本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種一組甲基化基因及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
肺癌作為一種常見的惡性腫瘤，近幾十年內(nèi)其發(fā)病、死亡率于全球總體上呈上升趨勢(shì)，在惡性腫瘤中往往處于首位。許多研究都表明，肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多因素及多階段的復(fù)雜過程，其大致涉及兩大機(jī)制，一是表觀遺傳學(xué)層面，二是遺傳學(xué)層面。其中表觀遺傳學(xué)在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用，而DNA甲基化則是表觀遺傳學(xué)最重要的一種修飾方式。
DNA甲基化是真核生物體內(nèi)的一種內(nèi)源性修飾過程，一般是指由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化，生物體把S-腺苷甲硫氨酸(SAM-CH3)中的甲基(-CH3)連接到胞嘧啶核苷酸(Cytosine，C)的第5位殘基上，從而使胞嘧啶(C)甲基化為5'-甲基胞嘧啶(5'-Methylcytosine，5'-mC)的過程。胞嘧啶核苷酸(C)能與鳥嘌呤核苷酸(G)通過磷酸二酯鍵共價(jià)結(jié)合為二核苷酸(即CpG)。正常健康人基因組中約80％左右的CpG都分散分布在基因組內(nèi)，且都處于甲基化狀態(tài)，比如重復(fù)序列。另有一小部分CpG則呈高度密集狀態(tài)，通常當(dāng)胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)的總和超過4種堿基總和的50％左右時(shí)，我們把這種富含CpG結(jié)構(gòu)的DNA片段稱為CpG島。通常CpG島位于5'端的基因啟動(dòng)子、第一外顯子以及3'末端區(qū)域，且一般處于非甲基化狀態(tài)。
腫瘤DNA異常甲基化一般有兩種形式，即局部相關(guān)基因CpG島的甲基化水平升高以及CpG島以外的整體基因組DNA的甲基化水平降低。整體基因組DNA的低甲基化水平可能激活原來保持沉默的基因，尤其是ras及fos等原癌基因；而局部相關(guān)基因啟動(dòng)子CpG島的異常高甲基化則可能導(dǎo)致某些基因(尤其是抑癌基因)的轉(zhuǎn)錄沉默。而近來一系列研究也已經(jīng)證實(shí)，腫瘤發(fā)生發(fā)展中某些抑癌基因5'端CpG島(尤其是啟動(dòng)子區(qū)域)會(huì)發(fā)生異常甲基化，從而使該基因轉(zhuǎn)錄受到抑制，這是抑癌基因表達(dá)失活的關(guān)鍵。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，許多基因的異常甲基化都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而目前的研究主要集中在4類基因，即抑癌基因(包括p16INK4a、p15INK4b、p14ARF、APC等)、DNA修復(fù)基因(MLH1與MGMT等)、代謝酶基因(GSTP1)與腫瘤分子侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(DAPK、CDH1等)。這些基因涉及細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及DNA損傷修復(fù)等過程。
目前針對(duì)肺癌的早期診斷依舊相當(dāng)困難，其早期診斷率低。影像學(xué)檢查(如常規(guī)CT檢查)很難檢出1cm以下的腫塊；而傳統(tǒng)的支氣管刷檢法及痰脫落細(xì)胞學(xué)法的檢測(cè)結(jié)果也差強(qiáng)人意；作為肺癌臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)的病理組織學(xué)診斷，一般都需獲取組織活檢標(biāo)本，有創(chuàng)，傷害大，對(duì)于那些不能耐受手術(shù)檢查或者不具備相應(yīng)檢查條件的患者往往并不適用，且通過病理檢測(cè)得到的結(jié)果早已失去了早期診斷的意義；腫瘤標(biāo)志物(尤其是血漿或血清中的分子標(biāo)志物)的檢測(cè)來進(jìn)行肺癌的早期篩查，具有特異性強(qiáng)、敏感度高、標(biāo)本易獲取以及無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，且便于觀察預(yù)后。近些年，有關(guān)肺癌腫瘤標(biāo)志物研究以及檢測(cè)方法層出不窮，如“液體活檢”技術(shù)。此技術(shù)就是一種直接從血漿或其他體液中檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞或游離DNA(cfDNA)的技術(shù)，有望把肺癌的早期診斷推向一個(gè)新的高度。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種一組甲基化基因及其檢測(cè)方法，旨在解決目前針對(duì)肺癌的早期診斷依舊相當(dāng)困難，其早期診斷率低，影像學(xué)方法(如常規(guī)CT檢查)很難發(fā)現(xiàn)1cm以下的腫塊；而傳統(tǒng)的支氣管刷檢法及痰脫落細(xì)胞學(xué)法的檢測(cè)結(jié)果也差強(qiáng)人意；作為肺癌臨床診斷金標(biāo)準(zhǔn)的病理組織學(xué)診斷，一般都需獲取組織活檢標(biāo)本，有創(chuàng)，傷害大，對(duì)于那些不能耐受手術(shù)檢查或者不具備相應(yīng)檢查條件的患者往往并不適用，且通過病理檢測(cè)得到的結(jié)果早已失去了早期診斷的意義的問題。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一組甲基化基因，所述一組甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分別為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。
本發(fā)明另一目的在于提供一種一組甲基化基因的檢測(cè)方法，所述一組甲基化基因的檢測(cè)方法包括以下步驟：
1)抽取受檢者外周血20ml，并將其血漿分離；提取上述血漿中的cfDNA,并對(duì)其進(jìn)行亞硫酸鹽修飾；
2)分別設(shè)計(jì)p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，對(duì)上述亞硫酸鹽修飾過的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因進(jìn)行巢氏甲基化特異性PCR兩輪擴(kuò)增；
3)將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，并行測(cè)序驗(yàn)證；
4)對(duì)上述觀察結(jié)果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情況進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估。
進(jìn)一步，所述一組甲基化基因的檢測(cè)方法具體包括：
步驟一，血漿樣本的分離及保存：抽取受檢者外周血20ml，并立即置于4℃冰箱短時(shí)間保存1h，備用；把分別裝有10ml左右外周血樣本的兩只抗凝管置于低速離心機(jī)，然后2500rpm，4℃離心，15min，使樣品分血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞三層；用移液槍小心輕柔的吸出抗凝管中最上層2/3的血漿，置于新的15ml離心管中；然后把取出的血漿再次2500rpm，4℃離心，10min；并把上清液分裝到幾管1.5ml離心管中，標(biāo)記好后置于-80℃保存；
步驟二，血漿cfDNA的提取及其濃度測(cè)定；
步驟三：cfDNA的瓊脂糖凝膠電泳：制備1％的瓊脂糖凝膠；并且等瓊脂糖溶液溫度降至65℃時(shí)加入花青素；制備膠板；將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠溶液倒入制膠槽內(nèi)，室溫下靜置，直至完全凝固；將凝固后的膠板放入已倒入1×TAE緩沖液的電泳槽中浸潤，然后開始點(diǎn)樣；取4μl血漿cfDNA與2μl的6×loading Dye混合，然后依據(jù)樣品順序逐孔點(diǎn)樣；在100V電壓下電泳20分鐘，然后取出凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果；
步驟四，血漿cfDNA的亞硫酸氫鹽修飾；
步驟五，血漿cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特異性PCR擴(kuò)增；
步驟六：PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
步驟七：判斷標(biāo)準(zhǔn):把只有單獨(dú)的甲基化M引物擴(kuò)增成功或者是甲基化M引物及非甲基化U引物都擴(kuò)增成功判斷為此基因有陽性異常甲基化，而把只有單獨(dú)的非甲基化引物U擴(kuò)增成功判斷為此基因陰性無異常甲基化；M代表甲基化，U代表非甲基化；
步驟八：PCR結(jié)果的驗(yàn)證，包括：
(1)PCR產(chǎn)物的選?。喝〕鰌16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血漿cfDNA中的nMSP第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
首先在這5個(gè)基因的所有M擴(kuò)增成功的陽性樣本里分別隨機(jī)選取幾個(gè)p16陽性樣本、幾個(gè)DLEC1陽性樣本、幾個(gè)CDH1陽性樣本、幾個(gè)DAPK陽性樣本及幾個(gè)RUNX3陽性樣本，并挑出這些被選取的陽性樣本的甲基化引物M擴(kuò)增產(chǎn)物，用以驗(yàn)證其是否為真的陽性；
其次在這5個(gè)基因的所有只有U擴(kuò)增成功的陰性樣本里分別隨機(jī)選取幾個(gè)p16陰性樣本、幾個(gè)DLEC1陰性樣本、幾個(gè)CDH1陰性樣本、幾個(gè)DAPK陰性樣本及幾個(gè)RUNX3陰性樣本，并挑出這些被選取的陰性樣本的非甲基化引物U擴(kuò)增產(chǎn)物，用以驗(yàn)證其是否為真的陰性；
(2)PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化；
(3)陽性克隆子的篩選；
(4)測(cè)序:挑取陽性克隆子對(duì)應(yīng)編號(hào)平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液體培養(yǎng)基中，再置于搖床上，200rpm，37℃，過夜，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；作甲基化測(cè)序；
(5)驗(yàn)證：運(yùn)用Bio analysis軟件，結(jié)合NCBI上下載的參考序列，與目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各幾個(gè)被選取的陽性樣本中甲基化引物M擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性克隆子測(cè)序結(jié)果作比對(duì)，觀察目的片段上CpG島異常甲基化情況，驗(yàn)證其是否為對(duì)應(yīng)甲基化引物M的正確擴(kuò)增產(chǎn)物，是否為假陽性；同時(shí)，與目的基因p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3各幾個(gè)被選取的陰性樣本中非甲基化引物U擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性克隆子測(cè)序結(jié)果作比對(duì)，對(duì)比目的片段上CpG島甲基化情況驗(yàn)證其是否為對(duì)應(yīng)非甲基化引物U的正確擴(kuò)增產(chǎn)物，是否為假陰性；
步驟九，數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)處理：結(jié)合臨床資料及健康對(duì)照血漿樣本，運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，主要運(yùn)用卡方檢驗(yàn)，P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步，步驟五中，巢式甲基化特異性PCR擴(kuò)增包括：將步驟四經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾過的cfDNA模板進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增；nMSP分為兩輪擴(kuò)增，且兩輪PCR都使用相同的聚合酶Takara Epi Taq HS，都在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行；但第一輪PCR的模板為上一步經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾過的血漿cfDNA，而第二輪PCR的模板為第一輪PCR后未稀釋的產(chǎn)物；
50μl的PCR反應(yīng)體系為：在PCR管中分別加入Takara Epi Taq HS 0.25μl，10×Epi Taq PCR Buffer(Mg2+free)5μl，MgCl25μl，dNTP Mixture 6μl，cfDNA Template 2μl及ddH2O 28μl，正向F與反向R引物各2μl；
p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因nMSP兩輪PCR的條件：
p16第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存；
p16第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共29個(gè)循環(huán)，最后4℃保存；
DLEC1第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存；
DLEC1第二輪PCR反應(yīng)條件為為98℃變性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共32個(gè)循環(huán)，最后4℃保存；
CDH1第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存；
CDH1第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共34個(gè)循環(huán)，最后4℃保存；
DAPK第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存；
DAPK第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后4℃保存；
RUNX3第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，44℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存；
RUNX3第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后4℃保存；
同時(shí)，設(shè)置去離子水為空白對(duì)照，EpiTect Control DNA為陽性對(duì)照，正常外周血白細(xì)胞DNA為陰性對(duì)照。
進(jìn)一步，步驟六中，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳包括：
制備2％的瓊脂糖凝膠，并且等瓊脂糖溶液溫度降至65℃，加入花青素；
制備膠板:把制膠槽插于制膠板上，作為模子；將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠溶液小心倒入槽內(nèi)，室溫下靜置，直至完全凝固；
點(diǎn)樣:將凝固后的膠板放入已倒入1×TAE緩沖液的電泳槽中浸潤，然后開始點(diǎn)樣；取4μl的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因第二輪PCR產(chǎn)物樣品與2μl的6×loading Dye混合，然后依據(jù)樣品順序逐孔點(diǎn)樣；
電泳:在100V電壓下電泳20分鐘，然后取出凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。
本發(fā)明可以在腫瘤發(fā)生的早期就能在血漿cfDNA中檢測(cè)出腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化，且cfDNA中的異常甲基化總是與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的異常甲基化同時(shí)出現(xiàn)；同時(shí)，血漿cfDNA中基因異常甲基化的檢測(cè)具有較高的敏感性和特異性。因此，血漿cfDNA作為“液體活檢”中非常關(guān)鍵的檢測(cè)物，具有“液體活檢”無創(chuàng)，操作簡單，易于取樣及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且能用于檢測(cè)各種腫瘤生物標(biāo)志物，尤其是腫瘤相關(guān)基因的異常甲基化，在肺癌等癌癥的早期診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中具有極其重要的意義。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明聯(lián)合檢測(cè)時(shí)所有樣本至少兩個(gè)基因及其兩個(gè)以上的基因發(fā)生甲基化的檢測(cè)敏感度與特異度已經(jīng)較符合肺癌檢測(cè)與診斷水平，因此可將此方法應(yīng)用到肺癌早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。
本發(fā)明結(jié)合臨床資料及對(duì)照(10例健康正常人血漿樣本)，運(yùn)用SPSS 20.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如運(yùn)用卡方檢驗(yàn)(P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，最終結(jié)果如下：血漿中五個(gè)目的基因甲基化檢測(cè)的敏感度分別是:p16為45％，DLEC1為48％，CDH1為76％，DAPK為14％，RUNX3為29％，而五個(gè)目的基因的特異度都是100％。
本發(fā)明把至少一個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性，則此時(shí)甲基化檢測(cè)的敏感度為95％，而根據(jù)健康對(duì)照組，其特異度為100％。同時(shí)，當(dāng)把五個(gè)目的基因中至少兩個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性時(shí)，則甲基化檢測(cè)的敏感度為71％，而特異度則為100％。當(dāng)把五個(gè)目的基因中至少三個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性時(shí)，則甲基化檢測(cè)的敏感度為40％,而特異度則為100％。
具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的檢測(cè)方法只需要20ml外周血，為無損傷性檢測(cè)，不給受試者帶來痛苦，易于被人們接受和推廣。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的一組甲基化基因檢測(cè)方法流程圖。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明致力于肺癌敏感基因甲基化的分析，經(jīng)過廣泛的篩選，篩選了5個(gè)甲基化敏感基因，它們是p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因。在血漿樣品中，這些基因啟動(dòng)子相關(guān)區(qū)域的甲基化狀態(tài)在肺癌患者和非癌患者之間存在顯著的差異，即在肺癌患者的血漿樣品中這些基因的CpG發(fā)生高度甲基化。因此，這些基因是肺癌的標(biāo)志物；可作為肺癌早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法和肺癌早期篩查。
本發(fā)明的一組甲基化基因可用于：在所有人群特別是在肺癌高危人群中，對(duì)受檢者血漿標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，分析和評(píng)估受檢者是否有患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)，以便臨床醫(yī)生對(duì)篩選出的肺癌高危者進(jìn)行早期干預(yù)。
經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明把至少一個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性，則此時(shí)甲基化檢測(cè)的敏感度為95％，而根據(jù)健康對(duì)照組，其特異度為100％。同時(shí)，當(dāng)把五個(gè)目的基因中至少兩個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性時(shí)，則甲基化檢測(cè)的敏感度為71％，而特異度則為100％。當(dāng)把五個(gè)目的基因中至少三個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性時(shí)，則甲基化檢測(cè)的敏感度為40％,而特異度則為100％，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的檢測(cè)方法只需要20ml外周血，為無損傷性檢測(cè)，不給受試者帶來痛苦，易于被人們接受和推廣。
本發(fā)明的一組甲基化基因用途操作過程簡單，快速，非常適合醫(yī)院肺癌早期風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估輔助檢測(cè)，對(duì)肺癌高危人群篩查，以便臨床早期干預(yù)。
在本發(fā)明中，術(shù)語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成的，它可以作為在一定條件下誘發(fā)DNA合成的起始點(diǎn)，在合適條件下誘發(fā)合成與核酸鏈互補(bǔ)的引物擴(kuò)增產(chǎn)物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核苷及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液中并在合適的溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作詳細(xì)描述，
本發(fā)明實(shí)施例提供的一組甲基化基因，所述一組甲基化基因包括p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因；DNA基因序列分別為：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5。
SEQ ID NO：1序列為：
TCACCAGAGGGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTC。
SEQ ID NO：2序列為：
TGACCACAGCGATGACGGGATCCGAGAGAAAGGCAAGGCGGAAGGGGTGAGGCCGGAAGCCGAAGTGCCGCAGGGAGTTAGCGGCGTCTCGGTTGCCATGGAGACCAGGAGCTCCAAAACGCGGAGGTCTTTAGCGTCCCGGACCAACGAGTGCCAGGGGACAATGTGGGCGCCAACTTCGCCACCAGCCGGGT。
SEQ ID NO：3序列為：
TGCAGCCACGCACCCCCTCTCAGTGGCGTCGGAACTGCAAAGCACCTGTGAGCTTGCGGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCCCGCTCCAGCCCGGCCCGACCCGACCGCACCCG。
SEQ ID NO：4序列為：
GGACAGCCGGACCGAGCCAACGCCGGGGACTTTGTTCCCTCCGCGGAGGGGACTCGGCAACTCGCAGCGGCAGGGTCTGGGGCCGGCGCCTGGGAGGGA。
SEQ ID NO：5序列為：
GCGTCGCACAGCCAATCGGCGGAGCCCCCATCGCGGGCACCTCGGTGGCGTTCGCGGGGAGGAACGGGGCCTGCCGGAGGCCGCCCAACGGGGAGGGGCGGAAGGCGCCACCCCGCGGAGGAG。
如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例提供的一組甲基化基因的檢測(cè)方法，所述一組甲基化基因的檢測(cè)方法包括以下步驟：
S101：抽取受檢者外周血20ml，并將其血漿分離；提取上述血漿中的cfDNA,并對(duì)其進(jìn)行亞硫酸鹽修飾；
S102:分別設(shè)計(jì)p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的外引物、甲基化引物及非甲基化引物，對(duì)上述亞硫酸鹽修飾過的cfDNA中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因進(jìn)行巢氏甲基化特異性PCR兩輪擴(kuò)增；
S103:將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，并行測(cè)序驗(yàn)證；
S104:對(duì)上述觀察結(jié)果中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因甲基化情況進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的應(yīng)用原理。
本發(fā)明臨床血漿樣本52例，包括42例肺癌患者血漿樣本，以及對(duì)照的10例正常人血漿樣本，均來自云南省第一人民醫(yī)院。本發(fā)明所有進(jìn)行試驗(yàn)的臨床標(biāo)本，其采集過程符合醫(yī)學(xué)倫理規(guī)范，并經(jīng)倫理委員會(huì)同意。
實(shí)例1、對(duì)上述所有血漿樣本中的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)。
本實(shí)施例用nMSP方法檢測(cè)上述五個(gè)基因的甲基化情況，具體步驟如下：
步驟一：血漿樣本的分離及保存：
在上述所有血液樣本中，對(duì)每例患者或正常人都取20ml左右的外周血，并立即置于4℃冰箱短時(shí)間保存(1h左右)，以便于之后分離血漿。
把分別裝有10ml左右外周血樣本的兩只抗凝管置于低速離心機(jī)，然后2500rpm，4℃離心，15min，使樣品分三層(即血漿、白細(xì)胞、紅細(xì)胞)。用移液槍小心輕柔的吸出抗凝管中最上層的血漿(吸出2/3即可)，置于新的15ml離心管中。然后把取出的血漿再次2500rpm，4℃離心，10min。并小心輕柔的把上清液分裝到幾管1.5ml離心管中，注意上清液不需要吸完，可殘余一些，避免吸上細(xì)胞。標(biāo)記好后置于-80℃保存。
步驟二：血漿cfDNA的提取及其濃度測(cè)定：
肺癌患者及正常人血漿cfDNA的提取方法(參照QIAamp MinElute Virus Spin Kit中說明書步驟)：
準(zhǔn)備工作。首先加310μl的Buffer AVE到一管含310μg凍干Carrier RNA中，徹底溶解后進(jìn)行分裝，于-20℃保存。用時(shí)拿出一管，并加入適量Buffer AL(按試劑盒具體要求)，輕輕顛倒，充分混勻，避免起泡。其次，使Buffer AVE恢復(fù)到室溫。
把25μl的Proteinase K加入到1.5ml離心管中。
選取血漿樣本，并從中取200μl的血漿加到上一步中的離心管中。
再加200μl的Buffer AL(包含了Carrier RNA的)，關(guān)蓋渦旋15s。
然后56℃水浴15min。
短暫離心，除去管壁上的殘留。
加250μl的無水乙醇到離心管中，并關(guān)蓋渦旋15s。然后室溫靜置5min，以便充分孵育裂解。
短暫離心，除去管壁上的殘留。
小心的把上清轉(zhuǎn)移到吸附柱(已置于2ml收集管上)中，不要碰到管壁及邊緣。關(guān)蓋，再6000g，25℃離心，1min。棄去包含廢液的收集管，把柱子放入新的收集管上。
加500μl的Buffer AW1到柱中，關(guān)蓋，再6000g，25℃離心，1min。棄去舊收集管，把柱子放入新的收集管上。
加500μl的Buffer AW2到柱中，關(guān)蓋，再6000g，25℃離心，1min。棄去舊收集管，把柱子放入新的收集管上。
加500μl的無水乙醇到柱中，關(guān)蓋，再6000g，25℃離心，1min。棄去舊收集管，把柱子放入新的收集管上。
然后20000g，25℃全速離心，3min，使柱子完全干燥。
把柱子放入新的收集管，并開蓋，56℃孵育3min，使柱子干燥完全。
把柱子放入新的1.5ml離心管中，開蓋，加入90μl的Buffer AVE到膜中央，并室溫下靜置5min。
然后20000g，25℃全速離心，1min，進(jìn)行洗脫。
得到的cfDNA置于-20℃保存。
本發(fā)明血漿cfDNA濃度測(cè)定：(運(yùn)用Qbit3.0，參照 dsDNA HS Assay Kit中說明書步驟)
計(jì)算所測(cè)樣本需配制的A:Qubit dsDNA HS Reagent及B:Qubit dsDNA HS Buffer的體積，然后把A和B充分混合即為working solution。A＝(n+2)μl，B＝199*(n+2)μl，n為樣本量。
取190μl的woking solution至試劑盒專用管。
取10μl的S1溶液加入一管含190μl woking solution的專用管中?；旌?s左右，并去除氣泡。同時(shí)取10μl的S2溶液加入另一管含190μlwoking solution的專用管中，充分混合。
取4μl的cfDNA樣本至新的專用管中，并加入196μl的working solution使體積達(dá)到200μl,混合2s左右，并去除氣泡。
室溫下靜置2min。
打開Qubit 3.0，并設(shè)置好，開始進(jìn)入Run Samples。然后分別插上標(biāo)準(zhǔn)品S1及S2，并讀數(shù)。
讀樣品前，再次進(jìn)行設(shè)置，即把樣品體積設(shè)置為4μl。然后插上樣品管，進(jìn)行讀數(shù)。
步驟三：cfDNA的瓊脂糖凝膠電泳：
制備1％的瓊脂糖凝膠。在冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠溶液中加入花青素，混勻，并小心倒入制膠槽內(nèi)，室溫下靜置，直至完全凝固。將凝固后的膠板放入電泳槽(已倒入1×TAE緩沖液)中浸潤，然后開始點(diǎn)樣。取4μl血漿cfDNA與2μl左右的6×loading Dye混合，然后依據(jù)樣品順序逐孔點(diǎn)樣。在100V電壓下電泳20分鐘左右，然后取出凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。
步驟四：血漿cfDNA的亞硫酸氫鹽修飾：
肺癌患者及正常人血漿cfDNA的亞硫酸氫鹽修飾方法(參照EZ DNA Methylation-Gold Kit中說明書步驟)。
步驟五：血漿cfDNA中p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因的巢式甲基化特異性PCR(nMSP)。
步驟六：PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；
步驟七：判斷標(biāo)準(zhǔn):把只有單獨(dú)的甲基化引物M擴(kuò)增成功或者是甲基化引物M及非甲基化引物U都擴(kuò)增成功判斷為此基因有陽性異常甲基化，而把只有單獨(dú)的非甲基化引物U擴(kuò)增成功判斷為此基因陰性無異常甲基化；
步驟八：PCR結(jié)果的驗(yàn)證：
1：PCR產(chǎn)物的選取
取出p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因在血漿cfDNA中的nMSP第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
首先在這5個(gè)基因的所有陽性樣本(即有M擴(kuò)增成功的樣本)里分別隨機(jī)選取2個(gè)p16陽性樣本、2個(gè)DLEC1陽性樣本、2個(gè)CDH1陽性樣本、2個(gè)DAPK陽性樣本及2個(gè)RUNX3陽性樣本，并挑出這10個(gè)陽性樣本的甲基化引物(M)擴(kuò)增產(chǎn)物，用以驗(yàn)證其是否為真的陽性。
其次在這5個(gè)基因的所有陰性樣本(即只有U擴(kuò)增成功的樣本)里分別隨機(jī)選取2個(gè)p16陰性樣本、2個(gè)DLEC1陰性樣本、2個(gè)CDH1陰性樣本、2個(gè)DAPK陰性樣本及2個(gè)RUNX3陰性樣本，并挑出這10個(gè)陰性樣本的非甲基化引物(U)擴(kuò)增產(chǎn)物，用以驗(yàn)證其是否為真的陰性。
2：PCR產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化；PCR產(chǎn)物連接和轉(zhuǎn)化方法參照PEASY-T5Zero Cloning Kit中說明書步驟：
配制連接體系。在1.5ml離心管中依次加入2μl的純化后PCR產(chǎn)物、1μl的T5Cloning Vector以及2μl的去離子水，
充分混合，并在室溫(最好是25℃)下靜置5min。然后將1.5ml離心管放在冰上。
把50μl的Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞加入連接產(chǎn)物中，輕輕混勻，然后25min冰浴。
迅速放入42℃水浴鍋，進(jìn)行30s熱激。然后立即放到冰上2min。
加入250μl平衡到室溫的液體LB培養(yǎng)基，并置于搖床(200rpm，37℃)，孵育1h。
為得到較多克隆，進(jìn)行4,000rpm，25℃離心1min，棄掉150μl的上清液，然后輕彈剩下的，使之懸浮。
取150μl的懸浮菌液均勻涂抹在LB-Amp平板上，再倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h左右。
3：陽性克隆子的篩選；參照PEASY-T5Zero Cloning Kit中說明書步驟：
配PCR體系。其中50μl的PCR反應(yīng)體系為：在PCR管中分別加入Takara rTaq 0.25μl，10×rTaq PCR Buffer(含Mg2+)5μl，dNTP Mixture 4μl，通用引物M13F及M13R各1μl，ddH2O 39μl及Template(菌落)。
而PCR反應(yīng)條件為為98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。
挑克隆子。先劃在另一個(gè)LB-Amp平板的對(duì)應(yīng)格中，再沾在配好的PCR體系里。每個(gè)樣本挑5個(gè)左右的克隆子。而劃好的平板則倒置培養(yǎng)在37℃恒溫培養(yǎng)箱中12h左右。
輕彈混勻PCR管，短暫離心，然后進(jìn)行PCR。
電泳，然后凝膠成像系統(tǒng)下觀察是否有單一條帶，如有，則觀察PCR產(chǎn)物長度(載體一段163bp+目的片段長度)，從而篩選出陽性克隆子。
4：測(cè)序；挑取陽性克隆子對(duì)應(yīng)編號(hào)平板上的菌落，沾在600μl的LB-Amp液體培養(yǎng)基中，再置于搖床(200rpm，37℃)過夜，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
作甲基化測(cè)序。
5：驗(yàn)證：
觀察峰圖，并運(yùn)用Bio analysis軟件，結(jié)合NCBI上下載的參考序列，與目的基因(p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3)各2個(gè)陽性樣本(共10個(gè))中甲基化引物(M)擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性克隆子測(cè)序結(jié)果作比對(duì)，觀察目的片段上CpG島異常甲基化情況，驗(yàn)證其是否為對(duì)應(yīng)甲基化引物(M)的正確擴(kuò)增產(chǎn)物，是否為假陽性。
同時(shí)，與目的基因(p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3)各2個(gè)陰性樣本(共10個(gè))中非甲基化引物(U)擴(kuò)增產(chǎn)物的陽性克隆子測(cè)序結(jié)果作比對(duì)，觀察目的片段上CpG島甲基化情況，驗(yàn)證其是否為對(duì)應(yīng)非甲基化引物(U)的正確擴(kuò)增產(chǎn)物，是否為假陰性。
步驟九：血漿中五個(gè)目的基因甲基化檢測(cè)：
本發(fā)明結(jié)合臨床資料及對(duì)照(10例健康正常人血漿樣本)，運(yùn)用SPSS 20.0等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，如運(yùn)用卡方檢驗(yàn)(P<0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，最終結(jié)果如下：血漿中五個(gè)目的基因甲基化檢測(cè)的敏感度分別是:p16為45％，DLEC1為48％，CDH1為76％，DAPK為14％，RUNX3為29％，而五個(gè)目的基因的特異度都是100％。
進(jìn)一步，步驟五中，巢式甲基化特異性PCR擴(kuò)增包括：將步驟四經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾過的cfDNA模板進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增；nMSP分為兩輪擴(kuò)增，且兩輪PCR都使用相同的聚合酶Takara Epi Taq HS，都在同一臺(tái)PCR儀上進(jìn)行；但第一輪PCR的模板為上一步經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾過的血漿cfDNA，而第二輪PCR的模板為第一輪PCR后未稀釋的產(chǎn)物；
50μl的PCR反應(yīng)體系為：在PCR管中分別加入Takara Epi Taq HS 0.25μl，10×Epi Taq PCR Buffer(Mg2+free)5μl，MgCl25μl，dNTP Mixture 6μl，cfDNA Template 2μl及ddH2O 28μl，正向F與反向R引物各2μl；
p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因nMSP兩輪PCR的條件：
p16第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，65℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存。
p16第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共29個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。
DLEC1第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存。
DLEC1第二輪PCR反應(yīng)條件為為98℃變性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共32個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。
CDH1第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存。
CDH1第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，66℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共34個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。
DAPK第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存。
DAPK第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，68℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。
RUNX3第一輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，44℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)，然后72℃終延伸5min，最后4℃保存。
RUNX3第二輪PCR反應(yīng)條件為98℃變性10s，56℃退火30s，72℃延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)，最后4℃保存。
同時(shí)，設(shè)置去離子水為空白對(duì)照，EpiTect Control DNA為陽性對(duì)照，正常外周血白細(xì)胞DNA為陰性對(duì)照。
進(jìn)一步，步驟六中，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳包括：
制備2％的瓊脂糖凝膠，并且等瓊脂糖溶液溫度降至65℃，加入花青素；
制備膠板:把制膠槽插于制膠板上，作為模子；將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠溶液小心倒入槽內(nèi)，室溫下靜置，直至完全凝固；
點(diǎn)樣:將凝固后的膠板放入已倒入1×TAE緩沖液的電泳槽中浸潤，然后開始點(diǎn)樣；取4μl的p16、DLEC1、CDH1、DAPK及RUNX3基因第二輪PCR產(chǎn)物樣品與2μl的6×loading Dye混合，然后依據(jù)樣品順序逐孔點(diǎn)樣；
電泳:在100V電壓下電泳20分鐘，然后取出凝膠，置于凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。
本發(fā)明把至少一個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性，則此時(shí)甲基化檢測(cè)的敏感度為95％，而根據(jù)健康對(duì)照組，其特異度為100％。同時(shí)，當(dāng)把五個(gè)目的基因中至少兩個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性時(shí)，則甲基化檢測(cè)的敏感度為71％，而特異度則為100％。當(dāng)把五個(gè)目的基因中至少三個(gè)基因有異常甲基化的樣本判斷為陽性時(shí)，則甲基化檢測(cè)的敏感度為40％,而特異度則為100％。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
<110> 申請(qǐng)人名稱 昆明理工大學(xué)
<120>一組甲基化基因及其檢測(cè)方法
<160> 5
<210> 1
<211> 150
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
TCACCAGAGGGTGGGGCGGACCGCGTGCGCTCGGCGGCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGCAGCGGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGGCGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCTTCGGCTGACTGGCTGGCCACGGCCGCGGCCCGGGGTC
<210> 2
<211> 194
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
TGACCACAGCGATGACGGGATCCGAGAGAAAGGCAAGGCGGAAGGGGTGAGGCCGGAAGCCGAAGTGCCGCAGGGAGTTAGCGGCGTCTCGGTTGCCATGGAGACCAGGAGCTCCAAAACGCGGAGGTCTTTAGCGTCCCGGACCAACGAGTGCCAGGGGACAATGTGGGCGCCAACTTCGCCACCAGCCGGGT
<210> 3
<211> 112
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
TGCAGCCACGCACCCCCTCTCAGTGGCGTCGGAACTGCAAAGCACCTGTGAGCTTGCGGAAGTCAGTTCAGACTCCAGCCCGCTCCAGCCCGGCCCGACCCGACCGCACCCG
<210> 4
<211> 99
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
GGACAGCCGGACCGAGCCAACGCCGGGGACTTTGTTCCCTCCGCGGAGGGGACTCGGCAACTCGCAGCGGCAGGGTCTGGGGCCGGCGCCTGGGAGGGA
<210> 5
<211>123
<212> DNA
<213>人工序列
<400> DNA序列
GCGTCGCACAGCCAATCGGCGGAGCCCCCATCGCGGGCACCTCGGTGGCGTTCGCGGGGAGGAACGGGGCCTGCCGGAGGCCGCCCAACGGGGAGGGGCGGAAGGCGCCACCCCGCGGAGGAG