本發(fā)明屬于基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬后圓線蟲為圓形目、后圓科、后圓屬，是豬長刺后圓線蟲、復(fù)陰后圓線蟲、薩姆氏后圓線蟲3種后圓線蟲的總稱，豬后圓線蟲病是一種由線蟲寄生于豬支氣管和細支氣管的線蟲病，由于蟲體呈絲狀，寄生于肺臟，故又稱豬肺絲蟲病或肺線蟲病。

豬后圓線蟲對羊、牛、豬均易感，偶見于羊、鹿、牛和其他反芻獸，亦偶見于人，主要發(fā)生在幼豬，死亡率較高，危害較大。豬肺絲蟲病呈地方性流行，在河谷區(qū)和低熱區(qū)多發(fā)。在我國，江西省豬后圓線蟲病感染率為40％，遼寧省為59.81％，湖南省為5.93％，河北省為18.5％，江蘇省為43.6％，四川省為20.7，并呈明顯的逐年上升趨勢。

對豬后圓線蟲病的準(zhǔn)確診斷是有效防控此病的前提，現(xiàn)有的檢測方法主要根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)情況、病理變化、進行初步診斷，并進一步結(jié)合糞便檢查蟲卵進行確診，雖然現(xiàn)有檢測方法簡單易行，對成蟲有一定的準(zhǔn)確性，但對于形態(tài)上難以區(qū)分種類。特別是各種線蟲在蟲卵和幼蟲階段難以區(qū)分，而且豬長刺后圓線蟲、豬復(fù)陰后圓線蟲、豬薩姆氏后圓線蟲3種后圓線蟲彼此也難以區(qū)分，同時現(xiàn)有的檢測方法檢測效率、檢測準(zhǔn)確性較低、檢測結(jié)果受檢測人員經(jīng)驗影響大。

因此，有必要對現(xiàn)有豬長刺后圓線蟲檢測做進一步開發(fā)，提供一種檢測方法檢測效率高、檢測準(zhǔn)確性高、檢測結(jié)果受檢測人員經(jīng)驗影響小的檢測試劑盒及其使用方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服以上背景技術(shù)中提到的不足和缺陷，提供一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物及其應(yīng)用，其具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、檢測效率高的優(yōu)點。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物，所述特異性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，

所述MeJB3F的核苷酸序列為：5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3'；

所述MeJB4.5R的核苷酸序列為：5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG-3'。

通過比對多種豬后圓線蟲cox1基因，針對較穩(wěn)定保守區(qū)設(shè)計所述MeJB3F和MeJB4.5R，預(yù)期擴增片段大小約為400bp左右。引物序列中G+C含量為40％～60％，上下游引物不存在二級結(jié)構(gòu)，互配可能性低，引物具有特異性。

本發(fā)明還提供一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應(yīng)液、以及引物混合液，所述引物混合液包括上述的特異性引物。

上述豬長刺后圓線蟲的檢測試劑盒，還包括陽性對照液，所述陽性對照液包括豬長刺后圓線蟲DNA。

上述豬長刺后圓線蟲的檢測試劑盒，所述DNA裂解液主要由100mM NaCl70μl、pH值為8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值為8.0的25mM EDTA150μl、1％W/V十二烷基硫酸鈉30μl和1.7μg/μL蛋白酶K200μl組成。所述DNA裂解液采用適宜的比例配置，避免資源浪費。

上述的檢測試劑盒，所述PCR反應(yīng)液包括PCR緩沖液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液。

上述的檢測試劑盒，所述引物混合液中所述MeJB3F和MeJB4.5R的濃度均為100pmol/μL。

本發(fā)明還提供一種如上述的特異性引物在檢測豬長刺后圓線蟲的應(yīng)用。

上述的應(yīng)用，利用所述特異性引物制成檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應(yīng)液、以及引物混合液，所述引物混合液包括所述特異性引物，所述檢測試劑盒的使用方法包括以下步驟：

(1)DNA的提?。喝〈郎y蟲體樣品用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗，移去雙蒸水，加入DNA裂解液置于37～55℃溫箱中16-18h，再提取DNA，制備得到樣品DNA；

(2)PCR擴增：取滅菌ddH₂O、PCR反應(yīng)液、Taq酶和引物混合液按適合的PCR反應(yīng)體系加入離心管中，混勻后分裝放入多個離心管中制得多份分裝液，取步驟(1)制備的樣品DNA，每一樣品DNA對應(yīng)加入一份分裝液中并標(biāo)號，混勻，置于PCR擴增儀上按適合的PCR擴增條件反應(yīng)，制得PCR擴增產(chǎn)物；

(3)PCR產(chǎn)物觀察：取步驟(2)制備的PCR擴增產(chǎn)物依標(biāo)號加樣于1.0％瓊脂糖凝膠上，120～130V電壓電泳20～40分鐘后，置于紫外透射儀下觀察是否出現(xiàn)條帶，若存在400bp～410bp大小的條帶，則待測蟲體樣品為豬長刺后圓線蟲；若不存在400bp～410bp大小的條帶，則待檢測蟲體樣品不是豬長刺后圓線蟲。

上述的檢測試劑盒的使用方法，所述步驟(2)中PCR反應(yīng)體系為PCR緩沖液2～3μL、25mM的MgCl₂溶液3～4μL、2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液2μL、5U/μL的Taq酶0.25～0.3μL、樣品DNA、引物混合液0.8～1.2μL，余量為滅菌ddH₂O補至25μL。

上述的檢測試劑盒的使用方法，所述步驟(2)中PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec、52～58℃退火30sec、72℃延伸30sec，共38個循環(huán)；72℃延伸5min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、通過設(shè)計MeJB3F和MeJB4.5R可以有效擴增出目的片段，從而檢測出豬長刺后圓線蟲，同時對同屬的豬復(fù)陰后圓線蟲和豬薩姆氏后圓線蟲無反應(yīng)，從基因?qū)用嫔舷鄥^(qū)別；

2、檢測試劑盒的特異性高、檢測準(zhǔn)確、檢測效率高；

3、通過檢測試劑盒的使用方法，可以擴增出清晰的條帶，用于檢測分析，且操作一致性高；

4、檢測試劑盒本身便于運輸、存放保質(zhì)時間長。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1，為使用本發(fā)明提供的檢測試劑盒一較佳實施例的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；

圖2，為本發(fā)明提供的檢測試劑盒用于檢測不同線蟲一較佳實施例的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；

圖3，為本發(fā)明提供的檢測試劑盒存放10個月后制備的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下文將結(jié)合說明書附圖和較佳的實施例對本文發(fā)明做更全面、細致地描述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于以下具體實施例。

除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護范圍。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設(shè)備等均可通過市場購買得到或者可通過現(xiàn)有方法制備得到。

除非另有特別說明，本發(fā)明中用到DNA提取試劑盒為普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司提供的WizardTM DNA Clean-Up System。

實施例1

本發(fā)明提供一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物，特異性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R，

MeJB3F的核苷酸序列為：5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3'；

MeJB4.5R的核苷酸序列為：5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG-3'。

本發(fā)明提供一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的檢測試劑盒。檢測試劑盒主要由DNA裂解液、PCR反應(yīng)液、陽性對照液和引物混合液組成。

DNA裂解液主要由100mM NaCl 70μl、pH值為8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值為8.0的25mM EDTA150μl、1％W/V十二烷基硫酸鈉30μl和1.7μg/μL蛋白酶K 200μl組成。

PCR反應(yīng)液包括PCR緩沖液、25mM MgCl₂溶液和2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液。

陽性對照液含有豬長刺后圓線蟲DNA。

引物混合液包括特異性引物，特異性引物包括MeJB3F和MeJB4.5R，其中MeJB3F和MeJB4.5R的濃度均為100pmol/μL。MeJB3F和MeJB4.5R分別為豬長刺后圓線蟲的cox1序列特異性上下游引物，預(yù)期擴增片段大小約為400bp。

本發(fā)明還提供一種上述特異性引物在檢測豬長刺后圓線蟲的應(yīng)用。利用特異性引物制成檢測試劑盒，檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應(yīng)液、以及陽性對照液和引物混合液，引物混合液包括特異性引物。上述檢測試劑盒的使用方法包括以下步驟：

(1)DNA的提?。喝〈郎y蟲體樣品置于1.5mL的離心管中，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗6次以上，移去離心管中的水，加DNA裂解液消化蛋白質(zhì)，釋放基因組DNA，55℃溫箱16-18h，制得蟲體懸液，將制備的蟲體懸液按DNA提取試劑盒使用說明提取樣品DNA，提取得到的樣品DNA直接使用或放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)PCR擴增：選擇適合的PCR反應(yīng)體系，設(shè)n為樣品DNA數(shù)量，以(n+3)倍PCR反應(yīng)體系的配比向離心管中依次加入滅菌ddH₂O、PCR緩沖液、MgCl₂、脫氧核糖核苷酸、引物混合液、Taq酶，在本實施例中，樣品DNA的數(shù)量為3，則向離心管中依次加入84μL滅菌ddH₂O、21μL PCR緩沖液、12μL MgCl₂、6μL脫氧核糖核苷酸、3μLMeJB3F、3μLMeJB4.5R、1.5μL Taq酶，漩渦震蕩混勻，混勻后分裝放入5個0.2μL的離心管中制得5份分裝液，每管放置24μL。取步驟(1)制備的樣品DNA，每一樣品DNA對應(yīng)加入一份分裝液中并標(biāo)號，混勻，置于PCR擴增儀上按適合的PCR擴增條件反應(yīng)，制得PCR擴增產(chǎn)物；

同時設(shè)置陰性對照以確保檢測試劑盒無污染、實驗操作規(guī)范、實驗結(jié)果可信，陰性對照采用前述步驟處理，不同之處在于，在分裝液中不加入樣品DNA，加入相同體積的ddH₂O；設(shè)置陽性對照方便與樣品PCR擴增產(chǎn)物進行比對，確保實驗結(jié)果可信，陽性對照采用前述步驟處理，不同之處在于，在分裝液中不加入樣品DNA，加入相同體積的陽性對照液。

請參閱表1，為25μL PCR反應(yīng)體系。具體的，在本實施例中PCR反應(yīng)體系采用25μL體系，在其他實施例中也可以根據(jù)需要對表1的配比進行等比例的更改。

表1 25μL PCR反應(yīng)體系

PCR擴增條件為：

(3)PCR產(chǎn)物觀察：取步驟(2)中制備的樣品DNA的PCR擴增產(chǎn)物、陰性對照的PCR擴增產(chǎn)物和陽性對照的PCR擴增產(chǎn)物分別加樣于1.0％瓊脂糖凝膠上，128V電泳30分鐘，置于紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照分析，若存在400bp～410bp大小的條帶，則待測蟲體樣品為豬長刺后圓線蟲；若不存在400bp～410bp大小的條帶，則待檢測蟲體樣品不是豬長刺后圓線蟲。

請參閱圖1，為使用本發(fā)明提供的檢測試劑盒一較佳實施例的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道M為Marker；泳道1～3為豬長刺后圓線蟲樣品得到的PCR擴增產(chǎn)物，泳道4為陰性對照，泳道5為陽性對照。由圖1可得出，泳道1～3均出現(xiàn)一條清晰的條帶，條帶的大小為400bp左右，符合引物設(shè)計。陰性對照無反應(yīng)。陽性對照出現(xiàn)一條400bp左右的清晰條帶，與泳道1～3條帶位置一樣，符合實驗設(shè)計。對步驟(2)中制得的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，再將測序結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行比對，與引物設(shè)計相符合，為豬長刺后圓線蟲DNA。

實施例2

采用本發(fā)明提供的檢測試劑盒以及本發(fā)明提供的檢測試劑盒的使用方法，對豬蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、日本血吸蟲、豬長刺后圓線蟲、豬復(fù)陰后圓線蟲、豬薩姆氏后圓線蟲進行檢測。具體方法如下：

(1)DNA的提?。喝〗?jīng)過DNA有效性驗證的豬蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、日本血吸蟲、豬長刺后圓線蟲、復(fù)陰后圓線蟲、薩姆氏后圓線蟲的DNA樣品備用；

(2)PCR擴增：按適合的PCR反應(yīng)體系的9倍，向離心管中依次加入滅菌ddH₂O、緩沖液、MgCl₂、脫氧核糖核苷酸、引物混合液、Taq酶，漩渦震蕩混勻，混勻后分裝放入多個0.2μL的離心管中制得多份分裝液，每一離心管放置24μL，取步驟(1)制備的每一樣品DNA加入一份分裝液中并標(biāo)號，混勻，置于PCR擴增儀上按適合的PCR擴增條件反應(yīng)，制得PCR擴增產(chǎn)物；

同時設(shè)置陰性對照和陽性對照，陰性對照采用前述步驟制備，不同之處在于，在分裝液中不加入樣品DNA，加入相同體積的ddH₂O，陽性對照采用前述步驟制備，不同之處在于，在分裝液中不加入樣品DNA，加入相同體積的陽性對照液。

具體的，在本實施例中采用25μL PCR反應(yīng)體系。請參閱表2，為25μL PCR反應(yīng)體系。

表2 25μL PCR反應(yīng)體系

PCR擴增條件為：

(3)PCR產(chǎn)物觀察：取步驟(2)中制備樣品DNA的PCR擴增產(chǎn)物、陰性對照的PCR擴增產(chǎn)物和陽性對照的PCR擴增產(chǎn)物加樣于1.0％瓊脂糖凝膠上128V電泳30分鐘，置于紫外透射儀下觀察結(jié)果并拍照分析，若存在400bp～410bp大小的條帶，則待測蟲體樣品為豬長刺后圓線蟲；若不存在400bp～410bp大小的條帶，則待檢測蟲體樣品不是豬長刺后圓線蟲。

請參閱圖3，為本發(fā)明提供的檢測試劑盒用于檢測不同線蟲一較佳實施例的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道M為Marker；泳道1～7分別為經(jīng)過DNA有效性驗證的不同蟲體樣品的PCR擴增產(chǎn)物，依次為豬蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、日本血吸蟲、豬長刺后圓線蟲、豬復(fù)陰后圓線蟲、豬薩姆氏后圓線蟲。由圖1可得出，泳道1～4均無條帶，證明檢測試劑盒對豬蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、日本血吸蟲無反應(yīng)。泳道5有一條清晰的條帶，條帶的大小為400bp左右，符合引物設(shè)計，為豬長刺后圓線蟲擴增產(chǎn)物。泳道6～8均無條帶，證明檢測試劑盒對豬復(fù)陰后圓線蟲和豬薩姆氏后圓線蟲無反應(yīng)。對步驟(2)制備的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，再將測序結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行比對，與引物設(shè)計相符合，測序結(jié)果為豬長刺后圓線蟲DNA，進一步驗證檢測試劑盒能有效檢測出豬長刺后圓線蟲，并與其它線蟲相區(qū)別。

豬蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、日本血吸蟲在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)分類上與豬后圓線蟲相似，豬長刺后圓線蟲、豬復(fù)陰后圓線蟲和豬薩姆氏后圓線蟲同屬于后圓線蟲，上述線蟲現(xiàn)有的檢測方法均難以區(qū)分。采用豬長刺后圓線蟲檢測試劑盒能有效檢測出長刺圓線蟲，同時對于相似的豬蛔蟲、毛首線蟲、食道口線蟲、日本血吸蟲，以及同屬的豬復(fù)陰后圓線蟲和豬薩姆氏后圓線蟲相區(qū)別，其特異性強。

將檢測試劑盒在4℃和-20℃保存，設(shè)置放置1個月，2個月，3個月、4個月，5個月，6個月、7個月、8個月、9個月、10個月，采用上述分別放置不同時間的檢測試劑盒進行檢測，檢測方法參照上述檢測試劑盒的使用方法。請參閱圖3，為本發(fā)明提供的檢測試劑盒存放10個月后制備的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖，其中泳道M為Mark，泳道1～5為使用4℃下存放10個月的檢測試劑盒的擴增產(chǎn)物，6～10為使用-20℃下存放10個月的檢測試劑盒的擴增產(chǎn)物豬長刺后圓線蟲，泳道11為：陰性對照。由圖2可以觀察到泳道1～～10均能產(chǎn)生清晰的條帶，并且條帶大小與引物設(shè)計一致。對擴增產(chǎn)物進行測序，再將測序結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫進行比對，與引物設(shè)計相符合為豬長刺后圓線蟲DNA。表明采用存放10個月的檢測試劑盒依然可以有效檢測出豬長刺后圓線蟲，即檢測試劑盒可在4℃和-20℃下至少保存10個月。

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物及其應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaaagaatt catgaattga aaacg 25

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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