(3)非極性氨基酸諸如丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸和色氨酸和(4)不帶電的極性氨基酸，諸如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有時分類為芳香氨基酸。例如，可合理預(yù)測用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)取代亮氨酸，用谷氨酸單獨(dú)取代天冬氨酸，用絲氨酸單獨(dú)取代蘇氨酸，或用結(jié)構(gòu)相關(guān)的另一種氨基酸對一種氨基酸的相似保守取代對生物學(xué)活性沒有明顯影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考本領(lǐng)域已知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle圖輕易確定可耐受改變感興趣的肽分子的區(qū)域。術(shù)語“同源性”意指兩個肽分子之間的百分比相同性。當(dāng)在肽分子的確定長度上，兩個氨基酸序列顯示至少60%，優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80-85%，更優(yōu)選至少90%以及更優(yōu)選至少95-98%或更高序列相同性時，這兩個序列互相“基本同源”。短語“序列SEQIDNo.X+SEQIDNo.y的表位”意指表位所來源的蛋白質(zhì)的兩個不同部分組成的表位，識別該表位的抗體需識別這兩個部分。該識別非?？赡芘c該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的相鄰序列相關(guān)。短語“由結(jié)腸腫瘤釋放”是指無論機(jī)制如何由腫瘤細(xì)胞自身或者由鄰近的非腫瘤細(xì)胞在損傷后的主動或被動分泌或者釋放的腫瘤標(biāo)記物，或者是由腫瘤進(jìn)展引起的細(xì)胞表型的修飾。短語“對其進(jìn)行本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品”是指可能含有感興趣的腫瘤標(biāo)記物的任何生物學(xué)樣品。可以提及的非遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品例如可以是固體樣品如源自患者的腫瘤、該腫瘤的活檢組織、淋巴結(jié)或者轉(zhuǎn)移瘤的組織，以及純化自這些固體樣品的細(xì)胞?？梢蕴峒暗倪h(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品例如是生物學(xué)液體如全血或其衍生物例如血清或血漿、尿液、唾液和滲出液、骨髓以及糞便，以及純化自這些液體樣品的細(xì)胞。優(yōu)選血液及其衍生物以及糞便、滲出液和純化自這些液體樣品的細(xì)胞。本發(fā)明的方法可以通過檢測除了埃茲蛋白之外還檢測至少一種其它腫瘤標(biāo)記物而改善，所述標(biāo)記物也適當(dāng)?shù)赜山Y(jié)腸腫瘤釋放至癌組織之外。因此，組合至少兩個標(biāo)記物使得可以改善診斷結(jié)腸直腸癌的檢驗(yàn)的特異性和靈敏性。因此，本發(fā)明另一方面也包括確定選自如下兩組標(biāo)記物(單獨(dú)或組合考慮)的至少一種其它腫瘤標(biāo)記物的存在-A組白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、?；被崴饷?、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白All和I-絲束蛋白(I-Plastin)，其中一些標(biāo)記物是本申請人鑒別的新標(biāo)記物；-B組具有額外的診斷意義的標(biāo)記物，S卩02-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3(GaleCtin-3)、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網(wǎng)蛋白、再生胰島衍生蛋白3a(RegeneratingIslet-DerivedProtein3a)、腫瘤相關(guān)鈣離子信號傳導(dǎo)蛋白1、細(xì)胞骨架角蛋白II型8、細(xì)胞骨架角蛋白I型18、細(xì)胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、CEA、絨毛蛋白(Villin)、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2,睪酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5((Pro)defensin-A5)，血液中甲基化模式特異性改變的DNA片段的檢測，例如AXL4基因的甲基化DNA(無芒樣同源框-4基因(aristaless-likehomeobox-4gene)甲基化)或者s印tin-9基因的甲基化DNA，糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測。本發(fā)明的方法因此可以通過檢測至少兩個標(biāo)記物而改善，一個是埃茲蛋白，另一個是選自A組的另一腫瘤標(biāo)記物，所述A組即白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、?；被崴饷?、肝脂肪酸結(jié)合蛋白、腸脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白AI、載脂蛋白All和I-絲束蛋白?！靶旅枋龅哪[瘤標(biāo)記物”是指蛋白質(zhì)或信使RNA或者相應(yīng)基因的特異性修飾，如突變或者甲基化。白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑腫瘤標(biāo)記物(SwissProtNo.P30740，也稱作LEI、SerpinBl、單核細(xì)胞/中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑、M/NEI或EI)在1992年測序7。LEI特異性抑制具有彈性蛋白酶型或者糜蛋白酶型性質(zhì)的蛋白酶，其通過在SDS作用下形成不可解離的復(fù)合物而起抑制作用8。因此LEI抑制由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的三種主要的蛋白酶白細(xì)胞彈性蛋白酶、蛋白酶-3和組織蛋白酶G。這些蛋白酶能通過蛋白酶解細(xì)胞外或吞噬的底物而使得免疫系統(tǒng)防御該生物體。然而，當(dāng)這些蛋白酶過量時，其可造成炎癥反應(yīng)。因此，LEI在調(diào)節(jié)和限制細(xì)胞蛋白酶誘導(dǎo)的炎癥作用中起作用。本申請人令人驚奇地揭示這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品可以是遠(yuǎn)離或不遠(yuǎn)離該腫瘤的樣品。酰化氨基酸水解酶1標(biāo)記物(SwissProtNo.Q03154,也稱作EC3.5.1.14，N_酰基-L-氨基酸氨基水解酶或ACY-1)是?；被崴饷讣易宓囊徊糠?。它們是催化酰化的氨基酸水解的酶以提供脂肪酸和氨基酸9。對?；被崴饷富钚赃M(jìn)行的免疫化學(xué)測定在早如1975年由K.Lorentz等“1揭示，其用于檢驗(yàn)各種組織和血清“。研究示出在肝病變的病例中?；被崴饷富钚栽黾樱窃诮Y(jié)腸癌病例中不增加。此外，酰化氨基酸水解酶1基因已經(jīng)在染色體3p21.1上鑒別12。在小細(xì)胞肺癌中3p21.1區(qū)域降低為純合性，在這種情況中?；被崴饷副磉_(dá)被抑制或不可檢測13。相似地，S.Balabanov等14已經(jīng)揭示在腎癌病例中酰化氨基酸水解酶表達(dá)被抑制。然而，酰化氨基酸水解酶1從未作為結(jié)腸直腸癌的標(biāo)記物而被描述，特別是在遠(yuǎn)離腫瘤的生物學(xué)樣品中被潛在測定。本申請人令人驚奇地揭示這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品可以是遠(yuǎn)離或不遠(yuǎn)離該腫瘤的樣品。肝脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P07148，也稱作L_FABP、FABP1、FABPL、Z-蛋白或者固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)屬于FABP家族，其包含9個同種型。每個同種型根據(jù)首先檢測到該同種型的組織命名。這些同種型具有共有的功能及相似的三維結(jié)構(gòu)，但是其序列同源性不高。L-FABP在1985年被測序15。其是15kDa的小型蛋白質(zhì)，高豐度存在于細(xì)胞溶膠中，且具有結(jié)合游離脂肪酸和膽紅素的能力。近來的一些研究似乎表明L-FABP蛋白表達(dá)的削弱可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。對于前列腺癌，腫瘤活檢組織中L-FABPmRNA表達(dá)水平比在正常組織中高10倍16。對于結(jié)腸癌，一些研究小組使用二維電泳技術(shù)已經(jīng)鑒別了與在正常結(jié)腸粘膜組織中的表達(dá)相比L-FABP蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)降低17。這個結(jié)果也已經(jīng)通過免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)。此外，L-FABP蛋白在已經(jīng)轉(zhuǎn)移至肝的結(jié)腸直腸癌患者中是預(yù)后肝臟切除的標(biāo)記物18。本申請人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。腸脂肪酸結(jié)合蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P12104，也稱作I-FABP、FABP-2或FABPI)在1987年被測序19。其是15kDa的小型蛋白質(zhì)，高豐度存在于細(xì)胞溶膠中，且具有結(jié)合游離脂肪酸和膽紅素的能力。I-FABP蛋白在小腸的腸上皮細(xì)胞中表達(dá)，且可以組成這種類型細(xì)胞蛋白質(zhì)含量的大約2%。在組織水平，十二指腸和空腸與結(jié)腸相比顯然含有較高數(shù)量的I-FABP(空腸4.8μg/g，結(jié)腸0.25μg/g)2°。I-FABP在健康個體的血漿樣品中不可被檢測到。另一方面，在某些病理學(xué)情況如腸缺血、克羅恩病或者原發(fā)性膽汁性肝硬化中，可以證實(shí)在某些個體中血漿I-FABP濃度增加2°。對于前列腺癌，已經(jīng)揭示了I-FABPmRNA在腫瘤活檢組織比在正常組織中的表達(dá)水平高7倍16。在大鼠中用氧化偶氮甲烷(azoxymethane)誘導(dǎo)的結(jié)腸直腸癌模型中，當(dāng)給予動物降低癌癥發(fā)生的食物(大豆蛋白或者乳清水解產(chǎn)物)時，I-FABPmRNA的表達(dá)水平降低2.92-3.97倍21。本申請人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。載脂蛋白是由極性氨基酸組成的蛋白質(zhì)家族，其可以通過形成稱作脂蛋白的親水性大分子復(fù)合物而轉(zhuǎn)運(yùn)血液中的脂質(zhì)。對于每種人血漿載脂蛋白，存在衍生自遺傳多態(tài)性和/或翻譯后修飾的同種型，其在血液中的存在與某些病變相關(guān)22。載脂蛋白的血漿濃度并非是不顯著的，在mg/ml級別23。載脂蛋白AI標(biāo)記物(NCBINo.490098,也稱作ApoA-I,ApoAI和ApoAl)是具有243個氨基酸的28kDa蛋白質(zhì)。其基本上由肝和腸合成。通過SELDI-T0F，揭示了這種蛋白質(zhì)在結(jié)腸直腸癌患者血清與在健康個體血清中相比豐度不高24。然而，這篇文章指出通過組合ApoAI與其它蛋白質(zhì)標(biāo)記物區(qū)別CRC患者與健康個體。此外，這篇文章指出由另一研究小組進(jìn)行的通過濁度免疫測定分析ApoAI未證實(shí)這種蛋白質(zhì)在CRC患者血清中的豐度不高25。Hachem等26測定了在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移之后患有肝癌的患者血清中的ApoAI。本申請人:令人驚奇地揭示了通過免疫測定分析可以證實(shí)這種蛋白質(zhì)在結(jié)腸直腸癌患者中的濃度降低，與先前Engwegen等24提出的結(jié)果相反，其僅通過實(shí)施SELDI-T0F技術(shù)才能證實(shí)這種降低。通過在生物學(xué)樣品中進(jìn)行免疫測定分析ApoAI是診斷結(jié)腸直腸癌的良好方法，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤，進(jìn)行的免疫測定分析不是Zhang等的小組所用的比濁法25。載脂蛋白All標(biāo)記物(SwissProtNo.P02652,也稱作ApoAII、Apo-AII和ApoA2)是由每個鏈具有77個氨基酸的兩個多肽鏈組成的17380-Da蛋白質(zhì)，所述兩個多肽鏈通過二硫鍵連接。如載脂蛋白AI—樣，載脂蛋白All也基本上由肝和腸合成。除了ApoAI之外，Hachem等26也測定了在結(jié)腸直腸癌轉(zhuǎn)移之后患有肝癌的患者血清中的ApoAll。然而，結(jié)果無意義，且不能得以推斷病癥。本申請人令人驚奇地揭示了結(jié)腸直腸癌患者中這種蛋白質(zhì)濃度降低，使其在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。I-絲束蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.Q14651，也稱作腸特異性絲束蛋白或者絲束蛋白1)屬于人絲束蛋白家族，該家族具有三個代表性成員1_絲束蛋白、L-絲束蛋白和T-絲束蛋白。一些作者將絲束蛋白類稱為“微絲結(jié)合蛋白類(Fimbrins)”，另一些作者將I-絲束蛋白稱為微絲結(jié)合蛋白。絲束蛋白類是結(jié)合肌動蛋白形成細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)。它們是70kDa蛋白質(zhì)，在真核生物進(jìn)化中相對良好保守。它們呈現(xiàn)出良好組織特異性，在一個時期僅一種同種型在正常組織中存在27。絲束蛋白類在癌癥中的應(yīng)用已經(jīng)在專利US-A-5360715中描述，該專利提議了一種確定細(xì)胞是造血細(xì)胞還是血管發(fā)生性即癌性細(xì)胞的方法。這種方法要求在細(xì)胞水平測定L-絲束蛋白和T-絲束蛋白，更特別是測定其mRNA。然而，盡管呈現(xiàn)這些性質(zhì)，但是先前未進(jìn)行研究以評估絲束蛋白在使用血清或糞便樣品診斷結(jié)腸直腸癌中的重要性。此外，從未設(shè)想I-絲束蛋白作為潛在的癌標(biāo)記物28。本申請人令人驚奇地揭示了這種蛋白質(zhì)在取自結(jié)腸直腸癌患者的生物學(xué)樣品中是良好的標(biāo)記物，所述樣品遠(yuǎn)離所述腫瘤。在對其進(jìn)行本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品中，選自A組的腫瘤標(biāo)記物的濃度根據(jù)考慮的標(biāo)記物與在健康個體中確定的參考值相比增加或降低。本發(fā)明的方法也可以通過組合檢測埃茲蛋白與選自B組的一種其它腫瘤標(biāo)記物而改善，所述B組標(biāo)記物即標(biāo)記物02-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網(wǎng)蛋白、再生胰島衍生蛋白3a、腫瘤相關(guān)鈣離子信號傳導(dǎo)蛋白1、細(xì)胞骨架角蛋白II型8、細(xì)胞骨架角蛋白I型18、細(xì)胞骨架角蛋白I型19、上皮鈣粘蛋白(Epithelial-Cadherin)、CEA、絨毛蛋白、CA19-9、CA242、CA50、CA72-2、睪酮、TIMP-1、Cripto-1、Intelectin-1、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)-A5；血液中甲基化DNA的檢測，優(yōu)選AXL4基因的甲基化DNA(無芒樣同源框_4基因甲基化)或者s印tin-9基因的甲基化DNA；糞便DNA片段中特異性改變的檢測，如糞便DNA的特異性突變或者糞便DNA的甲基化模式的特異性改變，以及糞便人血紅蛋白的檢測。當(dāng)然，本發(fā)明的方法也可以在同一測定中檢測埃茲蛋白、選自B組的至少一種腫瘤標(biāo)記物以及選自A組的至少一種其它腫瘤標(biāo)記物。旦2-微球蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P61769，也稱作32_微球蛋白，32M)是在大多數(shù)有核人細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的一種低分子量(11-12kDa)蛋白質(zhì)。在某些癌癥患者中，血清β2-微球蛋白水平增加，這種增加不是特異性的，或者與腫瘤的性質(zhì)、疾病的階段或嚴(yán)重性不相關(guān)。在其它疾病如紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、淋巴系統(tǒng)惡性疾病(多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤)、某些病毒性疾病(肝炎或AIDS)以及在血友病患者中也觀測到顯著增加。由于β2-微球蛋白被腎小球?yàn)V過，且由近端小管重吸收，因此在腎臟疾病中其在血液中的濃度可以改變。因此測定β2-微球蛋白主要用于診斷腎臟病癥，或者用于獲得性免疫缺陷病毒感染的隨診中。然而，已知這種標(biāo)記物是腫瘤標(biāo)記物，特別是結(jié)腸癌的標(biāo)記物。蛋白酶體20S標(biāo)記物(也稱作Prosome)是蛋白酶體的中心結(jié)構(gòu)，其自身是參與遍在蛋白的細(xì)胞內(nèi)降解的分子復(fù)合物29。蛋白酶體是由在7個亞基的4個環(huán)締合的28個亞基組成的700kDa的分子復(fù)合物。在人體中，已知7個α單位(α，α2，α3，α4，α5，α6禾口α7)及10個β單位(β1，β2，β3，β4，β5，β6，β7，βΠ,β2i禾口β5i)。通過其催化性質(zhì)，蛋白酶體在細(xì)胞增殖、生長、調(diào)節(jié)和凋亡中且因此在癌化途徑中起關(guān)鍵作用。用Bortezomib(Velcade)抑制蛋白酶體是公認(rèn)的治療多發(fā)性骨髓瘤的方法?，F(xiàn)在正對血液癌癥或腫瘤進(jìn)行II期或III期治療試驗(yàn)。T.Lavabre-Bertrand等3°揭示了在某些病理狀況特別是在癌癥(骨髓瘤、淋巴瘤和實(shí)體瘤)中，蛋白酶體的血清水平可增加。半乳凝素-3標(biāo)記物(SwissProtNo.P17931，也稱作Gal_3、半乳糖特異性凝集素3、MAC-2抗原、IgE-結(jié)合蛋白、35kDa凝集素、碳水化合物結(jié)合蛋白35、CBP35、昆布氨酸_結(jié)合蛋白、凝集素L-29、L-31、半乳糖苷結(jié)合蛋白或者GALBP)是能結(jié)合N-乙酰氨基乳糖(acetyllactosamine)型的β_半乳糖苷結(jié)構(gòu)的凝集素。其是參與多種生物學(xué)功能的多功能蛋白質(zhì)，所述功能包括腫瘤細(xì)胞的粘附、增殖、分化、血管發(fā)生、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)移癌進(jìn)展31O多項研究表明Gal-3可以與許多分子形成復(fù)合物CEA、IgE、昆布氨酸(Laminin)、粘蛋白(Mucin)、Mac-2BP、LAMPl、LAMP2、纖連蛋白(Fibronectin)等。Gal_3的血清測定已經(jīng)由I.Iurisci等32描述。Gal-3在用Mac-2-結(jié)合蛋白(Gal_3-結(jié)合蛋白)包被的微滴定平板上被捕獲，然后用抗-Gal-3大鼠抗體揭示。這項研究揭示了Gal-3在胃腸道癌癥、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑素瘤和非霍奇金淋巴瘤中增加的血清水平。L-乳酸脫氫酶B鏈標(biāo)記物(SwissProtNo.P07195,也稱作LDH-B，LDH心單位或LDH-H)是可以以同源四聚體形式形成復(fù)合物的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)也可以與L-乳酸脫氫酶A鏈蛋白(SwissProtNo.P00338，也稱作LDH-A、LDH肌單位或LDH-M)以異源四聚體形式形成復(fù)合物。血流中稱作LDH的這種四聚體復(fù)合物的血清劑量和/或血清酶活性在許多實(shí)體瘤中與腫瘤大小成比例地增加。推薦其與人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)和胎盤堿性磷酸酶組合用于精囊癌的隨診中。LDH被認(rèn)為是預(yù)后淋巴瘤、白血病或者結(jié)腸癌的重要標(biāo)記物33。鈣網(wǎng)蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P27797,也稱作CRP55、Calregulin,HACBP,ERp60或grp60)是多功能蛋白質(zhì)。其是能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的幾乎所有單糖基化蛋白質(zhì)瞬時相互作用的凝集素。D.J.McCool等34因此已經(jīng)揭示了鈣網(wǎng)蛋白參與結(jié)腸粘蛋白MUC2的成熟。在組織、糞便或體液中使用鈣網(wǎng)蛋白測定診斷CRC的方法在專利申請WO03/065003中描述。再生胰島衍生蛋白3α標(biāo)記物(SwissProtNo.Q06141，也稱作RegΙΙΙ-α、胰腺炎相關(guān)蛋白1或者胰腺炎相關(guān)蛋白I(PAP1))是在正常胰腺中微弱表達(dá)的蛋白質(zhì)。其在急性胰腺炎和在某些慢性胰腺炎患者中過表達(dá)。在這種情況中，其出現(xiàn)在胰液和血流中35。Y.Motoo等36通過ELISA已經(jīng)揭示了某些結(jié)腸癌、胃癌、肝癌或胰腺癌以及在腎功能衰竭患者血液中PAP1水平增加。為此，他們使用Dynabio(LaGaude,France)公司銷售的ELISA測定法(PANCEPAP)。腫瘤相關(guān)鈣離子信號傳導(dǎo)蛋白1標(biāo)記物(SwissProtNo.P16422，也稱作主要胃腸道腫瘤相關(guān)蛋白GA733-2、上皮細(xì)胞表面抗原、EpCAM、上皮糖蛋白EGP、腺癌相關(guān)抗原、KSA、KS1/4抗原、細(xì)胞表面糖蛋白Trop-1或者CD326抗原)根據(jù)其由結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的抗體識別的能力在1979年被鑒定37。已知這種蛋白質(zhì)有許多名稱，如上文描述，但是最常用的是稱其為EpCAM。其是在某些上皮細(xì)胞以及許多癌癥細(xì)胞的基底面中表達(dá)的跨膜蛋白38。在1982年，Herlyn等39揭示了注射抗-EpCAM單克隆抗體可以抑制結(jié)腸直腸癌患者體內(nèi)腫瘤生長。這些結(jié)果使得可以基于稱作Edrecolomab的抗-EpCAM抗體開發(fā)抗腫瘤治療方法。這種治療以Panorex名稱銷售。此外，H.Abe等4°通過ELISA揭示了稱作MK-1的可溶形式的EpCAM在10%研究的癌癥患者血流中增加。細(xì)胞角蛋白是組成上皮細(xì)胞細(xì)胞骨架的中間絲的蛋白質(zhì)部分。目前已經(jīng)鑒別了超過20種的人細(xì)胞角蛋白。細(xì)胞角蛋白8(SwissProtNo.P05787，也稱作細(xì)胞角蛋白、CK-8、角蛋白-8或K8)、18(SwissProtNo.P05783，也稱作細(xì)胞角蛋白_18、CK_18、角蛋白-18或K18)和19(SwissProtNo.P08727，也稱作細(xì)胞角蛋白_19、CK_19、角蛋白-19或K19)在上皮細(xì)胞中豐度最高，且是診斷癌病變的有效工具41。這種臨床重要性與細(xì)胞凋亡或增殖期上皮細(xì)胞釋放細(xì)胞角蛋白相關(guān)。在細(xì)胞凋亡情況中，這個釋放以可溶片段形式出現(xiàn)，似乎在半胱氨酸蛋白酶的蛋白酶解作用下出現(xiàn)。血流中未降解的細(xì)胞角蛋白形式從未有報道。三種臨床最常用的細(xì)胞角蛋白測定是組織多肽抗原(TPA)測定，組織多肽特異性抗原(TPS)測定和CYFRA21-1測定。TPA是測量細(xì)胞角蛋白8、18和19的廣譜檢驗(yàn)法。TPS和CYFRA21-1測定分別更特異性測量細(xì)胞角蛋白18和細(xì)胞角蛋白19的片段。這三種檢測法檢測可溶的細(xì)胞角蛋白片段，所述片段可以以其自身或者以蛋白質(zhì)復(fù)合物形式呈現(xiàn)。TPA、TPS或者CYFRA-21-1已經(jīng)用于結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和某些ENT癌的治療隨診中。事實(shí)上，血液中可溶的細(xì)胞角蛋白的測定在篩選腫瘤復(fù)發(fā)或者評估所用治療(放療、化療、激素治療)的反應(yīng)中具有臨床價值。定期檢測使得特別可以評估腫瘤的進(jìn)展?？扇艿难杭?xì)胞角蛋白的量也具有預(yù)后腫瘤階段和轉(zhuǎn)移形成的意義。目前，最常用的細(xì)胞角蛋白血液測定是CYFRA21-1。高度推薦其用于非小細(xì)胞肺癌患者的隨診。有許多可商購的TPA(ABSangtecMedicalCo.，Byk-Roland等)、TPS(IDLBiotechAB,BEKIDiagnosiss等)禾口CYFRA-21-1(RocheDiagnosiss,CISBio-International,FujirebioDiagnosiss等)的試劑盒。此外，H.Kim等42揭示了測定糞便細(xì)胞角蛋白19(DiNonAInc.)組合便潛血測定可用于篩選胃腸道疾病。最后，細(xì)胞角蛋白20(SwissProtNo.P35900，也稱作細(xì)胞骨架I型角蛋白20、CK-20、角蛋白-20、K20或者IT蛋白)在結(jié)腸直腸癌中作為標(biāo)記物的應(yīng)用在專利申請US2002/0160382中描述。上皮鈣粘蛋白標(biāo)記物(SwissProtNo.P12830，也稱作E_鈣粘蛋白、Uvomorulin、鈣粘蛋白-1、CAM120/80或者CD324抗原)是介導(dǎo)鈣離子依賴性細(xì)胞粘附的跨膜蛋白。其在上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)，在此參與維持其表型。E-鈣粘蛋白的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合連環(huán)蛋白，其自身結(jié)合細(xì)胞骨架的肌動蛋白絲網(wǎng)。這種E-鈣粘蛋白連環(huán)蛋白結(jié)合在穩(wěn)定上皮組織的細(xì)胞/細(xì)胞粘附中起重要作用。因此，E-鈣粘蛋白的喪失可降低細(xì)胞粘附且增加癌細(xì)胞的侵潤能力。E-鈣粘蛋白或者連環(huán)蛋白的表達(dá)降低通常與腫瘤特別是胃腸道癌癥的更大的侵潤性和去分化性相關(guān)聯(lián)。因此，F(xiàn).Roca等43揭示了患有結(jié)腸直腸癌且E-鈣粘蛋白低表達(dá)的患者與具有正常表達(dá)水平的患者相比具有更不利的預(yù)后。在1983年，Damsky等44揭示了可溶形式的E-鈣粘蛋白可以由MCF-7乳腺癌細(xì)胞系釋放。這種可溶形式相應(yīng)于E-鈣粘蛋白胞外部分的裂解。隨后，M.Katayama等45揭示了可溶形式的E_鈣粘蛋白在癌癥情況中可以釋放進(jìn)入血流中；C.Willmarms等46揭示了血液中E-鈣粘蛋白量增加與結(jié)腸直腸癌的腫瘤階段相關(guān)聯(lián)。此外，可商購的試劑盒由TakaraBioChemicals(Tokyo,Japan)公司提供。自1965年以來，P.Gold和S.Freedman47已經(jīng)提議測定CEA(癌胚抗原)用于診斷結(jié)腸直腸癌，但是血液中這個標(biāo)記物的測定對于診斷相對非晚期結(jié)腸直腸癌的靈敏性不佳。因此，測定血清CEA尤為推薦用于評估肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險48以及用于治療隨診。此外，其對于結(jié)腸直腸癌不是非常特異性的標(biāo)記物；事實(shí)上其在許多其它癌癥(肺癌、乳腺癌等)中均增加。另一方面，測定糞便CEA似乎比測定血清CEA或者測定便血更靈敏且更具特異性49。然而，這種測定還未被常規(guī)提議。反應(yīng)性抗原性決定簇1116-NS-19-9，更通常稱作CA19-9(碳水化合物抗原19.9)，由高分子量蛋白質(zhì)攜帶5°。測定血液中CA19-9與測定CEA相比更具特異性。血液中CA19-9水平在結(jié)腸直腸癌、胰腺癌和肝癌(肝膽管型肝癌)中增加，但是在非癌病癥(膽管炎等)中也增加。在診斷癌癥及該病癥的隨診中推薦其與CEA組合。J.Holmgren等51揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中CA50抗原的量增加。CA50抗原根據(jù)其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。關(guān)于CA72標(biāo)記物，T.L.Klug等52揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中CA72抗原的量增加。CA72抗原根據(jù)其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。相似地，P.Kuusela等53揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中CA242抗原的量增加。CA242抗原根據(jù)其由特異性單克隆抗體識別的能力定義。M.Holland等54提議測定睪酮以診斷結(jié)腸直腸癌。這些作者揭示了結(jié)腸直腸癌患者血液睪酮水平降低。關(guān)于TIMP-1，或者1型基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑這個標(biāo)記物，專利申請US2007/0020707描述了通過測定體液中TIMP-1診斷結(jié)腸直腸癌。F.Model等55在2006年7月在胃腸道癌癥國際會議期間揭示了可以檢測結(jié)腸直腸癌患者血漿中s印tin-9基因的甲基化形式。M.P.Ebert等56揭示了ALX4基因或者無芒樣同源框_4基因在結(jié)腸直腸癌患者血清中比在對照血清中更通常被甲基化(P<0.0001)。使用41.4pg/mL閾值，他們獲得了83.3%的靈敏性和70%的特異性。絨毛蛋白在專利申請F(tuán)R2581456中被描述為診斷結(jié)腸直腸癌的血液標(biāo)記物。C.Bianco等57揭示了在結(jié)腸直腸癌患者血清中Cripto_l的量增加。測定Intelectin-1(SwissProtNo.Q8WWA0，也稱作腸乳鐵蛋白受體、呋喃半乳糖結(jié)合凝集素、內(nèi)皮細(xì)胞凝集素HL-1或者Omentin)用以診斷結(jié)腸直腸癌在專利申請US2003/0082533中描述。蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(SwissProtNo.P07237,也稱作EC5.3.4.1、PDI、脯氨酰4-羥化酶β亞基、細(xì)胞甲狀腺激素結(jié)合蛋白或者ρ55)、翻譯控制的腫瘤蛋白(SwissProtNo.P13693，也稱作TCTP、p23、組胺釋放因子、HRF或Fortilin)以及原防衛(wèi)素_A5(SwissProtNo.Q01523)用作結(jié)腸直腸癌標(biāo)記物分別在專利申請EP1724586、US2003/0172388和US2006/0179496中描述。術(shù)語“防衛(wèi)素(原)”是指前體(即裂解前的防衛(wèi)素原)；前肽(即防衛(wèi)素原裂解后的N末端部分)；以及成熟蛋白質(zhì)(即防衛(wèi)素，相應(yīng)于裂解后C末端部分)。最后，測定便血是已知的檢驗(yàn)法，且可以如前述實(shí)施。對其進(jìn)行本發(fā)明方法的生物學(xué)樣品中選自B組的腫瘤標(biāo)記物的濃度根據(jù)考慮的標(biāo)記物與在健康個體中確定的參考值相比是增加或降低的。優(yōu)選地，B組腫瘤標(biāo)記物選自β2-微球蛋白、蛋白酶體20S、半乳凝素-3、L-乳酸脫氫酶B鏈、鈣網(wǎng)蛋白、再生胰島衍生蛋白3α、腫瘤相關(guān)鈣離子信號傳導(dǎo)蛋白1、上皮鈣粘蛋白、CEA、CA19-9、睪酮、TIMP-l、Intelectin-l、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、細(xì)胞角蛋白20、翻譯控制的腫瘤蛋白、防衛(wèi)素(原)"A5及檢測人糞便血紅蛋白。當(dāng)然，本發(fā)明的方法也可包括檢測本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的結(jié)腸直腸癌任何其它標(biāo)記物。與總以蛋白質(zhì)形式檢測的埃茲蛋白相反，埃茲蛋白以外的感興趣的腫瘤標(biāo)記物以蛋白質(zhì)形式或者以信使RNA形式或者通過相應(yīng)DNA改變(突變或甲基化修飾)而被檢測?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的確定樣品中蛋白質(zhì)存在的任何方法確定生物學(xué)樣品中感興趣的“蛋白質(zhì)”腫瘤標(biāo)記物的存在，例如生物化學(xué)檢驗(yàn)，包括免疫測定，或者通過質(zhì)譜分析。所述生物化學(xué)檢驗(yàn)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何檢驗(yàn)，包括分子相互作用，即所述腫瘤標(biāo)記物與特異于或者非特異于所述腫瘤標(biāo)記物的一或多種結(jié)合配偶體之間的反應(yīng)。優(yōu)選地，所述生物化學(xué)檢驗(yàn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的免疫測定，包括腫瘤標(biāo)記物(即抗原)與一或多種特異性結(jié)合配偶體(即該抗原的抗體)之間的免疫學(xué)反應(yīng)。本發(fā)明方法中特異于或非特異于腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體是能結(jié)合所述標(biāo)記物的任何配偶體。當(dāng)其能以高特異性、甚至以100%特異性結(jié)合這些標(biāo)記物時，認(rèn)為其是特異性的。當(dāng)其與這些標(biāo)記物的結(jié)合特異性較低且同時能結(jié)合其它配體如蛋白質(zhì)時，認(rèn)為其是非特異性的。例如，可以提及的是抗體、抗體一部分、受體及能結(jié)合這個標(biāo)記物的任何其它分子。所述結(jié)合配偶體抗體是例如多克隆抗體或者單克隆抗體。多克隆抗體可以通過用相關(guān)的腫瘤標(biāo)記物免疫動物，隨后回收純化形式的希望的抗體而獲得，通過從所述動物取血清，將所述抗體從其它血清組分中分離，特別是在附著有該抗體特異性識別的抗原、特別是所述標(biāo)記物的柱上通過親和層析分離。單克隆抗體可以通過雜交瘤技術(shù)獲得，其一般原理在后文描述。首先，用感興趣的腫瘤標(biāo)記物免疫動物(通常是小鼠)，隨后所述動物的B淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生該抗原的抗體。這些產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞隨后與“永生化的”骨髓瘤細(xì)胞(例如鼠)融合以產(chǎn)生雜交瘤。使用由此獲得的細(xì)胞異源混合物，選擇能產(chǎn)生特定抗體且無限增殖的細(xì)胞。每個雜交瘤均以克隆形式增殖，導(dǎo)致單克隆抗體產(chǎn)生，其由所述腫瘤標(biāo)記物識別的性質(zhì)可例如通過ELISA、通過一維或二維Western印跡、通過免疫熒光或者通過生物傳感器檢測。隨后純化由此選擇的單克隆抗體，特別是通過上述親和層析技術(shù)純化。所述單克隆抗體也可以是通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的遺傳工程化技術(shù)獲得的重組抗體。已知抗-白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑抗體的實(shí)例，且可得自Abeam目錄兔抗_LEI多克隆抗體，Cat.No.Ab47731?？?LEI單克隆抗體，克隆ELA-1，由Yasumatsu等描述58。已知抗-酰化氨基酸水解酶1抗體的實(shí)例，且可得自Abnova目錄，抗-酰化氨基酸水解酶1單克隆抗體，克隆4F1-B7,Cat.No.H00000095-M01,以及Abeam目錄，雞抗-?；被崴饷?多克隆抗體，Cat.No.Ab26173。已知抗-肝脂肪酸結(jié)合蛋白抗體的實(shí)例，且可得自Abeam目錄，抗_L_FABP單克隆抗體，克隆6B6，Cat.No.Abl0059，及兔抗-L-FABP多克隆抗體，Cat.No.Ab7807。已知抗-腸脂肪酸結(jié)合蛋白抗體，且可得自R&DSystems目錄，抗-I-FABP單克隆抗體，克隆323701，Cat.No.MAB3078，及Abeam目錄，兔抗_I_FABP多克隆抗體，Cat.No.Ab7805o已知抗-載脂蛋白AI抗體的實(shí)例，且可得自BiodesignMeridianLifeSciences目錄，抗-ApoAI單克隆抗體，克隆4490，〔&丨.吣.朋540211，和山羊抗-八口0AI多克隆抗體，Cat.No.K45252P。已知抗-載脂蛋白All抗體的實(shí)例，且可得自USBiological目錄，抗-ApoAII單克隆抗體，克隆1402，Cat.No.A2299-31C，及BiodesignMeridianLifeSciences目錄，山羊抗-ApoAll多克隆抗體，Cat.No.K74001P。已知抗-I-絲束蛋白多克隆抗體的實(shí)例，且可得自SantaCruzBiotechnology目錄。兔多克隆抗體H-300(Cat.No.sc-28531)與1_絲束蛋白、L-絲束蛋白和T-絲束蛋白反應(yīng)。本申請人揭示了I-絲束蛋白的單克隆抗體。已知抗2-微球蛋白、抗-CEA、抗-CA19-9和抗-睪酮抗體的實(shí)例，且可用于本申請人:的測定試劑盒中，分別是Vidas32-微球蛋白、VidasCEA、vidasCA19-9和Vidas睪酮。已知抗-蛋白酶體20S抗體的實(shí)例，且可得自AffinitiyResearchProducts目錄。已知抗-半乳凝素-3、抗-L-乳酸脫氫酶B鏈、抗-鈣網(wǎng)蛋白、抗-腫瘤腫瘤相關(guān)鈣離子信號傳導(dǎo)蛋白1、抗_細(xì)胞骨架II型角蛋白8、抗-細(xì)胞骨架I型角蛋白18、抗-細(xì)胞骨架I型角蛋白19、抗-上皮-鈣粘蛋白、抗_絨毛蛋白和抗-TIMP-1抗體的實(shí)例，且可得自Abeam目錄。已知抗-再生胰島衍生蛋白3a抗體的實(shí)例，且用于Dynabio測定試劑盒(LaGaude,France)中。已知抗-CA242、抗-CA50和抗_CA72-4抗體的實(shí)例，且可得自Fujirebio目錄。已知抗-Intelectin-1抗體的實(shí)例，且可得自AlexisBiochemicals目錄，抗-Intelectin-1單克隆抗體，克隆Saly-1，Cat.No.ALX-804-850-C100，以及rabbit抗-Intelectin-1多克隆抗體，Cat.No.ALX-210-941。已知抗-蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄，抗-PDI單克隆抗體，克隆RL77，Cat.No.Ab5484，以及兔抗-PDI多克隆抗體，Cat.No.Ab3672，已知抗-細(xì)胞角蛋白20抗體的實(shí)例，且可得自Abcam目錄，抗-細(xì)胞角蛋白20單克隆抗體，克隆Ks20.8，Cat.No.Ab962,以及兔抗-細(xì)胞角蛋白20多克隆抗體，Cat.No.Ab367560已知抗-TCTP抗體的實(shí)例，且可得自目錄，抗-TCTP單克隆抗體，克隆3C7，Cat.No.157H00007178-M01,以及抗-TCTP多克隆抗體，Cat.No.157H00007178-A01。已知抗-防衛(wèi)素-A5抗體的實(shí)例，且可得自SantaCruzBiotechnology目錄，抗-防衛(wèi)素-A5單克隆抗體，克隆8C8，Cat.No.sc-53997，以及AlphaDiagnosisInternationalInc.目錄，兔抗-防衛(wèi)素_A5多克隆抗體，Cat.No.HDEFA51-A。本發(fā)明方法中特異于或者非特異于腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體可用作捕獲劑，作為檢測劑，或者作為捕獲劑和檢測劑?？梢酝ㄟ^任何檢測方式如直接或間接檢測方式觀測免疫反應(yīng)，即腫瘤標(biāo)記物/結(jié)合配偶體的結(jié)合。在直接檢測即不包含標(biāo)記情況中，免疫反應(yīng)通過例如表面等離子共振技術(shù)或者在具有傳導(dǎo)性聚合物的電極上通過循環(huán)伏安法(cyclicvoltametr)觀測。間接檢測是利用標(biāo)記“揭示試劑”結(jié)合配偶體，或者是感興趣的腫瘤標(biāo)記物自身進(jìn)行。在后者情況中，其隨后被描述為競爭方法。術(shù)語“標(biāo)記，，是指使標(biāo)記試劑的附著能直接或間接產(chǎn)生可檢測的信號。這些標(biāo)記試劑非限制性包括·酶，其產(chǎn)生例如通過比色法、熒光或者發(fā)光而可被檢測的信號，所述酶例如是辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β"半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；·生色團(tuán)，如熒光或發(fā)光化合物或染料；·放射性分子，如32P、35S或1251，以及熒光分子如Alexa或藻藍(lán)蛋白。也可以使用間接檢測系統(tǒng)，例如能與抗配體反應(yīng)的配體。配體/抗配體對為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如如下一對生物素/鏈霉抗生物素，半抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/與該多核苷酸互補(bǔ)的序列。在這種情況中，其是具有結(jié)合配對物的配體?？古潴w可以通過前文所述標(biāo)記試劑直接檢測，或者通過配體/抗配體自身檢測。這些間接檢測系統(tǒng)在一定條件下可以導(dǎo)致信號放大。這種信號放大技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，可參見本申請人先前的專利申請F(tuán)R98/10084或W0-A-95/08000，或者Chevalier等的文章59。根據(jù)所用標(biāo)記的類型，本領(lǐng)域技術(shù)人員加入使得可以觀測顯示標(biāo)記的試劑。舉例的上述免疫測定可以提及的是“夾心”方法，如ELISA、IRMA和RIA，“競爭”方法和直接免疫檢測方法如免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、Western印跡和Dot印跡方法。質(zhì)譜分析法也可用于在生物學(xué)樣品中檢測本發(fā)明方法探求的腫瘤標(biāo)記物。光譜法的原理為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如在Patterson，S.60中描述。為此，將預(yù)處理或未預(yù)處理的生物學(xué)樣品經(jīng)過質(zhì)譜分析儀，將獲得的質(zhì)譜與本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的質(zhì)譜對比。舉例的樣品預(yù)處理方法包括將其經(jīng)過免疫捕獲支持物，所述免疫捕獲支持物包含本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體之一，例如本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的抗體。另一種樣品預(yù)處理方法包括預(yù)先分級分離所述生物學(xué)樣品，以將樣品的蛋白質(zhì)彼此分離。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)中，樣品的主要蛋白質(zhì)可例如首先被耗竭。當(dāng)本發(fā)明的方法是“夾心”法時，應(yīng)利用兩種單克隆抗體或可選一種單克隆抗體以及一種多克隆抗體。當(dāng)然，在后一種情況中，單克隆抗體是至少抗埃茲蛋白單克隆抗體，其針對選自以下表位序列的埃茲蛋白表位SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4+SEQIDNo.5，SEQIDNo.6+SEQIDNo.7和SEQIDNo.8。已知抗-埃茲蛋白抗體的實(shí)例，且可得自Abeam目錄，例如兔抗-埃茲蛋白多克隆抗體，Cat.No.Ab474180根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，本發(fā)明的方法利用兩種單克隆抗體，優(yōu)選針對表位序列SEQIDNo.1的至少一種抗埃茲蛋白單克隆抗體以及至少一種另外的單克隆抗體，其針對選自以下表位序列的埃茲蛋白表位SEQIDNo.2,SEQIDNo.4+SEQIDNo.5和SEQIDNo.6+SEQIDNo.7。更優(yōu)選，本發(fā)明的方法利用針對表位序列SEQIDNo.1的至少一種抗埃茲蛋白抗體以及針對SEQIDNo.4+SEQIDNo.5的至少一種另外的抗體。此外，當(dāng)本發(fā)明的方法是免疫組織化學(xué)法時，優(yōu)選利用針對表位序列SEQIDNo.2的至少一種抗埃茲蛋白單克隆抗體，這構(gòu)成本發(fā)明的具體實(shí)施方案。確定生物學(xué)樣品中感興趣的“mRNA”腫瘤標(biāo)記物的存在可以通過確定樣品中mRNA存在的任何方法進(jìn)行，即通過直接檢測mRNA或者間接檢測mRNA，或者通過確定樣品中RNA存在的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法進(jìn)行。術(shù)語“直接檢測mRNA”是指證實(shí)生物學(xué)樣品中所述mRNA自身。直接檢測生物學(xué)樣品中mRNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式進(jìn)行，例如通過與特異于該mRNA的結(jié)合配偶體雜交，其中進(jìn)行適當(dāng)?shù)腜CR擴(kuò)增，或者NASBA技術(shù)。術(shù)語“雜交”是指在合適條件下兩個核苷酸片段通過穩(wěn)定且特異的氫鍵彼此結(jié)合，形成雙鏈復(fù)合物。這些氫鍵在互補(bǔ)堿基之間形成，如腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)(或者尿嘧啶(U))(稱作A-T鍵)，或者鳥嘌呤(G)與胞嘧啶(C)(稱作G-C鍵)。兩個核苷酸片段的雜交可以是完全的(參見互補(bǔ)核苷酸片段或序列)，即在此雜交期間獲得的雙鏈復(fù)合物僅包含A-T鍵和C-G鍵。這種雜交也可以是部分雜交(參見足夠互補(bǔ)的核苷酸片段或序列)，即獲得的雙鏈復(fù)合物包含使得可以形成雙鏈復(fù)合物的A-T鍵和C-G鍵，但是也包含與互補(bǔ)堿基未鍵合的堿基。兩個核苷酸片段之間的雜交依賴于使用的雜交條件，特別是嚴(yán)格性。嚴(yán)格性被特別定義為兩個核苷酸片段的堿基成分的函數(shù)(function)，以及兩個核苷酸片段之間錯配程度。嚴(yán)格性也可以依賴于反應(yīng)參數(shù)，如雜交溶液中存在的離子的濃度和類型、變性劑的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知所有這些數(shù)據(jù)，且可以確定合適的條件。通常地，根據(jù)希望雜交的核苷酸片段的長度，雜交溫度介于大約20-70°C之間，特別是介于35-65°C之間，鹽溶液的濃度介于大約0.5-1M之間。特異于或非特異于所述mRNA的結(jié)合配偶體是能結(jié)合該mRNA的任何配偶體。例如，可以提及的是核酸探針、擴(kuò)增引物，以及能結(jié)合該mRNA的任何其它分子。術(shù)語“雜交探針”是指包含5-100個核酸單位、特別是10-35個核酸單位的核苷酸片段，其在指定條件下具有雜交特異性，與特異于感興趣的靶基因的材料形成雜交復(fù)合物。雜交探針可包含使其可以被檢測的標(biāo)記。對于本發(fā)明，術(shù)語“擴(kuò)增引物”是指包含5-100個核酸單位、優(yōu)選15-30個核酸單位的核苷酸片段，其可以起始酶促聚合化如酶促擴(kuò)增反應(yīng)。術(shù)語“酶促擴(kuò)增反應(yīng)”是指通過至少一種酶的作用產(chǎn)生核苷酸片段的多個拷貝的過程。這種擴(kuò)增反應(yīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，可以特別提及的是如下技術(shù)-PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，如專利US4683195,US4683202和US4800159所述；-NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，見專利申請WO91/02818所述；及-TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增)，見US5399491專利所述。術(shù)語“檢測”是指插入染料如SYBRGreenI或者溴化乙錠的物理方法或者化學(xué)方法，或者使用標(biāo)記檢測的方法。有許多檢測核酸的方法62。合適的標(biāo)記如上文所述。對于本發(fā)明，雜交探針可以是“檢測”探針。在這種情況中，“檢測”探針用如上述標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)這種標(biāo)記的存在，可以檢測指定檢測探針與被檢測的轉(zhuǎn)錄物之間的雜交反應(yīng)的存在。所述檢測探針可以特別是“分子信標(biāo)”檢測探針63。這些“分子信標(biāo)”在雜交期間成為具有熒光性。它們具有一個莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，且含有熒光團(tuán)和猝光基團(tuán)。特異性環(huán)序列與其互補(bǔ)靶核酸序列的結(jié)合使得莖伸展，以及在激發(fā)期間以合適波長發(fā)射熒光信號。雜交探針也可以是“捕獲”探針。在這種情況中，“捕獲”探針可以通過任何適當(dāng)方式被固定或者可以固定于固體支持物上，即例如通過共價鍵或者吸附而直接或間接固定。合適的固體支持物為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，例如可以提及的是合成材料或天然材料、乳膠、磁性粒子、金屬衍生物、凝膠等。所述固體支持物可以是微滴定平板形式，專利申請W0-A-94/12670中描述的膜或者粒子。在該支持物上也可以固定一些不同的捕獲探針，每個捕獲探針均特異于靶轉(zhuǎn)錄物。特別地，可以使用其上固定了大量探針的生物芯片作為支持物。探針固定于支持物上也為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，可以提及的是通過直接轉(zhuǎn)移、顯微沉積(microd印osition)、原位合成及光刻術(shù)固定探針。生物學(xué)樣品中編碼感興趣的腫瘤標(biāo)記物的基因中的DNA修飾或異常的證實(shí)可以通過確定樣品中DNA改變的任何方法進(jìn)行，即直接檢測突變，或者證實(shí)感興趣的基因座的甲基化模式改變，或者通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的確定樣品中DNA改變的任何其它方法進(jìn)行。突變可包括一個核苷酸由另一個核苷酸取代、缺失一或多個核苷酸以及插入一或多個核苷酸。所述突變可位于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的編碼區(qū)，或者位于5’和3’非編碼區(qū)，如轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)或者轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。證實(shí)突變的策略基于分子生物學(xué)技術(shù)，包括如下步驟DNA提取、PCR擴(kuò)增或者另一擴(kuò)增技術(shù)、雜交和/或測序。在結(jié)腸直腸癌情況中，如下方法已經(jīng)成功用于檢測糞便DNA中的突變通過沉淀濃縮DNA，使用磁珠上的捕獲寡核苷酸使靶富集，PCR擴(kuò)增感興趣的基因，固相測序以鑒別點(diǎn)突變64。根據(jù)預(yù)期參考片段與突變片段之間大小的差異鑒別缺失。Imperiale等64描述了位于K-ras、APC和p53基因中的一組21個突變，使得可以檢測16/31侵潤性癌。其它使用的DNA標(biāo)記物是BAT-26缺失，其是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的標(biāo)記物，以及稱作長DNA(L-DNA)的可高度擴(kuò)增的DNA，其不是特異性標(biāo)記物，但是似乎反映結(jié)腸腔中脫落的腫瘤細(xì)胞的紊亂的凋亡65。這些標(biāo)記物在靈敏性或特異性方面均不令人滿意。如前所述，DNA改變也可相應(yīng)于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的甲基化模式的修飾。所述甲基化模式的修飾可相應(yīng)于低甲基化(甲基化數(shù)目減少)或者高甲基化(甲基化數(shù)目增多)。改變的單位位于感興趣的腫瘤標(biāo)記物基因的編碼區(qū)內(nèi)，或者位于5’和3’非編碼區(qū)，如轉(zhuǎn)錄啟動子區(qū)或者轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。DNA甲基化的分析可以使用基于定性和/或定量PCR的技術(shù)進(jìn)行，如MSP(甲基化特異性PCR)、亞硫酸氫鹽測序、結(jié)合PCR用甲基化敏感的限制酶消化、C0BRA(組合亞硫酸氫鹽限制分析)和Ms-SNuPE(甲基化敏感的單核苷酸引物延伸)。所有這些技術(shù)均已經(jīng)充分綜述以及在方法學(xué)文章中詳細(xì)描述66。在文獻(xiàn)中已經(jīng)報道了在結(jié)腸直腸癌病例中的一些高甲基化基因。例如可以提及的是ALX4(無芒樣同源框-4)基因56、TPEF/HHP1(含有表皮生長因子和卵泡抑素結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白)基因的啟動子區(qū)67或者s印tin-9基因68。在本發(fā)明方法中，當(dāng)檢測至少兩個標(biāo)記物時，可以例如使用不同的免疫測定或者在同時多元測定中單獨(dú)證實(shí)。在本發(fā)明方法中，當(dāng)檢測不同性質(zhì)的兩個標(biāo)記物時，例如蛋白質(zhì)標(biāo)記物和mRNA標(biāo)記物，可以使用選自上述那些的兩種不同檢測方法。它們也也可以在系統(tǒng)反應(yīng)條件下在同一檢測介質(zhì)中同時檢測，如專利申請W003/104490所述。這個專利申請中描述的檢測方法包括如下步驟，該檢測方法包括同時檢測樣品中的雜交和免疫反應(yīng)，可含有由至少一種核酸和不同性質(zhì)的至少一種其它配體組成的靶分析物(i)將已知體積的在反應(yīng)緩沖液中稀釋的樣品沉積在用所述靶分析物的捕獲配偶體預(yù)先包被的捕獲表面上，所述捕獲配偶體包含至少一個核酸探針和至少一個抗配體，(ii)在介于15°C-60°C之間的溫度下反應(yīng)，(iii)觀測因此獲得的雜交和免疫反應(yīng)。所述生物學(xué)樣品可能需要特殊處理，因?yàn)槠淇赡芎斜景l(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物，或者另外其可能含有具有本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，和/或能分泌本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，對生物學(xué)樣品進(jìn)行預(yù)處理以分離所述液體中含有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。短語“分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞”是指獲得富含循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞級分?？梢酝ㄟ^如下方式對生物學(xué)樣品進(jìn)行處理以分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行細(xì)胞淘選，在Ficoll上富集，用特異性抗體包被的磁珠富集，或者使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的特異性富集的任何其它方法。在血液作為生物學(xué)樣品的情況中，循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以通過如下技術(shù)分離，即在Ficoll上分離細(xì)胞，組合使用與磁珠結(jié)合的抗-⑶45抗體耗竭血細(xì)胞(DynalBiotechASA,Norway)?？梢酝ㄟ^如下方式使用分離自生物學(xué)樣品的循環(huán)腫瘤細(xì)胞直接進(jìn)行本發(fā)明方法中探求的腫瘤標(biāo)記物檢測，即在通過細(xì)胞離心涂片器使循環(huán)腫瘤細(xì)胞沉積在載玻片上之后，例如通過用本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的抗體對這些細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記。17也可以在循環(huán)腫瘤細(xì)胞中直接進(jìn)行本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的檢測，使用如M6t6zeaU等69所述的流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。在這些條件下，所述循環(huán)細(xì)胞可以在一定條件下處理，以使其能在所述細(xì)胞內(nèi)部阻斷本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物。這種處理由Mathieu等7°描述。在使得細(xì)胞膜可滲透以使特異于本發(fā)明方法尋找的標(biāo)記物的結(jié)合配偶體能進(jìn)入細(xì)胞之后，進(jìn)行本發(fā)明方法尋找的腫瘤標(biāo)記物的檢測?；谘h(huán)細(xì)胞直接檢測本發(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物也可以通過ELISP0T方法進(jìn)行，例如通過本申請人申請的專利申請WO03/076942中描述的方法進(jìn)行。這種方法是檢測和/或量化生物學(xué)樣品的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，該細(xì)胞在體外能釋放或分泌一或多種腫瘤標(biāo)記物，所述方法包括如下步驟(i)使一定量的所述細(xì)胞沉積于培養(yǎng)表面的底部，該底部附著了特異于所述腫瘤標(biāo)記物的至少一種結(jié)合配偶體，(ii)在一定條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，使其釋放或分泌所述腫瘤標(biāo)記物，該標(biāo)記物被免疫捕獲于所述培養(yǎng)表面的底部，(iii)通過洗滌除去細(xì)胞，(iv)加入特異于所述腫瘤標(biāo)記物的至少一種標(biāo)記的綴合物，及(ν)觀測由此獲得的標(biāo)記。直接檢測腫瘤細(xì)胞中本發(fā)明方法使用的腫瘤標(biāo)記物也可以在所述細(xì)胞的培養(yǎng)基中進(jìn)行，在一定條件下培養(yǎng)細(xì)胞，由此其分泌本發(fā)明方法中使用的腫瘤標(biāo)記物，之后進(jìn)行檢測。釋放腫瘤標(biāo)記物或者腫瘤標(biāo)記物表達(dá)的培養(yǎng)條件是常規(guī)條件，如37°C濕化環(huán)境及5%CO2的條件。當(dāng)生物學(xué)樣品是固體樣品時，腫瘤標(biāo)記物的存在也可以在體內(nèi)、在腫瘤原位示出。為了在體內(nèi)在腫瘤中示出腫瘤標(biāo)記物的存在，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何成像技術(shù)。為此，所述腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體可以與成像示蹤劑結(jié)合。術(shù)語“結(jié)合配偶體與成像示蹤劑的結(jié)合”是指能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何成像方法檢測的示蹤劑或者直接或間接產(chǎn)生可檢測信號的示蹤劑的附著。因此，所述示蹤劑可以是放射性示蹤劑，如锝-99。在這種情況中，具有原發(fā)癌或者轉(zhuǎn)移癌的器官將結(jié)合所述腫瘤標(biāo)記物及其示蹤劑?？梢杂锰厥庀鄼C(jī)如Y-相機(jī)使由該器官發(fā)射的放射線成像。該設(shè)備收集由放射性物質(zhì)產(chǎn)生的閃爍，并因此可以觀測所述器官。在本發(fā)明另一方法中，所述示蹤劑可包含發(fā)射正電子的放射性物質(zhì)(氟18)。然后通過正電子發(fā)射斷層成像系統(tǒng)成像。在本發(fā)明另一優(yōu)選方法中，腫瘤標(biāo)記物的配偶體可以與納米粒子結(jié)合。所述納米粒子可以例如是超磁性(supramagnetic)納米粒子，如用于指導(dǎo)細(xì)胞標(biāo)記和通過核磁共振成像技術(shù)在體內(nèi)檢測的陰離子磁性納米粒子。它們也可以是金納米粒子。利用可以在體內(nèi)檢測腫瘤標(biāo)記物的本發(fā)明方法，可以觀測身體中結(jié)合腫瘤標(biāo)記物的結(jié)合配偶體的區(qū)域、產(chǎn)生腫瘤標(biāo)記物的癌瘤，特別是在結(jié)腸直腸癌中，以及其遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)移癌的位置和包含的淋巴結(jié)的位置。本發(fā)明的方法不僅可用于結(jié)腸直腸癌的早期診斷，也可以用于結(jié)腸直腸癌的篩選、治療隨診、預(yù)后及復(fù)發(fā)診斷，因?yàn)橹挥邪┘?xì)胞分泌?；被崴饷?，且其產(chǎn)生依賴于癌的級別，這些方面組成了本發(fā)明的另一方面。此外，本發(fā)明描述的表位具有序列SEQIDNo.1，SEQIDNo.2，SEQIDNo.3，SEQIDNo.4+SEQIDNo.5，SEQIDNo.6+SEQIDNo.7或SEQIDNo.8，其為新的并且構(gòu)成本發(fā)明的另一主題。本發(fā)明通過如下實(shí)施例以及附圖1-21得以更清晰地理解，這些實(shí)施例只是例證本發(fā)明而不限制本發(fā)明之意。-圖1是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中LEI(ng/ml)的圖示，-圖2是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中埃茲蛋白(ng/ml)的圖示，-圖3是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中酰化氨基酸水解酶1(ng/ml)的圖示，-圖4是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中L-FABP(ng/ml)的圖示，-圖5是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中I-FABP(pg/ml)的圖示，-圖6是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中載脂蛋白AI(i!g/ml)的圖示，通過微滴定平板ELISA(圖6A)或者使用Lincoplex試劑盒(圖6B)，-圖7是使用Linco多元試劑盒分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中載脂蛋白AlKyg/ml)的圖示，-圖8是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中1_絲束蛋白的RFV(相對熒光值)的圖示，-圖9是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中32-微球蛋白(ng/ml)的圖示，-圖10是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中CEA(ng/ml)的圖示，-圖11是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中CA19-9(U/ml)的圖示，-圖12是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中睪酮(ng/ml)的圖示，-圖13是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中E_鈣粘蛋白(ng/ml)的圖示，-圖14是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中PAP1(ng/ml)的圖示，-圖15是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中半乳凝素_3的RFV的圖示，-圖16是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中LDH(ng/ml)的圖示，-圖17是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)血清中蛋白酶體20S(ng/ml)的圖示，-圖18是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中酰化氨基酸水解酶1(ng/ml)的圖示，-圖19是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中半乳凝素_3的RFV的圖示，-圖20是通過ELISA分析結(jié)腸直腸癌患者(CRC+)和健康個體(CRC-)糞便中蛋白酶體20S的RFV的圖示，-圖21是對LEI、埃茲蛋白和半乳凝素-3進(jìn)行ELISP0T測定的示意圖，示出Caco-2、HT-29和HT29-B6的每IO6個癌細(xì)胞的斑點(diǎn)數(shù)目。棚列1別·示適臓剛械輔會目舶馳表汰1.cDNA擴(kuò)增與克降將Caco-2結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有2mM的L-谷氨酰胺，不含F(xiàn)CS(胎牛血清)(均來自Gibco)。為了克隆LEI、L-FABP和Gal_3基因，從IO8個Caco_2細(xì)胞沉淀中提取信使RNA，使用InvitrogenFastTrack2.O試劑盒(Cat.No.45-0019)根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行。在一個步驟中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR，使用450ng的Caco_2mRNA及SuperscriptIIIOneStepRT-PCRSystem試劑盒(InvitrogenCat.No.12574-018)以及使用PlatinumTaqDNA聚合酶，根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行。用于基因擴(kuò)增的PCR引物在表1中提供。表11因和引物寡核苷酸~LEIOL215(SEQIDNo.9)5'-ATGGAGCAGCTGAGCTCAGCAAAC-3’OL216(SEQIDNo.10)5'-CTAAGGGGAAGAAAATCTCCCCAA-3‘L-FABP正向(SEQIDNo.11)5'-CGGAGCGTCTCCCATGAGTTTCTCCGGCAAGTA-3'反向(SEQIDNo.12)5'-GAAATGCAGACTTGTCTAGATGCGCTTGCTGATGCGCTTGAAGACAATG-3'Gal-3OL217(SEQIDNo.13)5，-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3，OL218(SEQIDNo.14)5'-TTATATCATGGTATATGAAGCACTGG-3'_將獲得DNA片段通過使用TA克隆試劑盒(InvitrogenCat.No.K4520-01)克隆進(jìn)載體pCR2.1T0P0(LEI和Gal-3)中，或者克隆進(jìn)用BsmBI和XbaI消化后的來自O(shè)rigene的載體PCMV6-XL4(L-FABP)中。對質(zhì)粒進(jìn)行測序，以核實(shí)cDNA確實(shí)符合預(yù)期序列。對于編碼酰化氨基酸水解酶1的基因的克隆，使用來自Qiagen的RNAEasyMini試劑盒根據(jù)廠商提供的方案從IO8個Caco-2細(xì)胞沉淀中提取總RNA。使用IOng的Caco-2RNA和SuperscriptII酶(Invitrogen)根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。該逆轉(zhuǎn)錄引物是oligo(dT)。得自這個反應(yīng)的cDNA用作PCR中模板，使用AccuPrimePfx試劑盒(InvitrogenCat.No.12344-024)根據(jù)廠商提供的方案進(jìn)行反應(yīng)。所述PCR引物是ACY_1Fwd2(SEQIDNo.15:5，-GCGAATTCTTTAAGAAGGAGATATACATATGACGAGCAAAGGTCCGGAAGAGGAGCACCCATCG-3，)和ACY-1Rev(SEQIDNo.16:5，-GCAAGCTTCAGCTGTCACTGGGCAGGGC-3’)。在這些條件下，可以擴(kuò)增1.3kb片段，將其克隆進(jìn)ZeroBluntT0P0PCR克隆試劑盒型克隆載體(InvitrogenCat.No.K2820-20)中。對這個質(zhì)粒測序以核實(shí)cDNA確實(shí)符合預(yù)期序列。通過化學(xué)合成方法獲得含有I-FABP開放讀框的如下DNA片段(SEQIDNo.17)，該合成由Geneart公司進(jìn)行。SEQIDNo.17GGTACCGAATTCCGCGTTTGACAGCACTTGGAAGGTAGACCGGAGTGAAAACTATGACAAGTTCATGGAAAAAATGGGTGTTAATATAGTGAAAAGGAAGCTTGCAGCTCATGACAATTTGAAGCTGACAATTACACAAGAAGGAAATAAATTCACAGTCAAAGAATCAAGCGCTTTTCGAAACATTGAAGTTGTTTTTGAACTTGGTGTCACCTTTAATTACAACCTAGCAGACGGAACTGAACTCAGGGGGACCTGGAGCCTTGAGGGAAATAAACTTATTGGAAAATTCAAACGGACAGACAATGGAAACGAACTGAATACTGTCCGAGAAATTATAGGTGATGAACTAGTCCAGACTTATGTGTATGAAGGAGTAGAAGCCAAAAGGATCTTTAAAAAGGATTCTAGAGTCGACGAGCTC。2.表汰載體構(gòu)津?qū)⒕幋aLEI和半乳凝素_3的基因亞克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PMR7871中，以及將L-FABP基因克隆進(jìn)載體pET3d(NewEnglandBiolabs)中。使用質(zhì)粒pCR2.1T0P0-LEI、pCR2.1TOPO-Gal-3和pCMV6-LFABP作為模板通過PCR導(dǎo)入克隆所需的限制位點(diǎn)。所述PCR酶是PromegaPfuDNA聚合酶，PCR反應(yīng)根據(jù)廠商指導(dǎo)進(jìn)行，引物示于表2中。表2基因和引物寡核苷酸LEIOL228(SEQIDNo.18)OL229(SEQIDNo.19)L-FABP正向(SEQIDNo.20)反向(SEQIDNo.21)Gal-3OL230(SEQIDNo.22)OL231(SEQIDNo.23)5'-ATGGGAATTCAGGAGCAGCTGAGCTCAGCAA-3'5'-CGATAAGCTTAAGGGGAAGAAAATCTCCCC-3'5'-GCTGGCCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACATGAGTTTCTCCGGCAAGTACCAAC-3'5'-GCACGGATCCTAGATGCGCTTGCTGATGCGCTTGAAGAC-3'5'-ATGGGAATTCAGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3’5'-CGATAAGCTTATATCATGGTATATGAAGCACTGG-3'將含有編碼LEI或半乳凝素-3的開放讀框的PCR產(chǎn)物用EcoRI和Hindlll限制酶消化。將片段導(dǎo)入用相同的酶限制的載體PMR78中(質(zhì)粒pMR-LEI和pMR-Gal-3)。載體PMR78含有與表達(dá)的蛋白質(zhì)符合讀框的6-組氨酸序列，使得可以通過金屬螯合親和層析純化。將L-FABPPCR產(chǎn)物克隆進(jìn)載體pET3d中NcoI和BamHI限制位點(diǎn)。對于?；被崴饷?，將T0P0克隆載體直接用EcoRI和HindIII限制酶消21化，以產(chǎn)生含有acyl開放讀框的1.3kb片段，其被導(dǎo)入pStabyl(Eurogentec)中。該重組質(zhì)粒被稱作pStabyl-ACY。對于I-FABP，將由Geneart提供的克隆載體用EcoRI和SalI限制酶消化，以產(chǎn)生含有編碼序列的大約400bp片段，將其導(dǎo)入載體pMRCH79(衍生自載體pMR78，bi0M6rieuX)中。該重組質(zhì)粒被稱作pMRCH-IFABP?？梢苑謩e表達(dá)與GST(谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶)融合的埃茲蛋白和I-絲束蛋白的質(zhì)粒pGEX-埃茲蛋白和pGEX-I-絲束蛋白由InstitutCurie提供。3.重組蛋白質(zhì)表汰與純化將產(chǎn)生重組腫瘤標(biāo)記物的表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21及其衍生物(Stratagene)中。在室溫?fù)u動培養(yǎng)。每種蛋白質(zhì)的精確培養(yǎng)條件示于表3中。IPTG是異丙基-β-D-I-硫代半乳糖酶。將細(xì)菌沉淀置于2XPBS(磷酸鹽緩沖鹽水)緩沖液中，并以1.5kbar通過細(xì)胞粉碎機(jī)(ConstantSystem)。將裂解產(chǎn)物在3000g在4°C離心30分鐘。上清含有可溶蛋白質(zhì)。所述沉淀含有包涵體。增溶包涵體的緩沖液根據(jù)所述蛋白質(zhì)而定。對于LEI，在含有5mL的Ni-NTA-S印harose樹脂(Qiagen)的柱上使用可溶分級分離法進(jìn)行純化，蛋白質(zhì)用含有450mM咪唑的2XPBSpH7.5洗脫。對于半乳凝素-3，將包涵體在含有IM尿素的2XPBS中溶解，經(jīng)過5mL的Ni-NTA-Sepharose樹脂柱(Qiagen)，用含有450mM咪唑和IM尿素的2XPBSpH7.5洗脫Gal-3蛋白。對于L-FABP，使用可溶分級分離法進(jìn)行純化，使用來自Macherey-Nagel的Ni-IDA試齊U盒。表3菌株培養(yǎng)體積IPTG誘導(dǎo)純化LEIBL21250mL0.1mMNi-NTAGal-3BL21-密碼子400mL0.5mMNi-NTA加上(DE3)-RIPLL-FABPBL21500mL0.1mMNi-IDAGST-埃茲蛋白BL21250mL0.1mMGSTACY-IBL21-密碼子500mL0.1mM其他_加上(DE3)-RIPL_對于GST-埃茲蛋白，通過GST親和層析，使用在含有8M尿素和IOmMDTT的IOOmMTris緩沖液中溶解的包涵體進(jìn)行純化。使用含有5mL谷胱甘肽瓊脂糖4快速流動凝膠(Amersham)的層析柱。平衡和洗滌緩沖液是含有0.05%Tween20的2XPBS。洗脫緩沖液是含有20mM還原的谷胱甘肽的50mMTris-HCl(pH8)。對于?；被崴饷?，將培養(yǎng)物的可溶級分經(jīng)過AmershamHiTrapQFF柱，并且使用0.3MNaCl(pH7.5)洗脫ACY-I蛋白。由于一些其它蛋白質(zhì)在這些條件下被共洗脫，因此繼續(xù)在疏水性相互作用柱(HICPhenylHP，Amersham)上進(jìn)行純化。使用0.5MNaCl(pH7)洗脫ACY-I蛋白。重組GST-I-絲束蛋白蛋白由InstitutCurie以純化形式提供。；￡會且丐網(wǎng)胃白胃白由ProteusServicesforIndustry(Dijon,France)產(chǎn)。編碼鈣網(wǎng)蛋白的序列通過化學(xué)合成方法獲得。實(shí)施例2腫瘤標(biāo)記物的單克降抗體的產(chǎn)牛1.動物樽型對6-8周齡的雌性BALB/c(H_2d)小鼠在第一次免疫時進(jìn)行免疫試驗(yàn)。2.免疫原和免疫為了增加在小鼠中獲得的免疫應(yīng)答以及為了能產(chǎn)生單克隆抗體，根據(jù)實(shí)施例1所述的程序產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)形式的腫瘤標(biāo)記物。LDH蛋白得自SciPac公司(Cat.No.103-133)。這些蛋白質(zhì)與Freimd's佐劑(Sigma)混合，所述佐劑以油包水乳狀液形式制備，且已知其具有良好的免疫原性。每種腫瘤標(biāo)記物免疫3只小鼠。小鼠在第0、2和4周連續(xù)接受3次10yg劑量。所有注射均是皮下注射。第一次注射給予與完全Freimd’s佐劑的混合物，隨后兩次注射給予與不完全Freimd's佐劑的混合物。在第一次注射后D50-D70之間，通過靜脈內(nèi)注射100yg該重組蛋白質(zhì)再次刺激體液應(yīng)答。3.監(jiān)測體液應(yīng)答的出現(xiàn)為了監(jiān)測抗體的出現(xiàn)，定期從小鼠取血樣。使用ELISA檢測抗-腫瘤標(biāo)記物抗體的存在。感興趣的蛋白質(zhì)用于捕獲(lPg/孔)；飽和后，使抗原與不同稀釋度的檢測血清反應(yīng)(在37°C保溫1小時)。血清中特異性抗體的存在通過使用與堿性磷酸酶綴合的結(jié)合尋找的抗體的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG抗體(H+L,JacksonImmunoresearch,Catno.115-055-146)(0.1ug/well)表明。4.單克隆抗體的產(chǎn)生在最后一次注射每種腫瘤標(biāo)記物3天后，處死一只免疫的小鼠。取血液和脾。將得自脾的脾細(xì)胞與Sp2/0-Agl4骨髓瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)，以使其融合并變成永生化，根據(jù)KohlerandMilstein所述方案72’73進(jìn)行。在保溫12-14天之后，篩選獲得的雜交瘤上清以確定抗腫瘤標(biāo)記物抗體的存在，使用在這個實(shí)施例第3點(diǎn)描述的ELISA測定。當(dāng)GST融合蛋白用作免疫原時，針對GST的克隆通過使用未結(jié)合的GST捕獲進(jìn)行ELISA篩選得以消除。根據(jù)限制稀釋技術(shù)將陽性雜交瘤集落亞克隆兩次，這種技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。5.通過免疫印跡鑒定單克隆抗體針對各種腫瘤標(biāo)記物獲得的單克隆抗體列于表4中。通過Western印跡技術(shù)分析這些單克隆抗體。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>5.1.方法學(xué)制備Caco-2和HT-29細(xì)胞培養(yǎng)提取物，通過用含有8.3M尿素、2M硫脲、4%3_[(3-膽胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、100mMDTT,2%Servalyte4-9(Serva,Heidelberg,Germany)和0.lg/1OrangeG的600μ1水溶液溶解細(xì)胞沉淀，然后根據(jù)NuPAGENovex凝膠樣品制備方案(Invitrogen)進(jìn)行處理。為了獲得組織提取物，使用手術(shù)刀切下GHBD001、GHBD004和CLSP109患者的腫瘤和粘膜活檢組織，然后使用50-μmMedicons以及Iml含有2.5mMEDTA和蛋白酶抑制劑(片劑，Roche)的PBS緩沖液在Medimachine系統(tǒng)(BectonDickinson)中提取10次。集合這些IOml的細(xì)胞懸浮液，制成25ml，然后在600g離心15分鐘。上清相應(yīng)于根據(jù)NuPAGENovex凝膠樣品制備方案處理的組織提取物。使用還原的樣品，最終總蛋白質(zhì)濃度為0.4mg/ml。在NuPAGENovexBis-Tris4-12%凝膠上沉積體積為20μ1/孔，使用MOPS運(yùn)轉(zhuǎn)緩沖液。在遷移(200V，1小時)及轉(zhuǎn)移至PVDF膜(400mA，45分鐘)之后，通過用氨基黑染色評定轉(zhuǎn)移物的性質(zhì)。將該膜用在TNT(15mMTris、0.14MNaCl、0·5%Tween20，pH8)溶液中的5%脫脂乳(R6gilait)在室溫飽和1小時。在飽和后，將該膜與在飽和溶液中稀釋為IOyg/ml的各種檢測抗體一起保溫1小時。在用TNT漂洗后，將該膜在室溫與在飽和溶液中稀釋為15000的抗小鼠-辣根過氧化物酶綴合物(CatNo.115-035-062，JacksonImmunoresearch)呆iUlzj、時。在漂1后，使用SubstrateSupersignalWestDuraExtended試劑盒(CatNo.34076,Pierce)根據(jù)推薦的使用指導(dǎo)進(jìn)行顯影。使用來自Biorad的VersaDoc成像系統(tǒng)測量該膜上的化學(xué)發(fā)光信號?；赪estern印跡成像，使用QuantityOne軟件(Bio-Rad)評估相應(yīng)于各種腫瘤標(biāo)記物的條帶的體積。所述體積相應(yīng)于條帶的表面積乘以化學(xué)發(fā)光信號的強(qiáng)度。5.2.結(jié)果Western印跡結(jié)果示于表5，表中示出了Western印跡分析的相應(yīng)于感興趣的腫瘤標(biāo)記物的條帶的體積，其是檢測的各個樣品的函數(shù)。這些結(jié)果示出檢測的腫瘤標(biāo)記物確實(shí)由Caco-2和HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系表達(dá)，而且也在組織中表達(dá)，這些根據(jù)使用得自該患者的腫瘤和粘膜的提取物示出?？梢詫Ρ仁褂每贵w在樣品上獲得的信號強(qiáng)度與使用其它樣品和相同抗體獲得信號強(qiáng)度。所用技術(shù)使得可以證實(shí)組織(非遠(yuǎn)離樣品)中所述標(biāo)記物的存在與否，以及抗體對于標(biāo)記物的特異性。這個技術(shù)不用于這個實(shí)施例的遠(yuǎn)離樣品中，因?yàn)槠洳豢梢酝茢噙h(yuǎn)離樣品中腫瘤標(biāo)記物的存在與否，也不可以確定所述樣品中所述腫瘤標(biāo)記物的濃度是否增加或降低。此外，使用的實(shí)驗(yàn)方案不能對比一種抗體的反應(yīng)性與另一種抗體的反應(yīng)性。表5腫瘤標(biāo)記物和P~“~~腫瘤組織粘膜組織腫瘤組織粘膜組織腫瘤組織Caco-2HT-29抗體_GHBDOO1GHBD004GHBD004CLSP109CLSP109~LE121B10A583657678NT6020036506NTNT10E1H100NT133576893NTNT埃茲蛋白4A9H5123436116448424801530367439NTNT4A7A6C14D9B91215641038334205181011848NT酸化氨基酸水4G11B1057741209446362623879130522NT解酶158B5G6NTNTNTNTNTNT2A7F6G411H7D94A9H570664742NTNTNT1588"士;5G2D11361558NTNTNT206ι-絲束蛋白23DIID108A8G6458199NTNTNT519D2A115801736NTNTNT5428C8C5韓網(wǎng)蛋白5C10H10106874787NTNTNT4477723811B6D11217664232005360931051330233NTNTLDH3F11E11136725NTNTNTNT27547724656412F10G855711104364770NTNT半乳凝素-312F8A1228423040NTNTNT2503329414A5G132612937NT_NT_NT_2070_2764NT:未檢測。5.3.抗I-絲束蛋白的單克隆抗體在GHBD004患者中，8C8C5抗體未使得對應(yīng)1_絲束蛋白的條帶顯色或者僅微弱顯色。這些樣品中I-絲束蛋白的存在可以通過使用例如8G2D2抗體證實(shí)，該抗體在印跡中對于I-絲束蛋白具有較好親和性。由于I-絲束蛋白是包含具有70%以上同源性的兩個其它同種型(L-絲束蛋白和T-絲束蛋白)的蛋白質(zhì)家族成員，我們檢測了獲得的單克隆抗體的所有克隆與GST-絲束蛋白-L和GST-絲束蛋白-T蛋白質(zhì)(InstitutCurie提供)的反應(yīng)性。在這個篩選結(jié)束時，我們選擇與其它家族成員不具有任何交叉反應(yīng)性的克隆3D11D10、8C8C5、3A3H2和8G2D2。這些抗體確實(shí)特異于I-絲束蛋白同種型。6.利用Spotscan技術(shù)表征單克隆抗體識別的表位6.1方法Spotscan技術(shù)(根據(jù)Frank和DGring73改變)，使得可同時合成大量附著于纖維素膜的肽。這些肽再生成8-12個氨基酸的肽形式的靶抗原的序列，所述序列通過1-4個殘基重疊。這些肽隨后在印跡型比色實(shí)驗(yàn)中與待研究抗體接觸，并且鑒定免疫反應(yīng)肽使得可推出抗體表位的最小序列以及將其精確定位到抗原上。在統(tǒng)一地攜帶長度8-10個單位的聚乙二醇(PEG)臂的纖維素膜上進(jìn)行合成，所述的臂在鏈末端具有游離NH2官能團(tuán)。這從肽的C-末端到N-末端發(fā)生。氨基酸的氨基功能用Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團(tuán)保護(hù)，能在合成過程中反應(yīng)的所述氨基酸的側(cè)鏈也用三苯甲基，叔丁基或叔丁基酯基團(tuán)保護(hù)。氨基酸母液以濃度0.33M在含有0.5MHOBt(羥基苯并三唑)的NMP(N-甲基吡咯烷酮)中制備。氨基酸利用ASP222自動設(shè)備(Abimed,Langenfeld,Germany)沉淀，所述裝置用AutoSpotXL軟件控制。該自動化裝置使得可同時產(chǎn)生多達(dá)4張96點(diǎn)的膜，即384個肽。對于氨基酸偶聯(lián)循環(huán)，該自動化裝置將0.7μ1的無準(zhǔn)備活化的氨基酸溶液(一體積1.IM二異丙基碳二亞胺溶液稀釋于NMP中每3體積氨基酸母液)沉淀于膜上。重復(fù)該沉淀，并在DMF(N，N-二甲基甲酰胺)中洗膜。未反應(yīng)的ΝΗ2基團(tuán)隨后通過在10%醋酸酐DMF溶液中保溫10分鐘并重復(fù)進(jìn)行4-6次來乙?；瑥亩乐巩惓＝K止的或截短的肽的出現(xiàn)。在DMF中洗滌3次、2分鐘之后，通過在DMF中的20%哌啶溶液中保溫5分鐘來切割保護(hù)氨基酸的氨基功能的Fmoc基團(tuán)。在DMF中洗滌4次之后，利用DMF中的溴苯酚藍(lán)溶液染色所述的印跡，并隨后在甲醇中洗滌膜3次，在開放空氣中干燥以便用于下一個偶聯(lián)循環(huán)。加入每種新的氨基酸時重復(fù)該方案。最后的氨基酸偶聯(lián)時，將肽乙?；员闶沟每勺钄嗨杏坞xΝΗ2基團(tuán)，由此防止加入其他氨基酸。所有肽的側(cè)鏈隨后通過將膜在三氟乙酸/二氯甲烷/三異丁基硅烷(5:5:0.3)水浴中保溫1小時來去保護(hù)。隨后在二氯甲烷中洗滌膜4次，在DMF中洗滌3次，并在甲烷中洗滌3次，然后在開放空氣中干燥并保存在_20°C直到免疫揭示(immunorevealing)。為了利用單克隆抗體免疫揭示所述的印跡，首先在甲醇中洗滌膜，然后在TBS(50mMTris-HCl,pH8.0,140mMNaCl,3mMKCl)中洗滌，然后在室溫在飽和溶液(10X濃縮的基于酪蛋白的溶液(WesternBlockingreagent,Roche)，稀釋于TBS—0.05%Tween20(TBS-T)中并含有5%蔗糖)中保溫過夜。在TBS-T中洗滌10分鐘后，將膜在37°C與在飽和溶液中稀釋到20μg/ml大單克隆抗體保溫1小時30分鐘。該膜隨后在TBS-T中洗滌3次，隨后與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗小鼠偶聯(lián)物(JacksonImmunoresearch)(在飽和溶液中稀釋到l/2000th)保溫。在TBS-T中洗滌2次、每次10分鐘之后，在CBS(IOmM檸檬酸，pH7,140mMNaCl，3mMKCl)中洗滌2次，即時制備的顯示劑(600μM，5-溴-4-氯-3-吲哚基(indoyl)磷酸酯，720μΜ噻唑蘭(thiazolylbluetetrazoliumbromideO，和5mMMgCl2,CBS中)與所述膜黑暗下接觸30-45分鐘。免疫反應(yīng)性肽顯示為藍(lán)紫色。在蒸餾水中洗3次后，掃描所述膜并儲存在水中直到重生。重生使得可去除抗體以及偶聯(lián)于多肽的偶聯(lián)物，從而可進(jìn)一步檢測其他抗體的免疫反應(yīng)性。膜經(jīng)過一系列洗滌，每次10分鐘在蒸餾水中洗滌一次，DMF中洗滌6次，重生緩沖液A(8M尿素，35mMSDS(十二烷硫酸鈉)，0.1%β-巰基乙醇)中洗滌3次，重生緩沖液Β(蒸餾水/乙醇/醋酸451)中洗滌3次，隨后在甲醇中洗滌2次。所述的膜隨后在開放空氣中干燥，然后保存在-20°C。6.2.結(jié)果表6顯示通過Spotscan技術(shù)研究的8種抗體識別的表位。表6抗體表位號表位序列a(SEQIDNo.)4A7A6C11LSEQIQRALQLE(365-376)(SEQIDNo.l)4D9B92_LAAELAEYT(417-425)(SEQIDNo.2)_4G11B51LSEQIQRALQLE(365-376)(SEQIDNo.l)8B5G6G43QIQRALQLEEER(368-379)(SEQIDNo.3)DYEEKTKK(353-360)+QAKFGD(131-136)(SEQIDNo.4)+(SEQIDNo.5)5G2D122LAAELAEYT(417-425)(SEQIDNo.2)。0廣，LEADRMAAL(389-397)+LEEARRRKED(431-440)8A8G65(SEQIDNo.6)+(SEQIDNo.7)9D2A11_6LEADRMAALRAK(389-400)(SEQIDNo.8)_a受試抗體與埃茲蛋白結(jié)合區(qū)的氨基酸序列。括號內(nèi)的數(shù)字對應(yīng)埃茲蛋白氨基酸序列上的表位位置，編號從第一個甲硫氨酸開始。8種抗埃茲蛋白單克隆抗體識別該蛋白的6個表位，編號為1_6(表6)。4A7A6C1和4G11B5抗體具有相同的表位(表位n°1)。4D9B9H6和5G2D12抗體也有相同的表位(表位n°2)。8A8G6和9D2A11抗體具有部分重疊，但并非完全相同的表位。7.通過夾心ELISA檢測埃茲蛋白7.1.方法埃茲蛋白通過夾心免疫測定法利用例如VidasELISA自動化設(shè)備(bioM6rieuX)檢測。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieux，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用30μg/ml濃度的受試捕獲抗體(4A9H5，5G2D12，8A8G6)敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的受試揭示抗體(4A7A6C1and4G11B5)替換。3.通過將細(xì)胞碎片在PBS(50μ1)中超聲降解來制備的Caco2裂解物(含有天然形式的埃茲蛋白)在HBsAgUltracartridge的第二個孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動化設(shè)備和HBsAgUltra試劑盒的方案進(jìn)行ELISA反應(yīng)，其中將樣品與捕獲和揭示抗體保溫的步驟進(jìn)行100個循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。信號是RFV，相對熒光值。7.2.結(jié)果表7顯示1/50稀釋的Caco2裂解物上各種抗體組合的反應(yīng)性。結(jié)合表位No.1(4A7A6C1和4G11B5)的抗體產(chǎn)生相同的信號譜。可利用表位Nos1和4，或Nos1和2，或Nos1和5的組合檢測埃茲蛋白。如果對腫瘤標(biāo)記物沒有反應(yīng)性，觀察到的信號非常低，為2.5-3RFV的量級。表位Nos1和4的組合使得可獲得最高的信號。表T捕獲抗體檢測抗體(表位n°l)_4A7A6C1生物素4G11B5生物素4A9H5(表位n°4)6229.561665G2D12(表位n°2)52.546.58A8G6(表位n°5)241.5234陰性對照_3_2.5aVidas夾心免疫測定信號，以RFV(相對熒光單位)表示。實(shí)施例3腫瘤標(biāo)記物的血清測定1.患者和樣品根據(jù)2個Huriet-Iaw協(xié)議，血樣收集自分布于法國的8個臨床中心網(wǎng)。為了獲得血清，將該血樣置于干燥試管中。為了獲得血漿，將該血樣置于EDTA試管中。在凝固后，將試管以IOOOg離心10分鐘，取出血清，等份并在-80°c貯存。將血漿試管以IOOOg直接離心10分鐘，取出血漿，等份并在-80°c貯存。樣品完全記錄了病人的病史。2.LEI腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測定LEI蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieux，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用10μg/ml濃度的捕獲抗體10E1H1敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和1g/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體21B10A5替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(50μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個孔中直接稀釋，所述樣品是純的或者在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中1/20稀釋。4.使用Vidas自動化設(shè)備和HBsAgUltra試劑盒的方案進(jìn)行ELISA。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。通過測定重組蛋白質(zhì)形式的腫瘤標(biāo)記物的濃度范圍制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的該標(biāo)準(zhǔn)曲線的χ軸是報道的腫瘤標(biāo)記物濃度，y軸是由Vidas讀取的信號(RFV或者相對熒光數(shù)值)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過報道的相應(yīng)于Vidas讀取的RFV信號的濃度計算。分析患者獲得的量示于圖1。在該圖中，注意到IV期結(jié)腸直腸癌患者的3份血清及III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清示出其血清LEI的量明顯增加。3.埃茲蛋白腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用實(shí)施例2中詳細(xì)描述的抗體以及使用Vidas自動化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測定埃茲蛋白蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieux，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用30μg/ml濃度的捕獲抗體4A9H5敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和Ig/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體4A7A6C1替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(50μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA，其中樣品與捕獲抗體和揭示抗體的保溫步驟進(jìn)行100次循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過第2段關(guān)于測定LEI所述方法計算。通過ELISA在Vidas自動化設(shè)備對患者血清埃茲蛋白的測定結(jié)果示于表8。表8~S1血清樣品標(biāo)識符丨性質(zhì)丨階段ITNMbI埃茲蛋白ng/mlCRC+__CLSP047/F0血清IT1N0M09CRC+__CLSP076/F0血清IIT3N0M08.579CRC+__GHBD020/F0血清IIT3N0M021.362CRC+__GHBD023/F0血清IIT3NOMO7.955CRC+__GHBD025/F0血清IIT3NOMO5.985CRC+__GHBD029/F0血清IIT3N0M013.343CRC+__CBSE005/F0血漿IIIT3N1M020.248CRC+__CLSP050/F0血漿IIIT2N1M011.706CRC+__CLSP072/F0血清ΠΙT3N1MQ9.252CRC+__CLSP089/F0血清IIIT4N2M08.916rnCRC+CLSP090/F0血清IIITlNlMO18.460---——----CRC十__GHBDO19/F0血清IIIΤ3Ν1Μ07.810CRC+__CBSE008/F0血清IVΤ4Ν3Μ19.781CRC+__CBSE021/F0血清IVΤ4Ν2Μ118.846CRC+__CBSE026/F0血清IVΤ4Ν1Μ152.641CRC+__CLSP068/F0血清IVTxNxMl392.369CRC+__CLSP156/F0血清IVΤ4Ν0Μ112.188CRC+__CSEM005/F1血清IVΤ4Ν2Μ189.383CRC+__CLSP153/F0血清III/IVΤ3Ν2Μχ12.477CRC-__N017197/F0血裝____12.958CRC-__N017250/F0血清____8.435CRC-__N017349/F0血清____19.668CRC-__N018640/FQ血清____8.964CRC-__N030068/F0血清____11.802<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>aCRC+結(jié)腸直腸癌患者；CRC-健康個體b:M組織侵潤階段⑴、淋巴結(jié)侵潤(N)及遠(yuǎn)處侵潤(轉(zhuǎn)移，M)分析患者獲得的量示于圖2。在該圖中，注意到IV期結(jié)腸直腸癌患者的3份血清示出其血清埃茲蛋白的量明顯增加。4.酰化氨基酸水解酶1腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測定?；被崴饷?蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioMerieux,Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用20μg/ml濃度的捕獲抗體2A7F6敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體11H7D9替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(100μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA，其中樣品與捕獲抗體和揭示抗體的保溫步驟進(jìn)行100次循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過第2段關(guān)于測定LEI所述方法計算。分析患者獲得的量示于圖3。在該圖中，注意到II期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清、III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清酰化氨基酸水解酶1的量明顯增加。5.L-FABP腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用HycultBiotechnology公司銷售的ELISA試劑盒測定人L-FABP蛋白(Cat.No.HK404)。這個試劑盒可以量化細(xì)胞培養(yǎng)上清或者血清、血漿或尿液中的L-FABP蛋白，以確定肝臟損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序，有兩處修改保溫在37°C而不是在室溫進(jìn)行，在測定之前血清稀釋為1/10。L-FABP蛋白的測定可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的備選技術(shù)進(jìn)行。圖4示出這項分析的結(jié)果。在檢測的血清中，141個結(jié)腸直腸癌患者中的41個患者的血清L-FABP濃度高于17ng/ml，而在對照組中，無個體的血清L-FABP濃度超過這個數(shù)值。在這41個患者中，I期結(jié)腸直腸癌患者8個、II期結(jié)腸直腸癌患者8個、III期結(jié)腸直腸癌患者13個，IV期結(jié)腸直腸癌患者12個。觀測的141個結(jié)腸直腸癌患者的平均血清L-FABP濃度是16.6士1.3ng/ml。112個健康個體的平均值為6.6士0.2ng/ml(陰性對照)。這個差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(ρ<0.0001，單側(cè)t-檢驗(yàn)，使用Welch’s校正不等方差)。6.I-FABP腫瘤標(biāo)記物的而清測定使用HycultBiotechnology公司銷售的ELISA試劑盒，測定人I-FABP蛋白(Cat.No.HK406)。這個試劑盒可以量化細(xì)胞培養(yǎng)上清或者血清、血漿或尿液中的I-FABP蛋白，以確定小腸中缺血性損害的存在。我們遵循廠商推薦的程序。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的備選技術(shù)測定I-FABP蛋白。圖5示出這項測定的結(jié)果。在檢測的血清中，40個結(jié)腸直腸癌患者中有15個患者的血清I-FABP濃度高于40pg/ml，而在對照組中，24個個體中僅2個個體超過這個數(shù)值。更明顯地，I期結(jié)腸直腸癌患者的3份血清、III結(jié)腸直腸癌患者的2份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清的血清I-FABP濃度高于100pg/ml。在CRC-對照組中未發(fā)現(xiàn)高于此數(shù)值的濃度。7.載脂蛋白AI腫瘤標(biāo)記物的而清測定通過兩種不同的免疫測定技術(shù)測定血清載脂蛋白Al。首先，使用微滴定平板夾心ELISA0將96孔平板用Iyg/孔的抗-ApoAI單克隆抗體-克隆1404(BiodesignCat.No.H45404)包被。在用PBS-0.05%Tween20(PBS-T)洗滌3次后，將該平板用在PBS-T中10%奶粉在37°C飽和1小時。將該平板再于PBS-T中洗滌3次，將檢測血清樣品的100μ1標(biāo)準(zhǔn)范圍稀釋液或者100μ1的1/100000稀釋液沉積于平板上，將該平板在37°C保溫2小時。所述標(biāo)準(zhǔn)范圍是通過將ApoAI蛋白(BiodesignCat.No.A50620H)在PBS_T，BSA1%(1.6-100ng/ml)中稀釋而制備。在用PBS-T洗滌3次后，加入0.1μg/孔與辣根過氧化物酶結(jié)合的多克隆檢測抗體(BiodesignCat.No.K45452P)，將該平板在37°C保溫2小時。再次用PBS-T洗滌3次后，加入100μ1/孔的OptEIA底物(BD)。20分鐘后，當(dāng)發(fā)生生色時，用2Ν硫酸結(jié)束反應(yīng)，在450nm測量吸光度。圖6A示出這項測定的結(jié)果。我們證實(shí)結(jié)腸直腸癌患者中ApoAI的血清濃度降低。38個I期-IV期CRC患者中的平均濃度為675士36μg/ml，而在27個健康個體(對照組)中其平均值更高1040士39μg/ml。這個差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001，單側(cè)t-檢驗(yàn))。作為對比，使用夾心ELISA技術(shù)，在13個肝癌患者中ApoAI的平均血清濃度為1175士87μg/ml。血清濃度降低證實(shí)ApoAI因此是結(jié)腸直腸癌的特異性標(biāo)記物，可以通過免疫測定證實(shí)這種降低。使用的第二種測定技術(shù)是Linco公司銷售的多元測定法，其可以在同一樣品中同時測定一些載脂蛋白，包括AI和All(Cat.No.AP0-62K).。使用廠商推薦的程序進(jìn)行。圖6B示出這項測定的結(jié)果。使用該第二種技術(shù)證實(shí)CRC患者中ApoAI血清濃度降低。34個I期-IV期CRC患者中ApoAI平均濃度為768士30μg/ml，而在17個健康個體(對照組)中其平均值更高1194士51μg/ml。這個差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001,單側(cè)t-檢驗(yàn))。8.載脂蛋白AII腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用Linco多元試劑盒測定血清載脂蛋白All。圖7示出這項測定的結(jié)果。我們證實(shí)結(jié)腸直腸癌患者中ApoAII的血清濃度降低。34個I期-IV期CRC患者中ApoAII平均濃度為170士11μg/ml，而在17個健康個體(對照組)中其平均值更高277士16μg/ml。這個差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001,單側(cè)t-檢驗(yàn))。9.I-絲束蛋白腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用實(shí)施例2中描述的抗體以及使用Vidas自動化設(shè)備(bioM6rieUX)進(jìn)行ELISA以測定I-絲束蛋白蛋白。為此，使用VidasHBsAgUltra試劑盒(bioM6rieuX，Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA。該試劑如相應(yīng)的信息頁(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用15μg/ml濃度的捕獲抗體3D11D10敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個孔的內(nèi)容物用300μ1在VidasHBsAgUltra試劑盒的第二個孔的緩沖液(具有山羊血清和lg/Ι疊氮化鈉的緩沖液)中稀釋為1μg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體8C8C5替換。3.將血清、血漿或者糞便樣品(100μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過第2段關(guān)于測定LEI所述方法計算。分析患者獲得的量示于圖8。在該圖中，注意到檢測的結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清I-絲束蛋白的量明顯增加。10.B組腫瘤標(biāo)記物的血清測定使用本申請人的Vidasβ2-微球蛋白、VidasCEA、VidasCA19-9和Vidas睪酮測定試劑盒根據(jù)每個試劑盒的程序分別測定β2-微球蛋白、CEA、CA19-9和罩酮腫瘤標(biāo)記物。使用E-鈣粘蛋白EIA試劑盒(TakaraBiochemicals,Tokyo,Japan)根據(jù)該試劑盒程序測定E-鈣粘蛋白。使用PANCREPAPELISA試劑盒(DynaBio，Marseille,France)根據(jù)該試劑盒程序測定再生胰島衍生蛋白3α蛋白，其也被稱作胰腺炎相關(guān)蛋白(PAP1)。使用實(shí)施例2中描述的抗體測定半乳凝素_3和LDH蛋白。使用專利EP0434670中描述的抗體測定蛋白酶體20S。為此，使用Vidas自動化設(shè)備(bioM6rieUX)和VidasHBsAgUltra試劑盒(bioMerieux,Cat.No.30315)的試劑進(jìn)行ELISA測定。該試劑如相應(yīng)的信息頁(ref.11728D-FR-2005/05)所述使用，具有如下修改1.離心管用5-30μg/ml濃度的捕獲抗體敏化。2.HBsAgUltracartridge第二個孔的內(nèi)容物用300μ1在具有山羊血清和lg/1疊氮化鈉的緩沖液中稀釋為ιμg/ml的與生物素結(jié)合的揭示抗體替換。3.如果需要，在第二個孔的緩沖液中稀釋之后，將血清、血漿或者糞便樣品(100μ1)在HBsAgUltracartridge的第二個孔中直接稀釋。4.使用Vidas自動化設(shè)備和HBsAgUltra方案進(jìn)行ELISA。樣品與捕獲抗體和揭示抗體保溫的步驟進(jìn)行14-100次循環(huán)。5.在減去背景噪音之后獲得粗略值(crudevalue)形式的結(jié)果(在反應(yīng)之前讀取底物)。檢測的體液(血液、血清、血漿、糞便)中存在的腫瘤標(biāo)記物的濃度通過第2段關(guān)于測定LEI所述方法計算。各個腫瘤標(biāo)記物的測定條件示于表7。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>分析患者獲得的β2-微球蛋白、CEA、CA19-9、睪酮、E-鈣粘蛋白、再生胰島衍生蛋白3α、半乳凝素-3、LDH和蛋白酶體20S腫瘤標(biāo)記物的量分別示于圖9-17。結(jié)腸直腸癌患者的3份血清示出血清β2-微球蛋白的量增加。結(jié)腸直腸癌患者的10份血清示出血清CEA的量增加。更明顯地，III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的7份血清示出血清CEA的量明顯增加。結(jié)腸直腸癌患者的9份血清示出其血清CA19-9的量增加。更明顯地，III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的7份血清示出血清CA19-9的量明顯增加。結(jié)腸直腸癌患者的10份血清示出血清睪酮的量降低。更明顯地，II期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清和III期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清以及IV期結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清睪酮的量降低。結(jié)腸直腸癌患者的2份血清示出血清再生胰島衍生蛋白3α的量增加。IV期結(jié)腸直腸癌患者的4份血清、III期結(jié)腸直腸癌患者的2份血清以及II期結(jié)腸直腸癌患者的1份血清示出血清半乳凝素_3的量明顯增加。實(shí)施例4組合腫瘤標(biāo)記物的血清測定的應(yīng)用本申請人在實(shí)施例3中揭示了在某些結(jié)腸直腸癌患者血流中可以觀測到腫瘤標(biāo)記物的量異常升高或者異常降低。令人驚奇地，在同一患者中未系統(tǒng)地觀測兩個指定標(biāo)記物在血液中的量的增加或降低。結(jié)果，組合一些腫瘤標(biāo)記物可以增加經(jīng)鑒別患有結(jié)腸直腸癌的患者數(shù)目。因此，A患者也許存在一或多種腫瘤標(biāo)記物(X組)升高或降低，X組的所述標(biāo)記物在B患者中也許正常；在這個B患者中，一或多種其它腫瘤標(biāo)記物(Y組)也許升高或降低，Y組的所述標(biāo)記物在A患者中也許正常。本申請人測定的各個腫瘤標(biāo)記物因此可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種數(shù)學(xué)算法組合。例如非限制性地進(jìn)行如下方法1.設(shè)定每個腫瘤標(biāo)記物的閾值。2.當(dāng)結(jié)腸直腸癌患者血液中腫瘤標(biāo)記物的量增加時，將針對指定患者獲得的血液中的量除以其閾值。當(dāng)結(jié)腸直腸癌患者血液中腫瘤標(biāo)記物的量降低時，將針對指定患者獲得的血液中的量變成倒數(shù)并乘以其閾值。3.當(dāng)“血液中的量除以閾值”高于1時，將該比率乘以系數(shù)，例如10。由此獲得的數(shù)值稱作所研究的患者、考慮的腫瘤標(biāo)記物的“得分”。4.累加各個腫瘤標(biāo)記物的得分，將其用特異于每個標(biāo)記物的因子進(jìn)行加權(quán)。在下文實(shí)施例中，所有加權(quán)因子均設(shè)定為1。5.將得分總和除以累加得分總數(shù)，由此獲得的數(shù)值稱作“總得分”。6.當(dāng)其總得分高于閾值時，診斷該患者患有結(jié)腸直腸癌。包含埃茲蛋白的選擇的2、4和8個標(biāo)記物的總得分在表10中示出。埃茲蛋白與?；被崴饷?1腫瘤標(biāo)記物的組合因此對于同一組的22個患者可以獲得9個結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“2”，而單獨(dú)測定埃茲蛋白與?；被崴饷?1分別僅示出4個或7個患者的量增加。埃茲蛋白、β2-微球蛋白、?；被崴饷?與CEA腫瘤標(biāo)記物的組合因此對于同一組19個患者可以獲得15個結(jié)腸直腸癌患者增加的總得分“4”，而單獨(dú)測定埃茲蛋白、β2-微球蛋白、?；被崴饷?與CEA分別僅示出3、4、3和9個患者的量增加。埃茲蛋白、β2-微球蛋白、?；被崴饷?、蛋白酶體20S、L-FABP、PAP、E_鈣粘蛋白和CEA腫瘤標(biāo)記物的組合因此對于同一組19個患者可以獲得17個患者增加的總得分“8”，而單獨(dú)測定埃茲蛋白、β2-微球蛋白、?；被崴饷?、蛋白酶體20S、L-FABP、PAP、E-鈣粘蛋白和CEA分別僅示出3、4、3、6、5、3、1和9個患者的量增加。表10病變樣品標(biāo)識符階段TNMACY總得分總^分總得分_____ng/ml2a__^__8C<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>a埃茲蛋白和酰化氨基酸水解酶1的組合b埃茲蛋白、β2-微球蛋白、?；被崴饷?與CEA的組合c埃茲蛋白、β2-微球蛋白、?；被崴饷?、蛋白酶體20S、L-FABP,ΡΑΡ、E-鈣粘蛋白和CEA的組合實(shí)施例5糞便腫瘤標(biāo)記物測定提取重約Ig的糞便，加入含有l(wèi)g/L疊氮化物的IOml的IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)。將該混合物旋動均質(zhì)1分鐘。然后將樣品在冰上進(jìn)行4次7秒超聲處理。通過以2000g在4°C離心10分鐘除去不溶的級分。將上清在_30°C貯存直至進(jìn)行測定。如果需要，在HBsAgUltracartridge的第一個孔的緩沖液中適當(dāng)稀釋糞便之后，使用實(shí)施例3所述的ELISA在糞便中查找腫瘤標(biāo)記物。使用該檢驗(yàn)測定?；被崴饷?、半乳凝素_3和蛋白酶體20S的結(jié)果分別示于圖18-20。在結(jié)腸直腸癌患者的10、14和8份糞便中分別觀測到?；被崴饷?、半乳凝素_3和蛋白酶體20S的量增加。實(shí)施例6通過ELISP0T技術(shù)檢測腫瘤標(biāo)記物1.細(xì)胞培養(yǎng)將LnCAP前列腺癌細(xì)胞系在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基中補(bǔ)加了2mML-谷氨酰胺、IOmMHEPESUmM丙酮酸鈉和10%FCS(均來自Gibco)。該細(xì)胞用作陰性對照。將Caco-2結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在含有2mML-谷氨酰胺而無FCS(均來自Gibco)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將HT-29結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在含有2mML-谷氨酰胺和10%FCS(均來自Gibco)的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將HT-29/B6結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系在含有4mML-谷氨酰胺而無FCS(均來自Gibco)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞維持在37°C的具有5%CO2保溫儀中。2.ELISP0T技術(shù)這種方法可以確定分泌蛋白質(zhì)的細(xì)胞數(shù)目。將帶有PVDF膜(MultiscreenIP,Millipore)的96-孔ELISP0T平板用在無菌PBS中的10μg/ml小鼠抗腫瘤標(biāo)記物單克隆抗體(捕獲抗體，見下表11，該表示出了用于ELISP0T中的抗體)在+4°C包被過夜，100μ1/孔。然后將該平板用PBS洗滌，并用含有10%FCS的培養(yǎng)基飽和。平行地，對細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化、計數(shù)，然后稀釋為IO5個細(xì)胞/ml。每個孔分配200μ1這種細(xì)胞懸浮液，這一原液的連續(xù)稀釋液也是如此。然后將該平板在37°C在5%CO2濕潤環(huán)境中保溫20小時，隨后用含有0.05%Tween-20的PBS洗滌。剩余的細(xì)胞通過用冰水處理10分鐘裂解，再次洗滌平板。然后加入0.1μg/孔揭示抗體-即待測腫瘤標(biāo)記物的生物素?；膯慰寺】贵w(表11)(在室溫保溫2小時)。通過加入Extravidin-堿性磷酸酶(Sigma)和底物5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍(lán)四唑(BCIP/NBT，Biorad)揭示斑點(diǎn)。背景噪音相應(yīng)于在LnCap孔中測量的斑點(diǎn)數(shù)目，在所用讀取條件下在0-8之間變化。從特異性信號中減去非特異性斑點(diǎn)的平均數(shù)。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>埃茲蛋白4Α9Η54A7A6C1半乳凝素-3_12F8A12_14A5G1_3.結(jié)果每一百萬個保溫的細(xì)胞中分泌腫瘤標(biāo)記物的Cac0-2、HT-29和HT-29/B6細(xì)胞的數(shù)目示于圖21。ELISP0T技術(shù)可以證實(shí)所述腫瘤標(biāo)記物由結(jié)腸癌細(xì)胞系釋放或分泌?？梢允褂眠@個技術(shù)查找患者體內(nèi)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)本申請人申請的專利申請WO03/076942所述方法進(jìn)行。棚列7側(cè)醒腳趟龍·敍體刪■示適1.方法學(xué)首先，對組織微陣列載玻片脫石蠟。為此，將其在如下浴中相繼保溫10分鐘甲基環(huán)己烷(兩次)、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇和水。然后將該玻片用含有0.1%Tween20的TBS(TBS-T)攪拌漂洗10分鐘?？乖贗OmM檸檬酸鹽緩沖液pH6中通過加熱至90°C40分鐘、然后冷卻至室溫30分鐘再活化。內(nèi)源性過氧化物酶通過在含有3%H2O2的TBS-T中保溫5分鐘而被抑制。然后將該玻片用在TBS-T中3%BSA在37°C在濕化箱中飽和1小時。隨后將該玻片與在含有3%BSA的TBS-T中稀釋為10μg/ml的如下一級抗體一起保溫2小時(在37°C在濕化箱中保溫)抗-白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑(克隆3D9C2)或者抗-I-絲束蛋白(克隆8D6A3)。在進(jìn)行3次在TBS-T中洗滌10分鐘后，將該玻片與在飽和溶液中稀釋為1/400的辣根過氧化物酶結(jié)合的抗小鼠二級抗體(Cat.No.115-035-003JacksonImmunoresearch)一起在37°C在濕化箱中保溫2小時。對該玻片進(jìn)行3次在TBS-T中洗滌10分鐘，然后進(jìn)行3次在PBS中洗滌10分鐘。使用SigmaFast底物(Cat.No.D-4168，Sigma-Aldrich)使玻片顯色5分鐘。通過在PBS中洗滌終止染色。使用Harris蘇木精(Cat.No.MHS16，Sigma-Aldrich)復(fù)染30秒。在用水和用PBS洗滌后，將玻片置于顯微鏡下觀察。根據(jù)這項應(yīng)用特異性選擇用于免疫組織化學(xué)標(biāo)記的抗體，不依賴于其在ELISA或者在Western印跡中的反應(yīng)性。2.白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑的免疫組織化學(xué)檢測組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)于玻片上的結(jié)腸組織?；颊叩奶匦?結(jié)腸直腸癌組織微陣列上存在的結(jié)腸組織斑點(diǎn)的特性)以及用抗-白細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果示于表12。表12組織和遺傳學(xué)鑒定在上皮細(xì)胞中標(biāo)記在基質(zhì)中標(biāo)記惡性腫瘤保守的腺癌ralil惡性腫瘤保守的腺癌陽性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性良性腫瘤腺瘤陰性陰性惡性腫瘤保守的腺癌陽性陰性惡性腫瘤LOH腺癌陽性’陰性惡性腫瘤LOH腺癌陽性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性惡性腫瘤LOH腺癌陰性陰性惡性腫瘤LOH腺癌陽性陰性惡性腫瘤高M(jìn)SI-腺癌陽性陰性惡性腫瘤高M(jìn)SI-腺癌陽性陰性惡性腫瘤膠質(zhì)腺癌陰性陰性惡性腫瘤膠質(zhì)腺癌陰性陰性正常正常粘膜陰性陰性正常_正常粘膜_m._mn_該表中結(jié)果證實(shí)在健康結(jié)腸粘膜活檢組織中，無標(biāo)記(10個陰性結(jié)果)。該標(biāo)記在腺瘤中也是陰性的(1/1)。該標(biāo)記在結(jié)腸腺癌的上皮細(xì)胞中是陽性的(8/11患者陽性)。在基質(zhì)中無標(biāo)記。3.埃茲蛋白的免疫組織化學(xué)檢測組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)滴于玻片上的結(jié)腸組織。對于每個結(jié)腸腺癌患者，在腫瘤中心取3份樣品，在侵潤前沿取3份樣品以及在健康組織取3份樣品。表13示出了用抗-埃茲蛋白抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果；示出的標(biāo)記水平是在分析的3份樣品的最大強(qiáng)度。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>在30個患者中，25個患者呈現(xiàn)出與相鄰健康組織相比在腫瘤(腫瘤中心或侵潤前沿)中埃茲蛋白過表達(dá)。4.?；被崴饷?的免疫組織化學(xué)檢測組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)滴于玻片上的結(jié)腸組織。對于每個結(jié)腸腺癌患者，在腫瘤中心取3份樣品，在侵潤前沿取3份樣品以及在健康組織取3份樣品。表14示出了用抗-?；被崴饷缚贵w免疫標(biāo)記的結(jié)果；示出的標(biāo)記水平是在分析的3份樣品的最大強(qiáng)度。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>在30個患者的樣品中，21個患者呈現(xiàn)出與相鄰健康組織相比在腫瘤(腫瘤中心或者侵潤前沿)中?；被崴饷高^表達(dá)。5.I-絲束蛋白的免疫組織化學(xué)檢測組織微陣列載玻片用于篩選大量樣品。這些樣品是點(diǎn)于玻片上的結(jié)腸和直腸組織?；颊叩奶匦?結(jié)腸直腸癌組織微陣列上存在的結(jié)腸組織斑點(diǎn)的特性)以及用抗-ι-絲束蛋白抗體免疫標(biāo)記的結(jié)果示于表15。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表中結(jié)果證實(shí)-在健康結(jié)腸粘膜活檢組織中，該標(biāo)記在8個樣品中較弱(+)，在2個樣品中是++。該標(biāo)記在結(jié)腸腺瘤樣品(1/1)中也較弱(+)。該標(biāo)記在結(jié)腸腺癌上皮細(xì)胞中是強(qiáng)陽性++(6/9患者++，3個患者較弱+，包括結(jié)腸粘液性腺癌)。在基質(zhì)中無標(biāo)記；_在健康直腸粘膜活檢組織中，該標(biāo)記以非特異性方式存在于表面上皮(3/4)，在1個樣品中是++水平。該標(biāo)記在直腸腺瘤中是強(qiáng)陽性++(5/9)或者謹(jǐn)慎+(4/9)。該標(biāo)記在直腸腺癌的上皮細(xì)胞中也是強(qiáng)陽性++(3/4患者是++，1個患者較弱+)。在基質(zhì)中無標(biāo)記。參考文獻(xiàn)1.J.D.Potter,JNatlCancerInst.，91，916-322J.Faivre,2001,Epidemiologieetdepistageducancercolorectal[Colorectalcancerepidemiologyandscreening],publisherSpringer3:M.Algrainetal.，1993，J.Cell.Biol.，120，129—1394:ff.G.JiangandS.Hiscox,1996，AnticancerRes.，16，861—8655:S.HiscoxandW.G.Jiang,1999,J.CellSci.，112，3081-30906:T.Xiaoetal，2005，Mol.Cell.Proteomics，4，1480-14867:E.RemoId-O，Donnelletal.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,563-56398:J.Cooleyetal.，2001，Biochemistry,15762—157709:M.AndersandW.Dekant,1994,AdvancesinPharmacology,431-44810:K.Lorentzetal.，1975，ClinicaChimicaActa,263-26911:K.LorentzandB.Flatter,1975,ClinicaChimicaActa,271-27412:R.M.Cooketal.，1993，J.Bio.Chem,17010-1701713:Y.E.Milleretal.,1989,J.Clin.Invest.,2120-212414:S.Balabanovetal.，2001，Eur.J.Biochem,5977—598015:E.Chanetal.，1985，JBiolChem，260，2629—263216:R.Dasetal.,2001,Clin.CancerRes.，7，1706-171517J.Stuliketal.，2001，Electrophoresis,22,3019-302518:T.Yamazakietal.，1999，JSurgOncol,72，83—8719:D.A.Sweetseretal.，1987，JBiolChem,266，16060-1607120:M.Pelsersetal.，2003，ClinBiochem，36，529-53521:R.Xiao,etal.，2005，MolecularCancer,4，1-1722:E.E.Niederkofleretal.，2003，J.LipidRes.，44，630-63923:G.L.Hortin,2006,ClinicalChemistry,52(7),1223-123724:J.Y.Engwegenetal.，2006，WorldJGastroenterol,12(10)，1536—154425:Z.Zhangetal.，2004，CancerResearch,64，5882-589026:H.Hachemetal.，1986，J.Chem.Clin.Biochem.，24，161-16627:C.S.Lin,etal.，1993，J.Biol.Chem.，268，2781—9228:V.Delanoteetal.,2005,ActaPharama.Sinica,769-77929:A.P.Arrigoetal.，1988，Nature，331，192-19430=TLavabre-Bertrandetal.，2001，Cancer，92，2493-250031:S.Nakaharaetal.，2005，Apoptosis，10，267-27532:I.Iuriscietal.,2000,Clin.Can.Res.,6,1389-139333:M.K.Scwartz,2006,Clin.Chim.Acta,1992，77—8234:D.J.McCooletal.，1999，Biochem.J.，593-60035:J.L.Iovannaetal.,1994,Gastroenterology,106,728-73436:Y.Motooetal.,1999,Dig.Dis.Sci.,44,1142-114737:Μ.Herlynetal.，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76，1438-144238:A.ArmstrongandS.Eck,2003，CancerBiol.Ther.，2，320-32539:D.Herlynetal.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79，4761-476540:HAbeetal.，2002，J.Immunol.Methods.，270，227-23341:V.Baraketal.，2004，Clin.Biochem.，37，529—54042:H.Kimetal.，2006，Ann.Clin.Lab.Sci.，36，294-29843:F.Rocaetal.，2006，J.Surg.Oncol.，151-16044:C.H.Damskyetal.，1983，Cell，455-46645:M.Katayamaetal.，1994，Br.J.Cancer,580-58546:C.Willmannsetal.,2004,Clin.Exp.Metastasis,75-7847:P.GoldandS.Freedman,1965，J.Exp.Med.，467-48148:M.Duffy,2001,Clin.Chem.，624-63049:Y.Kimetal.，2003，An.Clin.Lab.Sci.，32-3850J.L.Magnanietal.,1983,CancerResearch，43，5489-549251J.Holmgrenetal.，1984，Br.Med.J.(Clin.Re.Ed.)，288，1479—148252:T.L.Klugetal.，1986，Int.J.Cancer,38，6661—66953:P.Kuuselaetal.，1991，Br.J.Cancer,63，636—64054:M.Hollandetal.,1993；Medicina(B.Aires),53(2):117_2355:F.Modeletal.,July2006,WorldCongressonGastrointestinalCancer,((DetectionofMethylatedDNAinPlasmafromColorectalCancerPatientsandControlsbyReal-TimePCRAnalysisofSeptin9》56:M.P.Ebertetal.，2006，Gastroentrology,131(5)，1418-143057:C.Biancoetal.，2006，Clin.CancerRes.，12，5158-516458:R.Yasumatsuetal.,2006,AmJPhysiolLungCellMolPhysiol291，L619-L62759:J.Chevalieretal.,1997,JHistochemCytochem,45,481-49160:S.Patterson,2000,Massspectrometryandproteomics.PhysiologicalGen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