本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒。
背景技術(shù)：
：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC，CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各類(lèi)腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱(chēng)，因自發(fā)或診療操作從實(shí)體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落，大部分CTC在進(jìn)入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，少數(shù)能夠逃逸并錨著發(fā)展成為轉(zhuǎn)移灶，增加惡性腫瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)研究表明，腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入外周血循環(huán)的過(guò)程中可能發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(ETM，Epithelial-mesenchymalTransition)，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。有研究者應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)轉(zhuǎn)移性NSCLC患者CTCs間質(zhì)標(biāo)志物vimentin及上皮標(biāo)志物KeratinmRNA的表達(dá)情況，結(jié)果在來(lái)自于檢測(cè)的幾乎所有CTCs中都可以觀察到共同強(qiáng)表達(dá)這2個(gè)指標(biāo)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)只表達(dá)keratinmRNA的CTCs，但在3例患者中檢測(cè)到很少幾個(gè)只表達(dá)vimentinmRNA的CTCs。此研究首次證實(shí)了具有上皮/間質(zhì)混合性表型CTCs的存在。而NSCLC原發(fā)性腫瘤的表型則是keratinmRNA陽(yáng)性、vimentinmRNA陰性。此外，其他研究者應(yīng)用AdnaTest方法檢測(cè)乳腺癌患者CTCs中3種EMT標(biāo)志物mRNA(TWIST1、Akt2、PI3Kα)，結(jié)果29％患者至少一種陽(yáng)性。有學(xué)者分析乳腺癌患者CTCs單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄譜后發(fā)現(xiàn)，盡管CTCs之間存在基因表達(dá)差異，但是普遍高表達(dá)EMT相關(guān)分子TGF-β1、vimentin和CXCR4。另外一些實(shí)驗(yàn)也證實(shí)腫瘤患者CTCs高頻出現(xiàn)共表達(dá)上皮標(biāo)志物(EpCAM、cytokeratins、E-cadherin)、間質(zhì)標(biāo)志物(vimentin、N-cadherin、O-cadherin)和干細(xì)胞標(biāo)志物(CD133)的現(xiàn)象。在另一項(xiàng)研究中，研究者檢測(cè)了乳腺癌CTCs中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA(TWIST1、SNAIL1、SLUG、ZEB1、FOXC2)的表達(dá)情況，并分析了接受或未接受新輔助化療對(duì)CTCs表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄因子的可能影響，發(fā)現(xiàn)新輔助化療并不能清除這些發(fā)生了EMT的CTCs。推測(cè)EMT很可能通過(guò)賦予CTCs干細(xì)胞特性使CTCs耐受化療。因此，檢測(cè)CTCs亞型對(duì)于指導(dǎo)分子靶向藥物的研發(fā)及臨床個(gè)體化治療具有重要意義。目前，多數(shù)CTCs檢測(cè)方法都是以腫瘤細(xì)胞表面的上皮細(xì)胞標(biāo)志物為靶點(diǎn)，如上皮細(xì)胞黏附分子(epithelialcelladhesionmolecule，EPCAM)，用相應(yīng)的抗體捕獲CTCs，以細(xì)胞表達(dá)CKs作為主要診斷依據(jù)，這類(lèi)方法涉及的EPCAM和CKs都具有上皮細(xì)胞特異性。其中，代表性檢測(cè)方法是目前唯一通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)行臨床應(yīng)用的CellSearch系統(tǒng)。由于外周血 中可能存在一定數(shù)量的非腫瘤性上皮細(xì)胞，以及采血可能造成正常上皮細(xì)胞污染血樣，加上一些CTCs由于發(fā)生EMT丟失了上皮抗原而無(wú)法被檢測(cè)到，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性和假陰性的檢測(cè)結(jié)果，此外，免疫磁性分選(MACS)技術(shù)聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法也是常用的CTC分離與鑒定的技術(shù)，但是RT-PCR過(guò)程對(duì)環(huán)境和操作的要求高，且mRNA容易降解，無(wú)法進(jìn)行CTC細(xì)胞分型等缺點(diǎn)，因此，急需一種能夠準(zhǔn)確檢測(cè)CTCs的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)CTCs的的鑒定與精確分型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒，包括針對(duì)每種標(biāo)志基因mRNA的捕獲探針、擴(kuò)增探針和標(biāo)記探針，所述標(biāo)志基因mRNA包括有如下兩類(lèi)：選自EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的至少兩種的上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA，選自VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的至少兩種的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因；其中，所述捕獲探針連接標(biāo)志基因mRNA與擴(kuò)增探針，每條捕獲探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：與待檢測(cè)的標(biāo)志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、P2序列，所述P2序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P4和標(biāo)志基因mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列，針對(duì)同一類(lèi)別的標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列相同；每條擴(kuò)增探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：能與相應(yīng)捕獲探針的P2序列互補(bǔ)配對(duì)的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；每條標(biāo)記探針具有與相應(yīng)擴(kuò)增探針P4序列互補(bǔ)配對(duì)的P5序列，且末端修飾有熒光基團(tuán)，不同細(xì)胞種類(lèi)標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)志基因mRNA還包括有白細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA的一類(lèi)，所述白細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)镃D45。使用白細(xì)胞標(biāo)志mRNA，有助于進(jìn)一步區(qū)分白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，排除白細(xì)胞對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針中：針對(duì)EPCAM基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2條或2條以上，針對(duì)E-cadherin基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2條或2條以上，針對(duì)CEA基因的特異 性序列P1選自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2條或2條以上，針對(duì)KRT5基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2條或2條以上，針對(duì)KRT7基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2條或2條以上，針對(duì)KRT17基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2條或2條以上，針對(duì)KRT20基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2條或2條以上；針對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.181；所述上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.184，P4序列為SEQIDNO.187。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針中：針對(duì)VIMENTIN基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2條或2條以上，針對(duì)N-cadherin基因特異性序列P1選自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2條或2條以上，針對(duì)TWIST1基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2條或2條以上，針對(duì)AKT2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2條或2條以上，針對(duì)ZEB2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2條或2條以上，針對(duì)ZEB1基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2條或2條以上，針對(duì)FOXC1基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.131～SEQIDNO.140中的2條或2條以上，針對(duì)FOXC2基因特異性序列P1選自SEQIDNO.141～SEQIDNO.150中的2條或2條以上，針對(duì)SNAI1基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.151～SEQIDNO.160中的2條或2條以上，針對(duì)SNAI2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.161～SEQIDNO.170中的2條或2條以上；針對(duì)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.182；所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.185，P4序列為SEQIDNO.188。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述白細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA捕獲探針中：其中針對(duì)CD45基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.171～SEQIDNO.180中的2條或2條以上；針對(duì)白細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.183；所述白細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.186，P4序列為SEQIDNO.189。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述間隔臂序列為5－10個(gè)T。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光基團(tuán)選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，且針對(duì)不同細(xì)胞種類(lèi)標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明所選擇的上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因，是發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)進(jìn)行綜合評(píng)估、統(tǒng)計(jì)分析、多種參數(shù)的優(yōu)化組合而得出的。本發(fā)明標(biāo)志基因的選取，除了能實(shí)現(xiàn)單個(gè)標(biāo)志基因的檢測(cè)外，更與其它標(biāo)志基因一起使用，從而能夠最全面地檢測(cè)出循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并區(qū)分其細(xì)胞類(lèi)型，解決了循環(huán)腫瘤細(xì)胞個(gè)體之間由于某些標(biāo)志基因表達(dá)水平的差異而造成假陰性，極大地提高檢測(cè)的靈敏度。(2)本發(fā)明所述鑒定方法采用多重RNA探針，能夠同時(shí)標(biāo)記多種CTCs特異性基因，并將其分型為I型(上皮型)、II型(上皮-間質(zhì)混合型)及III型(間質(zhì)型)，降低CTCs在進(jìn)入外周血循環(huán)的過(guò)程中因缺失部分CTCs特異性基因而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計(jì)的探針在檢測(cè)中特異性好、信噪比高。同時(shí)，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測(cè)方法形成一個(gè)檢測(cè)效果完好的系統(tǒng)。本發(fā)明使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對(duì)、級(jí)聯(lián)放大的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而不是PCR擴(kuò)增的方法，提高了檢測(cè)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的假陽(yáng)性。(3)RNA原位雜交方法本身具有熒光信號(hào)靈敏度低的缺點(diǎn)，但是本發(fā)明采用新型的RNA原位雜交方法，通過(guò)信號(hào)放大體系提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。本發(fā)明檢測(cè)流程能夠在8h內(nèi)完成，單一拷貝的mRNA雜交探針通過(guò)信號(hào)放大系統(tǒng)，與相應(yīng)的熒光探針結(jié)合，顯著提高RNA原位雜交的檢測(cè)靈敏度。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明陽(yáng)性CTC鑒定結(jié)果示意圖；圖2是本發(fā)明陽(yáng)性CTC分型結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來(lái)實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù) 人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定方法，主要包括以下步驟：(1)得到去除紅細(xì)胞后的生物體液樣本；(2)過(guò)濾，在濾膜上富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞，通過(guò)透化處理，消化細(xì)胞，使mRNA暴露；(3)檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、和/或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA是否存在，所述上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的兩個(gè)或兩個(gè)以上；所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選自：VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的兩個(gè)或兩個(gè)以上。所述檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、和/或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA是否存在，包括以下步驟：(3.1)每種標(biāo)志基因的捕獲探針特異性序列P1與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)mRNA序列結(jié)合；每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測(cè)的標(biāo)志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與對(duì)應(yīng)標(biāo)志基因的擴(kuò)增探針的P3互補(bǔ)配對(duì)的P2序列；所述P2為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P4和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.2)捕獲探針的P2序列與擴(kuò)增探針的P3序列特異性結(jié)合；所述擴(kuò)增探針堿基序列從5’端到3’端依次為：能與捕獲探針P2互補(bǔ)配對(duì)的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4分別為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.3)所述擴(kuò)增探針的P4序列與帶有熒光基團(tuán)修飾的標(biāo)記探針的P5序列特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；不同細(xì)胞種類(lèi)標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同；(3.4)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、和/或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA是否存在，包括以下步驟：(3.1)每種標(biāo)志基因的捕獲探針的特異性序列P1與對(duì)因的目標(biāo)mRNA序列特異性結(jié)合；每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測(cè)的標(biāo)志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與對(duì)應(yīng)標(biāo)志基因的擴(kuò)增探針的P3互補(bǔ)配對(duì)的P2序列；所述P2為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P4和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.2)捕獲探針的P2序列與帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的擴(kuò)增探針的P3序列結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的放大；所述擴(kuò)增探針堿基序列從5’端到3’端依次為：能與捕獲探針P2互補(bǔ)配對(duì)的P3序列、間隔臂序列、P4序列，每條擴(kuò)增探針的3’端還修飾有熒光基團(tuán)，不同細(xì)胞種類(lèi)標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同；所述P4為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.3)通過(guò)熒光檢測(cè)儀檢測(cè)。實(shí)施例1本實(shí)施例所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒，有兩種類(lèi)型，具有標(biāo)記探針的與不具有標(biāo)記探針。其中，具有標(biāo)記探針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒A，主要包括有：一、捕獲探針捕獲探針由三部分組成，5’端至3’依次是與對(duì)應(yīng)的標(biāo)志基因的mRNA互補(bǔ)配對(duì)的序列P1，間隔臂序列，與對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增探針P3序列互補(bǔ)配對(duì)的P2序列，同一類(lèi)別的標(biāo)志基因其捕獲探針中的P2序列相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與目標(biāo)mRNA間隔開(kāi)來(lái)，通過(guò)在探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長(zhǎng)度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂優(yōu)選為5－10個(gè)T，本實(shí)施例優(yōu)選為5個(gè)T。每個(gè)標(biāo)志基因分別設(shè)計(jì)10條捕獲探針，以提高檢測(cè)的特異性。(使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇2條或2條以上捕獲探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都很好，可參考實(shí)施例8)，本實(shí)施例優(yōu)選為使用10條捕獲探針，以使特異性達(dá)到最好。針對(duì)相應(yīng)的標(biāo)志基因的捕獲探針見(jiàn)表1、不同類(lèi)型的標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列見(jiàn)表2。表1目標(biāo)基因捕獲探針的P1序列表2標(biāo)志基因捕獲探針的P2序列二、擴(kuò)增探針擴(kuò)增探針是連接捕獲探針與信號(hào)檢測(cè)組分之間的序列，擴(kuò)增探針由三部分組成，5’端是能與捕獲探針P2序列互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，間隔臂序列，3’端是能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的P4序列(如不運(yùn)用標(biāo)記探針檢測(cè)時(shí)，則P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)，如試劑盒B)，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列(本發(fā)明的擴(kuò)增探針間隔臂優(yōu)選為5－10個(gè)T，本實(shí)施例優(yōu)選為5個(gè)T)。標(biāo)志基因的擴(kuò)增探針的P3序列見(jiàn)表3。所述P4序列內(nèi)部不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列，本實(shí)施例P4序列優(yōu)選的堿基組成見(jiàn)表4。表3目標(biāo)基因的擴(kuò)增探針的P3序列表4目標(biāo)基因的擴(kuò)增探針的P4序列三、標(biāo)記探針標(biāo)記探針由兩部分組成，其5’端是能與擴(kuò)增探針P4序列互補(bǔ)結(jié)合的P5序列，3’端帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，通過(guò)與擴(kuò)增探針P4序列的結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。(當(dāng)檢測(cè)體系中使用標(biāo)記探針時(shí)，擴(kuò)增探針的P4序列3’端不帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，而由標(biāo)記探針的3’端帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，如試劑盒A)標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，標(biāo)記探針的FL1、FL2和FL3選擇的熒光基團(tuán)互不相同，且所選擇的熒光基團(tuán)的顏色互不相同或發(fā)射波長(zhǎng)互不相同，以便于區(qū)分不同類(lèi)型的標(biāo)志基因。本實(shí)施例標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)標(biāo)記優(yōu)選如表6所示。表6標(biāo)記探針本實(shí)施例所述不具有標(biāo)記探針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒B，主要包括有：一、捕獲探針：與上述具有標(biāo)記探針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒中的捕獲探針相同。二、擴(kuò)增探針：與上述具有標(biāo)記探針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒中的捕獲探針的序列相同，但P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)。所述P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)，具體為：針對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL1，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL2，白細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL3，所述熒光基團(tuán)選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705和AlexaFluor488，其中FL1、FL2和FL3對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)互不相同，且所對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)的顏色互不相同或發(fā)射波長(zhǎng)互不相同，以便于區(qū)分不同類(lèi)型的標(biāo)志基因。標(biāo)志基因擴(kuò)增探針的P4序列的3’端的熒光基團(tuán)標(biāo)記優(yōu)選如表5所示。表5標(biāo)志基因的染料標(biāo)記實(shí)施例2運(yùn)用實(shí)施例1中的試劑盒A對(duì)腫瘤患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)所述各種溶液的配方如下：本實(shí)施例中的探針混合液、擴(kuò)增混合液、顯色混合液均使用實(shí)施例1具有標(biāo)記探針的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒A相應(yīng)基因列表中的全部探針。一、樣本預(yù)處理，將CTCs過(guò)濾至濾膜上1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清，去除紅細(xì)胞。2.加入4mlPBS和1ml固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過(guò)濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過(guò)濾器中，打開(kāi)真空抽濾泵抽盡液體；在本保存管中加入4mlPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μl4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。三、消化細(xì)胞，暴露mRNA，使其與探針雜交1.配制相應(yīng)濃度的消化酶工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量消化酶1.25μlPBS48.75μl總體積50μl2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標(biāo)mRNA序列結(jié)合1.探針緩沖液、擴(kuò)增緩沖液和顯色緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量探針混合液8μl探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μl總體積50.0μl渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時(shí)。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過(guò)30min。五、擴(kuò)增雜交，目標(biāo)mRNA序列信號(hào)放大1.配制擴(kuò)增工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量擴(kuò)增混合液2μl擴(kuò)增緩沖液(40℃預(yù)熱)48μl總體積50.0μl渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中擴(kuò)增工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過(guò)30min。六、顯色，熒光標(biāo)記目標(biāo)信號(hào)1.配制顯色工作液試劑組分每個(gè)樣本用量顯色混合液2μl顯色緩沖液(40℃預(yù)熱)48μl總體積50.0μl避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過(guò)30min。七、熒光顯微鏡觀察CTCs本發(fā)明的對(duì)照品使用DAPI作為細(xì)胞核熒光基團(tuán)，其發(fā)射藍(lán)色熒光信號(hào)。1.將濾膜細(xì)胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μl含DAPI的抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過(guò)20倍物鏡計(jì)數(shù)CTC異性核數(shù)量。3.根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4.然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個(gè)異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5.重復(fù)操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計(jì)數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如下：表7熒光基團(tuán)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)八、檢測(cè)結(jié)果判斷及分析1.陽(yáng)性CTCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)在濾膜上，富集有少量的循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及殘留的白細(xì)胞，循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為(參見(jiàn)圖1)：1)具有循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在Cy3通道和/或AlexaFluor488通道下能夠顯示紅色熒光信號(hào)點(diǎn)和/或綠色熒光信號(hào)點(diǎn)。2)不具有白細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在Cy5通道下不顯示熒光信號(hào)點(diǎn)。3)細(xì)胞核DAPI染色陽(yáng)性。4)循環(huán)腫瘤細(xì)胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細(xì)胞大小與濾膜孔大小相近。2.陽(yáng)性CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)：本試劑盒采用多重RNA探針，分別針對(duì)多種CTCs特異性基因，通過(guò)不同顏色熒光信號(hào)，可進(jìn)一步將CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)CTCs攜帶Cy3熒光基團(tuán)(顯示為紅色熒光信號(hào)點(diǎn))，Ⅲ型(間質(zhì)型)CTCs攜帶AlexaFluor488熒光基團(tuán)(顯示為綠色熒光信號(hào)點(diǎn))，同時(shí) 表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型特異性基因的CTCs為Ⅱ型(上皮-間質(zhì)混合型，同時(shí)顯示紅色熒光及綠色熒光信號(hào)點(diǎn))。參見(jiàn)圖2。CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)如下：表8陽(yáng)性CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)3.使用上述檢測(cè)方法，對(duì)20例腫瘤患者外周血樣本進(jìn)行檢測(cè)和觀察，具體結(jié)果為(表中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目)：表9樣本檢測(cè)結(jié)果編號(hào)上皮型上皮-間質(zhì)混合型間質(zhì)型CTC總量1010121214300224007751510166016770841280419239024610114153011010112043034130145140729151120131601011705051803141906121820017623實(shí)施例3運(yùn)用實(shí)施例1中的試劑盒A對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)一、細(xì)胞株的選擇本發(fā)明試劑盒上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20中的兩個(gè)或兩個(gè)以上；所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選自：VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2中的兩個(gè)或兩個(gè)以上；白細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)镃D45。本發(fā)明選用的上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因中的各種標(biāo)志基因，是發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析篩選得出的在CTCs上特異表達(dá)的基因，對(duì)CTCs的鑒定和分型具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。本實(shí)施例選用上皮型細(xì)胞株MCF-10A、間質(zhì)型腫瘤細(xì)胞株U118和上皮-間質(zhì)混合型肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陰性對(duì)照細(xì)胞使用CCRF-HSB-2淋巴母細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱(chēng)即可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。取約1000個(gè)MCF-10A細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)21-25；取約1000個(gè)U118細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)26-30；取約1000個(gè)PC-9細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)31-35；取約1000個(gè)CCRF-HSB-2淋巴母細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)36-40。二、樣本檢測(cè)運(yùn)用實(shí)施例1中的試劑盒A的全部探針(包括所有的標(biāo)志基因，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2)，白細(xì)胞標(biāo)志基因CD45。按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣本21-40進(jìn)行檢測(cè)，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來(lái)選取，針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測(cè)結(jié)果如下：表10樣本檢測(cè)結(jié)果通過(guò)比較樣本中四種細(xì)胞株的檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒能實(shí)現(xiàn)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因的檢測(cè)，對(duì)樣本中細(xì)胞株MCF-10A、U118、PC-9和CCRF-HSB-2淋巴母細(xì)胞的檢出率均為100％。其中，上皮和/或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因僅在MCF-10A、U118和PC-9細(xì)胞株中檢測(cè)到mRNA表達(dá)，而在淋巴母細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，由此可見(jiàn)，本發(fā)明試劑盒能夠有效區(qū)分樣本中的腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞。同時(shí)，通過(guò)上皮型細(xì)胞株MCF-10A、間質(zhì)型腫瘤細(xì)胞株U118和上皮-間質(zhì)混合型肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9的檢測(cè)結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒選用的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因能對(duì)檢測(cè)到的細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)確的分型(上皮型、上皮-間質(zhì)混合型和間質(zhì)型)，在上皮型細(xì)胞株中只檢測(cè)到上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的熒光信號(hào)，在間質(zhì)型細(xì)胞株上只檢測(cè)到間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的熒光信號(hào)，而在上皮-間質(zhì)混合型細(xì)胞株上能同時(shí)檢測(cè)到上皮和間質(zhì)兩種類(lèi)型細(xì)胞標(biāo)志基因的熒光信號(hào)，說(shuō)明本發(fā)明試劑盒選用的分型標(biāo)志物具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。實(shí)施例4不同種類(lèi)細(xì)胞標(biāo)志基因的選擇一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志基因數(shù)量和種類(lèi)的選擇)本發(fā)明試劑盒上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組做相應(yīng)的選擇；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)椋篤IMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1和SNAI2。上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的選擇參見(jiàn)實(shí)施組1-4，分別選取一種、兩種、五種及七種的標(biāo)志基因，對(duì)比其檢測(cè)效果，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因使用全部的目標(biāo)基因以及白細(xì)胞標(biāo)志基因CD45，具體設(shè)計(jì)如表11所示。本實(shí)施例每組相應(yīng)標(biāo)志基因的所述捕獲探針、擴(kuò)增探針與標(biāo)記探針的組成和數(shù)量、檢測(cè)方法等如實(shí)施例1試劑盒A和實(shí)施例2所述。表11上皮細(xì)胞標(biāo)志基因基因的選擇二、樣本檢測(cè)本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱(chēng)即可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)41-45；取約1000個(gè)MCF-7細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)46-50；取約1000個(gè)PC-9細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)51-55。采用表11標(biāo)志基因制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣本41-55進(jìn)行檢測(cè)，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來(lái)選取，針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測(cè)結(jié)果如下(表12中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表13中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))：表12使用不同數(shù)量上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)效果的比較表13使用不同數(shù)量上皮細(xì)胞標(biāo)志基因平均熒光點(diǎn)數(shù)的比較對(duì)比實(shí)驗(yàn)組1-4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因分別選取一種、兩種五種及七種，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因使用全部基因時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，而上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)結(jié)果有差異：由于不同腫瘤細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的差異，只選用一種標(biāo)志基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，會(huì)造成一定程度的漏檢，使用2種或2種以上時(shí)，檢測(cè)效果達(dá)到穩(wěn)定，且平均紅色熒光信號(hào)點(diǎn)從實(shí)驗(yàn)組1到實(shí)驗(yàn)組4隨著上皮細(xì)胞標(biāo)志基因數(shù)量的增加而逐漸增加，檢測(cè)效果更優(yōu)，其中，選用全部的上皮細(xì)胞標(biāo)記基因時(shí)，檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)最穩(wěn)定，效果最優(yōu)。同時(shí)，由于間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選用全部的10種基因，其檢測(cè)效果穩(wěn)定，且4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的平均綠色熒光信號(hào)點(diǎn)沒(méi)有差別，說(shuō)明上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的增加并不影響間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的檢測(cè)結(jié)果，由此可知，本發(fā)明試劑盒所設(shè)計(jì)的各種類(lèi)型探針之間基本不存在非特異性結(jié)合，特異性好。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因基因數(shù)量的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上皮細(xì)胞標(biāo)志基因一致。其它針對(duì)使用不同數(shù)量和種類(lèi)的上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例5試劑盒目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志基因的選擇一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志基因數(shù)量和種類(lèi)的選擇)本發(fā)明試劑盒上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：EPCAM、E-cadherin、CEA、KRT5、KRT7、KRT17、KRT20；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選自：VIMENTIN、N-cadherin、TWIST1、AKT2、ZEB2、ZEB1、FOXC1、FOXC2、SNAI1、SNAI2。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組5-8，分別選取兩種、四種、十二種及十七種的標(biāo)志基因基因，對(duì)比其檢測(cè)效果，白細(xì)胞使用標(biāo)志基因CD45，具體設(shè)計(jì)如表14所示。本實(shí)施例每組相應(yīng)標(biāo)志基因的所述捕獲探針、擴(kuò)增探針與標(biāo)記探針的組成和數(shù)量、檢測(cè)方法等如實(shí)施例1試劑盒A和實(shí)施例2所述。表14試劑盒標(biāo)志基因基因的選擇二、樣本檢測(cè)本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱(chēng)即可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)56-60；取約1000個(gè)MCF-7細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)61-65；取約1000個(gè)PC-9細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)66-70。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣本56-70進(jìn)行檢測(cè)，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來(lái)選取，針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測(cè)結(jié)果如下(表15中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表16中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))：表15試劑盒使用不同數(shù)量標(biāo)志基因檢測(cè)效果的比較表16試劑盒使用不同數(shù)量標(biāo)志基因平均熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)檢測(cè)效果的比較對(duì)比實(shí)驗(yàn)組5-8的檢測(cè)結(jié)果可知，使用2種標(biāo)志基因時(shí)(實(shí)驗(yàn)組5)會(huì)由于不同細(xì)胞上基因的差異表達(dá)而照成假陰性的結(jié)果，使用4種及4種以上標(biāo)志基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)效果達(dá)到穩(wěn)定，且細(xì)胞上2種細(xì)胞種類(lèi)標(biāo)志基因?qū)?yīng)的熒光信號(hào)點(diǎn)從實(shí)驗(yàn)組5到實(shí)驗(yàn)組8隨著標(biāo)志基因數(shù)量 的增加而逐漸增加，檢測(cè)效果更優(yōu)，其中，選用全部的標(biāo)記基因時(shí)，檢測(cè)信號(hào)最強(qiáng)最穩(wěn)定，效果最優(yōu)。其它針對(duì)使用不同數(shù)量和種類(lèi)的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例6不同間隔臂的試劑盒對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型mRNA原位雜交的檢測(cè)一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(間隔臂的選擇)以上皮細(xì)胞標(biāo)志基因(共7個(gè)基因)為例，分別選用不同的間隔臂，具體設(shè)計(jì)如表17所示。其余捕獲探針、擴(kuò)增探針與標(biāo)記探針的堿基組成以及所用數(shù)量全部與實(shí)施例1試劑盒A相同、不同之處僅在于間隔臂不同，檢測(cè)方法等如實(shí)施例2所述。對(duì)應(yīng)的捕獲探針、擴(kuò)增探針的間隔臂相同。表17間隔臂及其長(zhǎng)度間隔臂種類(lèi)長(zhǎng)度實(shí)驗(yàn)組poly(dT)59poly(dA)810(CH2)n1511poly(TTG)312二、樣本檢測(cè)本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱(chēng)即可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)71-75；取約1000個(gè)MCF-7細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)76-80；取約1000個(gè)PC-9細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)81-85。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣本71-85進(jìn)行檢測(cè)，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來(lái)選取，具體檢測(cè)結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目)：表18上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)探針使用不同間隔臂的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較經(jīng)過(guò)對(duì)比4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的檢測(cè)結(jié)果可知，4組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的檢測(cè)效果沒(méi)有差異，因此，這4種間隔臂的設(shè)計(jì)是等效的。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因以及白細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)探針使用不同的間隔壁檢測(cè)結(jié)果與上皮細(xì)胞標(biāo)志基因一致，具體數(shù)據(jù)省略。其它針對(duì)捕獲探針、擴(kuò)增探針和標(biāo)記探針內(nèi)部不同的間隔序列的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例7：標(biāo)記探針的運(yùn)用一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(信號(hào)檢測(cè)組分)本發(fā)明試劑盒信號(hào)檢測(cè)組分有兩種選擇，1)擴(kuò)增探針P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)；2)擴(kuò)增探針3’端P4序列與標(biāo)記探針的P5序列通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，同時(shí)標(biāo)記探針的3’端帶有熒光基團(tuán)。這兩種信號(hào)檢測(cè)組分均能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，檢測(cè)到正常信號(hào)。其中，使用熒光基團(tuán)修飾的標(biāo)記探針，檢測(cè)信號(hào)更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以所述試劑盒的檢測(cè)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的兩種信號(hào)檢測(cè)組分為例，具體設(shè)計(jì)如表19所示。即所述試劑盒的組成為：實(shí)驗(yàn)組13：捕獲探針和擴(kuò)增探針的組成和數(shù)量同實(shí)施例1試劑盒A，但擴(kuò)增探針3’端修飾有熒光基團(tuán)Cy3；沒(méi)有標(biāo)記探針；實(shí)驗(yàn)組14：捕獲探針、擴(kuò)增探針和標(biāo)記探針的組成和數(shù)量同實(shí)施例1試劑盒A，擴(kuò)增探針不具有熒光基團(tuán)，但配置有標(biāo)記探針，標(biāo)記探針的P5序列3’端修飾有熒光基團(tuán)Cy3。表19信號(hào)檢測(cè)組分二、樣本檢測(cè)本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱(chēng)即可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)86-90；取約1000個(gè)MCF-7細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)91-95；取約1000個(gè)PC-9細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)96-100。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣本71-85進(jìn)行檢測(cè)，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來(lái)選取，針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測(cè)結(jié)果如下(表20中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表21中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))：表20上皮細(xì)胞標(biāo)志基因使用不同信號(hào)檢測(cè)探針的檢測(cè)結(jié)果比較表21上皮細(xì)胞標(biāo)志基因使用不同信號(hào)檢測(cè)探針平均熒光點(diǎn)數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較將兩組設(shè)計(jì)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明兩組設(shè)計(jì)對(duì)樣本中細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有差異，因此，這兩種信號(hào)檢測(cè)組分對(duì)信號(hào)的檢測(cè)是等效的。其中，使用熒光基團(tuán)修飾的標(biāo)記探針(即實(shí)驗(yàn)組14)，其檢測(cè)到上皮細(xì)胞標(biāo)志基因熒光點(diǎn)數(shù)更多，信號(hào)更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。其他針對(duì)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因標(biāo)記探針的運(yùn)用檢測(cè)結(jié)果與上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測(cè)結(jié)果一致，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例8標(biāo)志基因的捕獲探針的數(shù)量選擇一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(捕獲探針數(shù)量的選擇)本發(fā)明循環(huán)腫瘤細(xì)胞分型鑒定試劑盒，針對(duì)不同細(xì)胞種類(lèi)的每個(gè)標(biāo)志基因分別設(shè)計(jì)了10條捕獲探針，且同一細(xì)胞種類(lèi)的標(biāo)志基因的捕獲探針中的P2序列相同。在實(shí)際使用時(shí)，可以針對(duì)每種標(biāo)志基因，選擇對(duì)應(yīng)的至少2條捕獲探針即可完成檢測(cè)，特異性和穩(wěn)定性都能達(dá)到需求。為考察捕獲探針數(shù)量的選擇對(duì)試劑盒檢測(cè)效果的影響，以上皮細(xì)胞標(biāo)志基因EPCAM的捕獲探針數(shù)量選擇為例，參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組15-17，分別選取1條、2條及10條的捕獲探針，對(duì)比其檢測(cè)效果。在該對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因僅使用EPCAM(參見(jiàn)表22)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因使用如實(shí)施例1試劑盒A所列出的全部基因和探針。表22上皮細(xì)胞標(biāo)志基因EPCAM的捕獲探針的選擇二、樣本檢測(cè)本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱(chēng)即可通過(guò)購(gòu)買(mǎi)得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)101-105；取約1000個(gè)MCF-7細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)106-110；取約1000個(gè)PC-9細(xì)胞(通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)111-115。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測(cè)過(guò)程和方法對(duì)樣本101-115進(jìn)行檢測(cè)，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過(guò)熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來(lái)選取，針對(duì)目標(biāo)檢測(cè)標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測(cè)結(jié)果如下(表23中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表24中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))：表23上皮細(xì)胞標(biāo)志基因EPCAM使用不同數(shù)量捕獲探針的檢測(cè)結(jié)果比較表24上皮細(xì)胞標(biāo)志基因EPCAM使用不同數(shù)量捕獲探針平均熒光點(diǎn)數(shù)檢測(cè)結(jié)果比較通過(guò)三組實(shí)驗(yàn)對(duì)比可知，當(dāng)僅選用上皮細(xì)胞標(biāo)志基因EPCAM，使用1條、2條和10條的捕獲探針均可完成檢測(cè)，當(dāng)捕獲探針使用2條或以上時(shí)，其特異性和穩(wěn)定性都很好。其中，當(dāng)使用全部10條的捕獲探針時(shí)，上皮基因檢測(cè)到的熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)更多，信號(hào)更強(qiáng)更穩(wěn)定，檢測(cè)效果最佳。其它針對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因的使用不同數(shù)量捕獲探針的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3