本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體的是涉及一種胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒。
背景技術(shù)：
：胃癌(gastriccancer)是源自胃黏膜上皮的惡性腫瘤，占全部惡性腫瘤的第三位，占消化道惡性腫瘤的首位，是世界上最常見和致死的惡性腫瘤之一，是繼肺癌之后世界范圍內(nèi)癌癥死亡的第二常見的原因。目前，要提高胃癌的療效，降低死亡率，關(guān)鍵是要做好以下三方面工作：早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療。但是由于絕大多數(shù)胃癌患者缺乏特異性的臨床癥狀以及臨床診斷方法的限制，患者在確診時通常已處于疾病晚期，錯失了最佳的治療時機，手術(shù)率不足10％，且術(shù)后病人的生存期也較短。資料顯示早期診斷治療患者的5年存活率為90％，而診斷為胃癌晚期的患者5年存活率僅為10％。因此，對胃癌的早期診斷和術(shù)后監(jiān)測對指導胃癌患者臨床治療及提高存活率具有十分重要的意義。循環(huán)腫瘤細胞(circulatingtumorcells,CTCs)是因自發(fā)或診療操作從實體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，進入外周血中的各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱，目前認為CTCs可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段。腫瘤細胞在進入外周血循環(huán)的過程中可能發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(ETM，Epithelial-mesenchymalTransition)，EMT過程中，除了細胞形態(tài)和移動性發(fā)生改變外，細胞基因表達譜特別是上皮、間質(zhì)分子標志物及其轉(zhuǎn)錄因子的表達也發(fā)生改變，發(fā)生EMT的腫瘤細胞間黏附改變，遷移和侵襲能力增強。根據(jù)CTCs抗原標志物的差異，目前CTC主要可分為上皮標志物陽性表型(簡稱上皮細胞型)、間質(zhì)標志物陽性表型(簡稱間質(zhì)細胞型)和上皮與間質(zhì)混合表型(簡稱上皮-間質(zhì)細胞型)等。不同類型CTC具有不同的遷移和侵襲能力。因此，對胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞進行鑒定和分型對胃癌的早期診斷、術(shù)后監(jiān)測以及預后等具有重要意義。雖然CTC檢測在其他癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等中得到較廣泛的應用，但現(xiàn)今國內(nèi)外均沒有穩(wěn)定的用于胃癌患者CTCs鑒定和分型的產(chǎn)品。目前各類癌癥患者CTCs的鑒定和分型主要依賴于檢測通用的CTCs上皮和間質(zhì)型標志物分子是否表達，但由于外周血中可能存在一定數(shù)量的非腫瘤性上皮細胞，且采血可能造成正常上皮細胞污染血樣，加上一些上皮和間質(zhì)型標志物在不同癌癥類型中表達存在差異，從而會導致一些假陽性和假陰性 的檢測結(jié)果。因此，急需一種能提高現(xiàn)有CTCs檢測和分型準確度的檢測方法，實現(xiàn)胃癌患者CTCs的精確鑒定與分型。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高、準確度高的胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒，包括針對每種標志基因mRNA的捕獲探針、擴增探針和標記探針，所述標志基因mRNA包括有三類：選自CEA、HER2中的至少一種的胃癌細胞標志基因mRNA，選自KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20中的至少一種的上皮細胞標志基因mRNA，選自AKT2、HIF-1A、TWIST1、VIMENTIN中的至少一種的間質(zhì)細胞標志基因mRNA；其中，所述捕獲探針連接標志基因mRNA與擴增探針，每條捕獲探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：與待檢測的標志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、P2序列，所述P2序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與P1、P4和標志基因mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列，針對同一類別的標志基因的捕獲探針的P2序列相同；每條擴增探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：能與相應捕獲探針的P2序列互補配對的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；每條標記探針具有與相應擴增探針P4序列互補配對的P5序列，且末端修飾有熒光基團，不同標志基因的熒光基團互不相同。在其中一個實施例中，所述標志基因mRNA還包括有針對白細胞標志基因的mRNA的一類，所述白細胞標志基因為CD45，使用白細胞標志基因，有助于進一步區(qū)分白細胞和腫瘤細胞，排除白細胞對檢測結(jié)果的干擾。在其中一個實施例中，所述胃癌細胞標志基因mRNA捕獲探針中：針對CEA基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2條或2條以上，針對HER2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2條或2條以上；針對胃癌細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.131；所述胃癌細胞標志基因mRNA擴增探針中，P3序列為SEQIDNO.135，P4序列為SEQIDNO.139。在其中一個實施例中，所述上皮細胞標志基因mRNA捕獲探針中：針對KRT7基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2條或2條以上，針對KRT8基因的 特異性序列P1選自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2條或2條以上，針對KRT17基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2條或2條以上，針對KRT18基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2條或2條以上，針對KRT19基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2條或2條以上，針對KRT20基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2條或2條以上；針對上皮細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.132；所述上皮細胞標志基因mRNA擴增探針中，P3序列為SEQIDNO.136，P4序列為SEQIDNO.140。在其中一個實施例中，所述間質(zhì)細胞標志基因mRNA捕獲探針中：針對AKT2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2條或2條以上，針對HIF-1A基因特異性序列P1選自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2條或2條以上，針對TWIST1基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2條或2條以上，針對VIMENTIN基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2條或2條以上；針對間質(zhì)細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.133；所述間質(zhì)細胞標志基因mRNA擴增探針中，P3序列為SEQIDNO.137，P4序列為SEQIDNO.141。在其中一個實施例中，還包括有白細胞標志基因的mRNA的檢測探針，所述白細胞標志基因mRNA捕獲探針中：針對CD45基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2條或2條以上；針對白細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.134；所述白細胞標志基因mRNA擴增探針中，P3序列為SEQIDNO.138，P4序列為SEQIDNO.142。在其中一個實施例中，所述間隔臂序列為5－10個T。在其中一個實施例中，所述熒光基團選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，且針對不同細胞種類標志基因的熒光基團互不相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明在目前通用CTCs上皮細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因的基礎上增加了胃癌細胞標志基因的檢測，避免了血液中非腫瘤上皮細胞及采樣過程引入正常上皮細胞等因素造成的假陽性結(jié)果，確保檢測到上皮細胞標志基因和/或間質(zhì)細胞標志基因的細胞為胃癌循環(huán)腫瘤細胞，進一步提高了檢測結(jié)果的準確度和可信度。(2)本發(fā)明所選擇的胃癌細胞標志基因、上皮細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因，是發(fā)明人經(jīng)過大量試驗進行綜合評估、統(tǒng)計分析篩選得出的在胃癌循環(huán)腫瘤細胞上特異表達 的基因。本發(fā)明標志基因的選取，除了能實現(xiàn)單個標志基因的檢測外，更與其它標志基因一起使用，從而能夠最全面地檢測出胃癌循環(huán)腫瘤細胞，并區(qū)分其細胞類型，解決了CTCs在不同癌癥類型之間由于某些標志基因表達水平的差異以及EMT過程中丟失某些標志抗原而造成假陰性結(jié)果，進一步提高檢測的準確性。(3)本發(fā)明所述鑒定方法采用多重RNA探針，能夠同時標記多種胃癌細胞標志基因及CTCs特異性基因，并將CTCs分型為I型(上皮型)、II型(上皮-間質(zhì)混合型)及III型(間質(zhì)型)，進一步提高了檢測結(jié)果的準確性。本發(fā)明所設計的各種探針，能夠在均一的反應條件下進行雜交反應，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設計的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測方法形成一個檢測效果完好的系統(tǒng)。(4)RNA原位雜交方法本身具有熒光信號靈敏度低的缺點，但是本發(fā)明采用新型的RNA原位雜交方法，通過信號放大體系提高熒光信號強度。本發(fā)明檢測流程能夠在8h內(nèi)完成，單一拷貝的mRNA雜交探針通過信號放大系統(tǒng)，與相應的熒光探針結(jié)合，顯著提高RNA原位雜交的檢測靈敏度。(5)本發(fā)明使用的是探針的多位點特異配對、級聯(lián)放大的方式來實現(xiàn)信號的放大，而不是PCR擴增的方法，提高了檢測信號，實現(xiàn)了檢測的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。附圖說明圖1是本發(fā)明陽性胃癌CTC鑒定結(jié)果示意圖；圖2是本發(fā)明陽性胃癌CTC分型結(jié)果示意圖。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目 的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。一種胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定方法，主要包括以下步驟：(1)得到去除紅細胞后的生物體液樣本；(2)過濾，在濾膜上富集胃癌循環(huán)腫瘤細胞，通過透化處理，消化細胞，使mRNA暴露；(3)檢測胃癌細胞標志基因mRNA、和/或上皮細胞標志基因mRNA、和/或間質(zhì)細胞標志基因mRNA是否存在，所述胃癌細胞標志基因選自：CEA、HER2中的一個或一個以上，所述上皮細胞標志基因選自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20中的一個或一個以上；所述間質(zhì)細胞標志基因選自：AKT2、HIF-1A、TWIST1、VIMENTIN中的一個或一個以上。在其中一個實施例中，所述檢測胃癌標志基因mRNA、和/或上皮細胞標志基因mRNA、和/或間質(zhì)細胞標志基因mRNA是否存在，包括以下步驟：(3.1)每種標志基因的捕獲探針特異性序列P1與對應的目標mRNA序列結(jié)合；每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的標志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與對應標志基因的擴增探針的P3互補配對的P2序列；所述P2為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與P1、P4和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.2)捕獲探針的P2序列與擴增探針的P3序列特異性結(jié)合；所述擴增探針堿基序列從5’端到3’端依次為：能與捕獲探針P2互補配對的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4分別為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.3)所述擴增探針的P4序列與帶有熒光基團修飾的標記探針的P5序列特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大；不同細胞種類標志基因的熒光基團互不相同；(3.4)通過熒光檢測儀檢測。在其中一個實施例中，所述檢測胃癌標志物基因mRNA、和/或上皮細胞標志基因mRNA、和/或間質(zhì)細胞標志基因mRNA是否存在，還可以包括以下步驟：(3.1)每種標志基因的捕獲探針的特異性序列P1與對因的目標mRNA序列特異性結(jié)合；每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的標志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與對應標志基因的擴增探針的P3互補配對的P2序列；所述P2為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配，與P1、P4和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.2)捕獲探針的P2序列與帶有熒光基團標記的擴增探針的P3序列結(jié)合，從而實現(xiàn)目標mRNA信號的放大；所述擴增探針堿基序列從5’端到3’端依次為：能與捕獲探針P2互補配對的P3序列、間隔臂序列、P4序列，每條擴增探針的3’端還修飾有熒光基團，不同細胞種類標志基因的熒光基團互不相同；所述P4為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.3)通過熒光檢測儀檢測。實施例1本實施例所述的胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒，有兩種類型，具有標記探針的與不具有標記探針。其中，具有標記探針的胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒A，主要包括有：一、捕獲探針捕獲探針由三部分組成，5’端至3’依次是與對應的標志基因的mRNA互補配對的序列P1，間隔臂序列，與對應的擴增探針P3序列互補配對的P2序列，同一類別的標志基因其捕獲探針中的P2序列相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與目標mRNA間隔開來，通過在探針內(nèi)部設置適當長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應的效率以及雜交反應的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂優(yōu)選為5－10個T，本實施例優(yōu)選為5個T。每個標志基因分別設計10條捕獲探針，以提高檢測的特異性。(使用時，針對每種目標基因，選擇2條或2條以上捕獲探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好，可參考實施例8)，本實施例優(yōu)選為使用10條捕獲探針，以使特異性達到最好。針對相應的標志基因的捕獲探針見表1、不同類型的標志基因的捕獲探針的P2序列見表2。表1目標基因捕獲探針的P1序列表2標志基因捕獲探針的P2序列二、擴增探針擴增探針是連接捕獲探針與信號檢測組分之間的序列，擴增探針由三部分組成，5’端是能與捕獲探針P2互補配對的P3序列，間隔臂序列，3’端是能與標記探針互補配對的序列P4(如不運用標記探針檢測時，則P4序列的3’端修飾有熒光基團，如試劑盒B)，中間是5個寡聚核苷酸T的間隔臂序列(本發(fā)明的擴增探針間隔臂優(yōu)選為5－10個T，本實施例優(yōu)選為5個T)。標志基因的擴增探針的P3序列見表3。所述P4序列內(nèi)部不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯配，與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列，本實施例P4序列優(yōu)選的堿基組成見表4。表3目標基因的擴增探針的P3序列表4目標基因的擴增探針的P4序列三、標記探針標記探針由兩部分組成，其5’端是能與擴增探針P4序列互補結(jié)合的P5序列，3’端帶有熒光基團標記，通過與擴增探針P4序列的結(jié)合實現(xiàn)目標mRNA信號的級聯(lián)放大。(當檢測體系中使用標記探針時，擴增探針的P4序列3’端不帶有熒光基團標記，而由標記探針的3’端帶有熒光基團標記)標記探針的熒光基團可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，標記探針的FL1、FL2、FL3和FL4選擇的熒光基團互不相同，即所選擇的熒光基團的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同，以便于區(qū)分不同類型的標志基因。本實施例標記探針的熒光基團標記優(yōu)選如表5所示。表5標記探針本實施例所述不具有標記探針的胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒B，主要包括有：一、捕獲探針：與上述具有標記探針的胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒中的捕獲探針相同。二、擴增探針：與上述具有標記探針的胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒中的捕獲探針的序列相同，但P4序列的3’端修飾有熒光基團。所述P4序列的3’端修飾有熒光基團，具體為：針對胃癌細胞標志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團為FL1，上皮細胞標志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團為FL2，間質(zhì)細胞標志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團為FL3，白細胞標志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團為FL4，所述熒光基團選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，其中FL1、FL2、FL3和FL4對應的熒光基團互不相同，且所對應的熒光基團的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同，以便于區(qū)分不同類型的標志基因。標志基因擴增探針的P4的3’端的熒光基團標記優(yōu)選如表6所示。表6標志基因的染料標記實施例2運用實施例1中的試劑盒A對胃癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞進行檢測所述各種溶液的配方如下：本實施例中的探針混合液、擴增混合液、顯色混合液均使用實施例1相應基因列表中的全部探針(包括所有標志基因為CEA、HER2、KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20、AKT2、HIF-1A、TWIST1、VIMENTIN、CD45)。一、樣本預處理，將胃癌CTCs過濾至濾膜上1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清，去除紅細胞。2.加入4mlPBS和1ml固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mlPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μl4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實驗操作。三、消化細胞，暴露mRNA，使其與探針雜交1.配制相應濃度的消化酶工作液：試劑組分每個樣本用量消化酶1.25μlPBS48.75μl總體積50μl2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實驗操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標mRNA序列結(jié)合1.探針緩沖液、擴增緩沖液和顯色緩沖液使用前需40℃水浴預熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個樣本用量探針混合液8μl探針緩沖液(40℃預熱)42μl總體積50.0μl渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。五、擴增雜交，目標mRNA序列信號放大1.配制擴增工作液：渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中擴增工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。六、顯色，熒光標記目標信號1.配制顯色工作液試劑組分每個樣本用量顯色混合液2μl顯色緩沖液(40℃預熱)48μl總體積50.0μl避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實驗操作，樣本在洗滌液中浸泡時間不能超過30min。七、熒光顯微鏡觀察胃癌CTCs本發(fā)明的對照品使用DAPI作為細胞核熒光基團，其發(fā)射藍色熒光信號。1.將濾膜細胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μL含DAPI的抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過20倍物鏡計數(shù)CTC異性核數(shù)量。3.根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4.然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個異性核位置，滴油，用油鏡觀察實驗結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5.重復操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如下：表7熒光基團的激發(fā)波長和發(fā)射波長八、檢測結(jié)果判斷及分析1.陽性胃癌CTC鑒定標準在濾膜上，富集有少量的胃癌循環(huán)腫瘤細胞以及殘留的白細胞，胃癌循環(huán)腫瘤細胞陽性的判定標準為(參見圖1)：1)具有胃癌細胞標識物和循環(huán)腫瘤細胞特異性標識物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在Cy5通道和/或Cy3通道和/或AlexaFluor488通道下能夠顯示紫色熒光信號點和/或紅色熒光信號點和/或綠色熒光信號點。2)不具有白細胞特異性標識物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在AlexaFluor750通道下不顯示熒光信號點。3)細胞核DAPI染色陽性。4)胃癌循環(huán)腫瘤細胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細胞大小與濾膜孔大小相近。2.陽性胃癌CTCs分型標準：本試劑盒采用多重RNA探針，分別針對多種胃癌細胞標志基因和CTCs特異性基因，通過不同顏色熒光信號，可進一步將胃癌CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)CTCs攜帶Cy5熒光基團(顯示為紫色熒光信號點)和Cy3熒光基團(顯示為紅色熒光信號點)，Ⅲ型(間質(zhì)型)CTCs攜帶Cy5熒光基團(顯示為紫色熒光信號點)和AlexaFluor488熒光基團(顯示為綠色熒光信號點)，同時表達Ⅰ型和Ⅲ型特異性基因的CTCs為Ⅱ型(上皮-間質(zhì)混合型，同時顯示紫色熒光信號點、紅色熒光及綠色熒光信號點)。參見圖2。胃癌CTCs分型標準如下：表8陽性胃癌CTCs分型標準3.使用上述檢測方法，對20例胃癌患者外周血樣本進行檢測和觀察，具體結(jié)果為(表中數(shù)據(jù)為CTC數(shù)目)：表9樣本檢測結(jié)果編號上皮型上皮-間質(zhì)混合型間質(zhì)型CTC總量12531020112133308114014163051178266210370139228171321931562310058131103710123517251311523391401721915112518160651117312213618052719131418202131833實施例3運用實施例1中的試劑盒A對胃癌細胞株進行檢測一、細胞株的選擇本發(fā)明試劑盒胃癌細胞標志基因選自：CEA、HER2中的一個或一個以上；上皮細胞標志基因選自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20中的一個或一個以上；間質(zhì)細胞標志基因選自：AKT2、HIF-1A、TWIST1、VIMENTIN中的一個或一個以上；白細胞標志基因為CD45。本發(fā)明選用的胃癌細胞標志基因、上皮細胞標志基因、間質(zhì)細胞標志基因和白細胞標志基因中各種標志基因，是發(fā)明人經(jīng)過大量實驗和統(tǒng)計分析篩選得出的在胃癌CTCs上特異表達的基因，對胃癌細胞的檢測具有很好的特異性和準確性。本實施例選用上皮-間質(zhì)混合型胃癌細胞株KatoIII和MGC80-3進行實驗，陰性對照細胞株選用CCRF-HSB-2淋巴母細胞，本領域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可購買得到。取約1000個KatoIII細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號21-25；取約1000個MGC80-3細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號26-30；取約1000個CCRF-HSB-2淋巴母細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號31-35。二、樣本檢測運用實施例1中的試劑盒A的全部探針(包括所有標志基因為CEA、HER2、KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20、AKT2、HIF-1A、TWIST1、VIMENTIN)，白細胞標志基因CD45，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本21-35進行檢測，讀取每個樣本中有DAPI藍色熒光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標志物的熒光信號強度，分別讀取這50個細胞的相應顏色的熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體檢測結(jié)果如下：表10樣本檢測結(jié)果通過比較樣本中三種細胞株的檢測結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒能實現(xiàn)胃癌細胞相關(guān)標志基因的檢測，對樣本中胃癌細胞株KatoIII和MGC80-3、淋巴母細胞CCRF-HSB-2的檢出率均為100％，其中，胃癌標志基因僅在胃癌細胞株中檢測到mRNA表達，而在淋巴母細胞中沒有表達，由此可見，本發(fā)明試劑盒能夠檢出胃癌細胞標志基因、上皮細胞標志基因、間質(zhì)細胞標志基因和白細胞標志基因mRNA表達情況，同時，胃癌細胞標志基因的檢出具有癌種特異性，也就是說，胃癌細胞標志基因的檢出，能有效區(qū)分樣本中的胃癌細胞和白細胞，確保檢測到上皮細胞標志基因和/或間質(zhì)細胞標志基因的細胞為胃癌循環(huán)腫瘤細胞，進一步提高了檢測結(jié)果的準確度和可信度。實施例4不同細胞種類標志基因的選擇一、試劑盒制備的設計(目標檢測標志基因數(shù)量和種類的選擇)本發(fā)明試劑盒胃癌細胞標志基因選自：CEA、HER2，根據(jù)實驗組做相應的選擇，上皮細胞標志基因為：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19和KRT20，間質(zhì)細胞標志基因為：AKT2、HIF-1A、TWIST1和VIMENTIN。胃癌細胞標志基因的選擇參見實施組1-2，分別選取一種和兩種的標志基因，對比其檢測效果，而上皮細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因使用全部的目標基因以及白細胞標志基因的全部目標基因，具體設計如表11所示。本實施例每組相應標志基因的所述捕獲探針、擴增探針與標記探針的組成和數(shù)量、檢測方法等如實施例1試劑盒A和實施例2所述。表11胃癌細胞標志基因基因的選擇二、樣本檢測本實施例選用上皮-間質(zhì)混合型胃癌細胞株KatoIII、MGC80-3和HGC-27進行實驗，本領域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可購買得到。取約1000個KatoIII細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號36-40；取約1000個MGC80-3細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號41-45；取約1000個HGC-27細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號46-50。采用表11標志基因制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本36-50進行檢測，讀取每個樣本中有DAPI藍色熒光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標志物的熒光信號強度，分別讀取這50個胃癌細胞的相應顏色的熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表12中數(shù)據(jù)為細胞數(shù)目，表13中數(shù)據(jù)為平均熒光點數(shù))：表12使用不同數(shù)量胃癌細胞標志基因檢測效果的比較表13使用不同數(shù)量胃癌細胞標志基因平均熒光信號點數(shù)檢測效果的比較對比實驗組1-2的實驗結(jié)果可知，當胃癌細胞標志基因分別選取一種及兩種，上皮細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因使用全部基因時，其檢測結(jié)果一致，說明本試劑盒選取的胃癌細胞標志基因具有很好的靈敏度和特異性，選用其中任何一種即可完成檢測，將樣本中的胃癌細胞全部檢出。其中，紫色熒光信號點從實驗組1到實驗組2隨著胃癌細胞標志基因數(shù)量的增加而逐漸增加，檢測效果更優(yōu)，同時，胃癌標志基因的增加并不影響上皮標志基因和間質(zhì)標志基因的檢測結(jié)果，實驗組1和2間上皮和間質(zhì)細胞標志基因檢測到的細胞數(shù)目和相應的熒光點數(shù)沒有變化。由此可知，本發(fā)明試劑盒所設計的各種類型探針之間基本不存在非特異性結(jié)合，特異性好。上皮細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因基因數(shù)量的選擇實驗結(jié)果與胃癌細胞標志基因一致。其它針對使用不同數(shù)量和種類的胃癌細胞標志基因、上皮細胞標志基因、間質(zhì)細胞標志基因的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例5試劑盒目標檢測標志基因的選擇一、試劑盒制備的設計(目標檢測標志基因數(shù)量和種類的選擇)本發(fā)明試劑盒胃癌細胞標志基因選自：CEA、HER2，上皮細胞標志基因選自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19、KRT20；間質(zhì)細胞標志基因選自：AKT2、HIF-1A、TWIST1、VIMENTIN。設計實驗組3-6，分別選取三種、六種、八種及十二種的標志基因基因，對比其檢測效果，白細胞使用標志基因CD45，具體設計如表14所示。本實施例每組相應的所述捕獲探針、擴增探針與標記探針的組成和數(shù)量、檢測方法等如實施例1試劑盒A和實施例2所述。表14試劑盒標志基因基因的選擇二、樣本檢測本實施例選用上皮-間質(zhì)混合型胃癌細胞株KatoIII、MGC80-3和HGC-27進行實驗，本領域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可購買得到。取約1000個KatoIII細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號51-55；取約1000個MGC80-3細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號56-60；取約1000個HGC-27細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號61-65。采用上述設計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本51-65進行檢測，讀取每個樣本中有DAPI藍色熒光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標志物的熒光信號強度，分別讀取這50個胃癌細胞的相應顏色的熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表15中數(shù)據(jù)為細胞數(shù)目，表16中數(shù)據(jù)為平均熒光點數(shù))：表15試劑盒使用不同數(shù)量標志基因檢測效果的比較表16試劑盒使用不同數(shù)量標志基因平均熒光信號點數(shù)檢測效果的比較對比實驗組3-6的檢測結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒選用3種標志基因即可完成檢測，將樣本中的胃癌細胞全部檢出，說明本發(fā)明試劑盒選用的標志基因具有很好的靈敏度和特異性。其中，細胞上3種細胞種類標志基因?qū)臒晒庑盘桙c從實驗組3到實驗組6隨著標志基因數(shù)量的增加而逐漸增加，檢測效果更優(yōu)，其中，選用全部的標記基因時，檢測信號最強最穩(wěn)定，效果最優(yōu)。其它針對使用不同數(shù)量和種類的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例6不同間隔臂的試劑盒對胃癌循環(huán)腫瘤細胞mRNA原位雜交的檢測一、試劑盒制備的設計(間隔臂的選擇)以胃癌細胞標志基因(共2個基因)為例，分別選用不同的間隔臂，具體設計如表17所示。每組的捕獲探針、擴增探針與標記探針的堿基組成以及所用數(shù)量全部與實施例1試劑盒A相同、不同之處僅在于間隔臂不同，檢測方法如實施例2所述。對應的捕獲探針、擴增探針的間隔臂相同。表17間隔臂及其長度間隔臂種類長度實驗組poly(dT)57poly(dA)88(CH2)n159poly(TTG)310二、樣本檢測本實施例選用上皮-間質(zhì)混合型胃癌細胞株KatoIII、MGC80-3和HGC-27進行實驗，本領域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可購買得到。取約1000個KatoIII細胞(通過細胞計 數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號66-70；取約1000個MGC80-3細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號71-75；取約1000個HGC-27細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號76-80。采用上述設計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本66-80進行檢測，讀取每個樣本中有DAPI藍色熒光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動掃描來選取，具體檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為細胞數(shù)目)：表18胃癌細胞標志基因檢測探針使用不同間隔臂的實驗結(jié)果比較經(jīng)過對比4個實驗組的檢測結(jié)果可知，4組實驗設計的檢測效果沒有差異，因此，這4種間隔臂的設計是等效的。上皮細胞標志基因、間質(zhì)細胞標志基因以及白細胞標志基因檢測探針使用不同的間隔壁檢測結(jié)果與胃癌細胞標志基因一致，具體數(shù)據(jù)省略。其它針對捕獲探針、擴增探針和標記探針內(nèi)部不同的間隔序列的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實施例7：標記探針的運用一、試劑盒制備的設計(信號檢測組分)本發(fā)明試劑盒信號檢測組分有兩種選擇，1)擴增探針P4序列的3’端修飾有熒光基團；2)擴增探針3’端P4序列與標記探針的P5序列通過堿基互補配對結(jié)合，同時標記探針的3’端帶有熒光基團。這兩種信號檢測組分均能實現(xiàn)信號放大，檢測到正常信號。其中，使用熒光基團修飾的標記探針，檢測信號更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以所述試劑盒的檢測上皮細胞標志基因的兩種信號檢測組分為例，具體設計如表19所示。即所述試劑盒的組成為：實驗組11：相應標志基因的捕獲探針和擴增探針組成和數(shù)量同實施例1試劑盒A，但擴增探針3’端修飾有熒光基團Cy3；沒有標記探針；實驗組12：相應標志基因的捕獲探針、擴增探針和標記探針組成和數(shù)量同實施例1試劑盒A，擴增探針不具有熒光基團，但配置有標記探針，標記探針的P5序列3’端修飾有熒光基團Cy3。表19信號檢測組分二、樣本檢測本實施例選用上皮-間質(zhì)混合型胃癌細胞株KatoIII、MGC80-3和HGC-27進行實驗，本領域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可購買得到。取約1000個KatoIII細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號81-85；取約1000個MGC80-3細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號86-90；取約1000個HGC-27細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號91-95。采用上述設計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本81-95進行檢測，讀取每個樣本中有DAPI藍色熒光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標志物的熒光信號強度，分別讀取這50個胃癌細胞的相應顏色的熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表20中數(shù)據(jù)為細胞數(shù)目，表21中數(shù)據(jù)為平均熒光點數(shù))：表20上皮細胞標志基因使用不同信號檢測探針的檢測結(jié)果比較表21上皮細胞標志基因使用不同信號檢測探針平均熒光點數(shù)檢測結(jié)果比較將兩組設計的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，證明兩組設計對樣本中細胞數(shù)目的檢測結(jié)果沒有差異，因此，這兩種信號檢測組分對信號的檢測是等效的。其中，使用熒光基團修飾的標記探針(即實驗組12)，其檢測到上皮細胞標志基因熒光點數(shù)更多，信號更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。其他針對胃癌細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因標記探針的運用檢測結(jié)果與上皮細胞標志基因檢測結(jié)果一致，具體數(shù)據(jù)省略。實施例8標志基因的捕獲探針的數(shù)量選擇一、試劑盒制備的設計(捕獲探針數(shù)量的選擇)本發(fā)明胃癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒，針對不同細胞種類的每個標志基因分別設計了10條捕獲探針，且同一細胞種類的標志基因的捕獲探針中的P2序列相同。在實際使用時，可以針對每種標志基因，選擇對應的至少2條捕獲探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都能達到需求。為考察捕獲探針數(shù)量的選擇對試劑盒檢測效果的影響，以上皮細胞標志基因KRT7的捕獲探針數(shù)量選擇為例，參見實驗組13-15，分別選取1條、2條及10條的捕獲探針，對比其檢測效果。在該對比實驗中，上皮細胞標志基因僅使用KRT7(參見表22)，而胃癌細胞標志基因和間質(zhì)細胞標志基因使用如實施例1試劑盒A所列出的全部的基因和探針以及白細胞標志基因CD45及其對應的檢測探針。表22上皮細胞標志基因KRT7的捕獲探針的選擇二、樣本檢測本實施例選用上皮-間質(zhì)混合型胃癌細胞株KatoIII、MGC80-3和HGC-27進行實驗，本領域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可購買得到。取約1000個KatoIII細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號96-100；取約1000個MGC80-3細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號101-105；取約1000個HGC-27細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號106-110。采用上述設計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對樣本96-110進行檢測，讀取每個樣本中有DAPI藍色熒光信號的50個細胞，其中，樣本中的細胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動掃描來選取，針對目標檢測標志物的熒光信號強度，分別讀取這50個胃癌細胞的相應顏色的熒光點數(shù)量，并計算平均點數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表23中數(shù)據(jù)為細胞數(shù)目，表24中數(shù)據(jù)為平均熒光點數(shù))：表23上皮細胞標志基因KRT7使用不同數(shù)量捕獲探針的檢測結(jié)果比較表24上皮細胞標志基因KRT7使用不同數(shù)量捕獲探針平均熒光點數(shù)檢測結(jié)果比較通過三組實驗對比可知，當僅選用上皮細胞標志基因KRT7，使用1條、2條和10條的捕獲探針均可完成檢測，當捕獲探針使用2條或以上時，其特異性和穩(wěn)定性都很好。其中，當使用全部10條的捕獲探針時，上皮基因檢測到的熒光信號點數(shù)更多，信號更強更穩(wěn)定，檢測效果最佳。其它針對胃癌細胞標志基因、上皮細胞標志基因、間質(zhì)細胞標志基因和白細胞標志基因的使用不同數(shù)量捕獲探針的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁1 2 3