本發(fā)明涉及一種基于兩端鎖定DNA酶的分子信標(biāo)識(shí)別miRNA新方法，屬于生物傳感技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

miRNAs在眾多疾病(特別是腫瘤疾病)基因調(diào)控中扮演著重要角色，其異常表達(dá)總是伴隨著疾病的產(chǎn)生，通過(guò)測(cè)定miRNAs表達(dá)水平對(duì)疾病進(jìn)行診斷將成為一種很有前景的診斷手段，因此建立簡(jiǎn)單、高靈敏的檢測(cè)miRNAs分析方法非常重要。

G-四聚體DNA酶可催化魯米諾和H₂O₂產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，結(jié)合納米材料、核酸適配體組裝、電化學(xué)等技術(shù)手段，建立了眾多檢測(cè)miRNAs分析方法。但是，很多方法都存在背景信號(hào)高的問(wèn)題。目前已建立的高靈敏度的檢測(cè)miRNAs的方法主要基于信號(hào)放大或標(biāo)記等手段，具有成本高、實(shí)驗(yàn)過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)。因此，有必要開發(fā)一種新型的低背景、無(wú)標(biāo)記、無(wú)需信號(hào)放大步驟的高靈敏度識(shí)別miRNAs的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用阻斷DNA預(yù)先封閉探針DNA鏈上的富G適配體序列兩端，降低背景信號(hào)，目標(biāo)miRNA-21通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)置換出阻斷DNA，激活預(yù)先封閉富G適配體序列，形成高催化活性的分子內(nèi)G-四聚體DNA酶。加入魯米諾和H₂O₂后，化學(xué)發(fā)光信號(hào)得到大大增強(qiáng)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

(1)將500pM探針DNA與1000pM阻斷DNA在HEPES緩沖中孵育一個(gè)小時(shí)。

(2)在(1)所述的混合溶液中加入目標(biāo)miRN-21繼續(xù)孵育三個(gè)小時(shí)；

(3)在(2)所述的混合溶液中加入2.5nM氯化血紅素繼續(xù)孵育半個(gè)小時(shí)；

(4)取(3)所述的溶液100uL，加入50uL 2×10^-3M的魯米諾溶液和50uL 20mM H₂O₂溶液，用化學(xué)發(fā)光儀采集化學(xué)發(fā)光信號(hào)，分析測(cè)定結(jié)果。

發(fā)明效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)需標(biāo)記和和信號(hào)放大等技術(shù)；

(2)與目前無(wú)放大無(wú)標(biāo)記的DNA酶設(shè)計(jì)相比，本方法的信背比提高了4倍以上；

(3)靈敏度極高，可區(qū)別不同miRNA，含有基因突變的miRNA也能很好識(shí)別；

(4)通過(guò)改變探針DNA部分序列可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同miRNAs識(shí)別。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

將500pM探針DNA與1000pM阻斷DNA在HEPES緩沖中孵育一個(gè)小時(shí)。向混合溶液中加入不同類型的miRNA繼續(xù)孵育3個(gè)小時(shí)后，加入2.5nM氯化血紅素再次孵育半個(gè)小時(shí)。取孵育后的溶液100uL，加入50uL 2×10^-3M的魯米諾溶液和50uL 20mM H₂O₂溶液，用化學(xué)發(fā)光儀采集化學(xué)發(fā)光信號(hào)，分析其測(cè)定結(jié)果。結(jié)果顯示，只有miRNA-21產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，濃度為miRNA-21的10倍的miRNA-let 7a、miRNA-let 7c和miRNA-let 7j均沒(méi)有明顯的信號(hào)增加或降低現(xiàn)象。該方法能夠很好識(shí)別目標(biāo)miRNA。

實(shí)施例2

將500pM探針DNA與1000pM阻斷DNA在HEPES緩沖中孵育一個(gè)小時(shí)。向混合溶液中加入miRNA-21，一個(gè)堿基突變和兩個(gè)堿基突變的miRNA-21繼續(xù)孵育3個(gè)小時(shí)后，加入2.5nM氯化血紅素再次孵育半個(gè)小時(shí)。取孵育后的溶液100uL，加入50uL 2×10^-3M的魯米諾溶液和50uL 20mM H₂O₂溶液，用化學(xué)發(fā)光儀采集化學(xué)發(fā)光信號(hào)，分析其測(cè)定結(jié)果。結(jié)果顯示，濃度為miRNA-21的10倍的含有基因突變的miRNA-21產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)沒(méi)有明顯增加或降低現(xiàn)象，該方法能夠很好的區(qū)分miRNA的基因突變。