本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性的引物及其PCR方法。
背景技術(shù)：
臨床上，硫嘌呤類藥物（巰基嘌呤類藥物）應(yīng)用廣泛。但是，該類藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率較高，包括骨髓抑制、肝臟損害、胃腸紊亂、胰腺炎和流行感冒樣癥狀等。
目前的研究認為，巰基嘌呤類藥物的不良反應(yīng)可能與藥物的代謝途徑及基因多態(tài)性有關(guān)。巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）和三磷酸肌苷焦磷酸酶（inosine triphosphate pyrophosphatase，ITPA）是巰基嘌呤類藥物的代謝酶，其中TPMT是巰基嘌呤類藥物代謝的關(guān)鍵酶，TPMT和ITPA存在明顯的遺傳多態(tài)性。但是仍然有部分患者的不良反應(yīng)的發(fā)生，無法解釋。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用PCR方法檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR?？梢愿鶕?jù)電泳結(jié)果確定ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型，結(jié)合個體的其他生物學(xué)指標對于巰基嘌呤類藥物的療效和副作用進行預(yù)測，克服了臨床選擇巰基嘌呤類藥物的盲目性，在基因型分析的基礎(chǔ)上可以預(yù)測患者使用巰基嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導(dǎo)臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療。
本發(fā)明的另一目的是提供上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR在制備通過PCR擴增生物樣品檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的是提供一種包含上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR的ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點檢測試劑盒。
本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：
一種用PCR方法檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR，其序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。
上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR在檢測生物樣品ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
一種通過PCR擴增生物樣品檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的方法，是以待測生物樣品的DNA為模板，以上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果確定ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型。
其中，所述待測生物樣品為患者外周血。
優(yōu)選地，所述PCR擴增的反應(yīng)體系為25μl，包括：DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，0.25mmol/L dNTPs 2μl，10μmol/L上下游引物各1μl，5U/μl ExTaq? 0.15μl，余量ddH2O。
優(yōu)選地，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為：95℃ 5min；94℃ 30s，66℃/80℃ 30s，75℃ 15s，35個循環(huán)；75℃ 5min；4℃保存。
另外，上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR在制備通過PCR擴增生物樣品檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的試劑盒中的應(yīng)用，以及包含上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR 的ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點檢測試劑盒，也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
優(yōu)選地，所述試劑盒還含有dNTPs、ExTaq聚合酶。
優(yōu)選地，所述試劑盒還含有0.25mmol/L的dNTPs、5U/μl的ExTaq聚合酶。
本發(fā)明上述引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR以及用PCR方法檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的方法和試劑盒，可以用于檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型。
本發(fā)明的引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR以及用PCR方法可以檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性，ITPA 94C>T基因多態(tài)性與巰嘌呤類藥物不良反應(yīng)有關(guān)，可根據(jù)擴增電泳結(jié)果確定ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型，對巰基嘌呤類藥物的療效和副作用進行預(yù)測，預(yù)測患者使用巰基嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導(dǎo)臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療。
本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明公開了一種用PCR方法檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR，其序列分別如SEQ ID NO.1～4所示。利用本發(fā)明的引物對及其PCR方法，可以根據(jù)擴增電泳結(jié)果確定ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型，對巰基嘌呤類藥物的療效和副作用進行預(yù)測，在基因型分析的基礎(chǔ)上可以預(yù)測患者使用巰基嘌呤類藥物的有效性和安全性，指導(dǎo)臨床用藥，使患者能夠進行個體化醫(yī)療，克服臨床選擇巰基嘌呤類藥物的盲目性，避免用藥不良反應(yīng)。
而且，本發(fā)明的方法簡單易行，應(yīng)用前景廣泛。
附圖說明
圖1為基因分型結(jié)果的基因型電泳圖譜（PCR-RFLP）；HW為野生型純合子，HM為突變型純合子，HT為突變雜合子。
具體實施方式
以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
除非特別說明，本發(fā)明所用試劑和材料均為市購。
實施例1 檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性的引物及其PCR方法
1、實驗所需試劑及其配置
（1）DNA提取試劑
6mol/L NaI（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上海），氯仿，異丙醇，異戊醇，乙醇均為市售分析純產(chǎn)品。
（2）PCR擴增試劑
Ex Taq?酶（Takara公司，日本），合成引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上海）。
（3）瓊脂糖凝膠電泳試劑
普通瓊脂糖（Biowest 公司，西班牙），低熔點瓊脂糖（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，上海），5×TBE電泳液儲存液（0.45 mol/L Tris堿，0.45 mol/L硼酸，0.01 mol/L EDTA，調(diào)pH至8.0；Tris、硼酸、EDTA購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）稀釋10倍使用，GoldviewTM Nucleic Acid stain（北京賽百盛生物工程公司，北京）。
（4）DL1000、DL2000 DNA Ladder Marker（Takara公司，日本）。
（5）0.5 M EDTA溶液
稱取186.1 g EDTA·2H2O于1 L燒杯中，加800 ml去離子水，充分攪拌，加NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌至完全溶解，加去離子水定容至1 L，高溫高壓滅菌。
（6）5×TBE溶液
稱取54 g Tris，27.5 g硼酸，置于燒杯，加適量雙蒸水攪拌溶解；加入0.5 M EDTA溶液20 ml，加雙蒸水定容至1 L，制成5×TBE儲備液。儲備液將稀釋10倍為0.5×TBE溶液使用。
（7）6 M NaI溶液
稱取45 g NaI置于燒杯中，加雙蒸水攪拌溶解，定容至50 ml，避光保存。
2、實驗所需主要儀器
ABI GeneAmp? PCR System 2700 ( Applied Biosystems公司，美國)
Eppendorf MasterCycler? epGradient PCR儀（Eppendorf公司，德國）
DYY－11131C 型水平電泳槽（北京六一儀器廠，北京）
DYY－6C 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠，北京）
EC3凝膠成像系統(tǒng)（UVP 公司，美國）
Eppendorf 5417R低溫離心機（Eppendorf公司，德國）
富華SHA-C型恒溫振蕩水浴器（常州菲普實驗儀器廠，江蘇）
DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科技有限公司，上海）
超低溫冰箱（-80℃）（Thermo公司，德國）
3、實驗方法
（1）外周血DNA提取
1）取EDTA抗凝全血100 μl，加無菌雙蒸水200 μl混勻；
2）加入6 mol/L碘化鈉200 μl，混勻；
3）加入氯仿/異戊醇（24:1，v/v）400 μl，反復(fù)混勻；然后12000 rpm離心10 min，小心吸出上清液置另一離心管；
4）向上清液加入異丙醇300 μl混勻，室溫靜置3 min，然后于12000 rpm離心10 min，棄上清；
5）加入70%乙醇500 μl，12000 rpm離心3 min，倒掉乙醇；
6）重復(fù)步驟（5）一次，倒置片刻；
7）待管壁晾干后，加入TE緩沖液40 μl溶解DNA，用吸管吹打使DNA充分溶解。
（2）DNA濃度測定及純化
取樣品20 μl，加超純水至600 μl，充分混勻，用紫外分光光度計測定波長分別為260 nm、280 nm、320 nm時的OD值，計算DNA的濃度和純度。
DNA濃度 (μg/ml)=(OD260-OD320)×50μg/ml×稀釋倍數(shù)(30)
DNA純度=(OD260-OD320)/(OD280-OD320)
DNA純度為1.8時表示純度好；<1.6時表示蛋白含量太高，應(yīng)用氯仿/異戊醇抽提純化；>1.9時表示有RNA污染，可用RNA酶進行處理。
（3）PCR反應(yīng)
1）引物設(shè)計
設(shè)計ITPA 94C>T的PCR擴增引物，如表1所示。所有引物序列均經(jīng)NCBI Blast驗證其合理性與特異性。
表1 引物序列
2）PCR反應(yīng)體系
PCR反應(yīng)體系為25μl，包括DNA模板3μl，10×Taq buffer 2.5μl，dNTPs 2μl (0.25mmol/L)，上、下游引物各1μl(10μmol/L)，ExTaq? 0.15μl (5U/μl)，用ddH2O補充總體積至25μl。
3）PCR反應(yīng)條件如表2所示
表2 PCR 反應(yīng)條件
4、PCR產(chǎn)物的檢測：瓊脂糖凝膠電泳
制膠：稱取適量瓊脂糖，加入0.5×TBE溶液配制成1%的混懸液，在微波爐中加熱至完全溶解，加入終濃度為0.05 μl/ml的Goldview，充分混勻后倒入水平放置的膠模中，凝膠厚度約為5 mm，插上梳子，靜止20~30 min。
上樣：將制好的凝膠放入電泳槽，電泳緩沖液（同批次0.5×TBE）液面高出凝膠表面1~2 mm，取5 μl擴增產(chǎn)物與1 μl 6×Loading buffer混合后，依次加入加樣孔中；190 V電泳15 min。
5、結(jié)果
紫外燈下觀察電泳結(jié)果，并于凝膠成像系統(tǒng)上自動成像，結(jié)果如附圖1所示，利用本發(fā)明的引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR及PCR方法，可以檢測鑒定ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型。
從臨床觀察來看，突變純合子對巰基嘌呤類藥物的不良反應(yīng)發(fā)生率明顯高于突變雜合子，而突變純合子和突變雜合子這兩者的藥物不良反應(yīng)發(fā)生率均強于野生型。
因此，可以利用本發(fā)明的引物對ITPAwtF/ITPAwtR和ITPAmtF/ITPAmtR及PCR方法檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性位點的基因型，從而判斷檢測對象對巰基嘌呤類藥物的不良反應(yīng)情況，進而指導(dǎo)個性化用藥。本發(fā)明提供了一種簡單易行且具有很強臨床應(yīng)用價值的PCR方法及引物。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大學(xué)
<120> 一種檢測ITPA 94C>T基因多態(tài)性的引物及其PCR方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物ITPAwtF
<400> 1
cgttcagatt ctaggagata agttca 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物ITPAwtR
<400> 2
cgttcagatt ctaggagata agttcc 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物ITPAmtF
<400> 3
ttccacgaac atgtgtgaat gcagc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物ITPAmtR
<400> 4
gcttagcaca agcagagacc tgacg 25