本申請(qǐng)要求2015年10月29日和2016年10月14日，提交的韓國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0-2015-0151313和10-2016-0133529的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用納入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及使用數(shù)字PCR進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法。

發(fā)明背景

由于例如結(jié)婚年齡增加和女性生育年齡增加的原因，胎兒遺傳疾病發(fā)生的概率在最近10年急速升高。如果在妊娠早期檢測(cè)到包括胎兒遺傳疾病在內(nèi)的疾病，就能夠采取早期醫(yī)療措施以確保安全，并且能夠減少孕婦和胎兒的痛苦。因此，胎兒遺傳異常的早期診斷是非常重要的。胎兒體內(nèi)可發(fā)生的遺傳異常包括部分染色體易位、缺失、復(fù)制、插入和數(shù)目異常(例如，三體性)。當(dāng)存在這種染色體異常時(shí)，在整個(gè)胎兒體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)異常和功能異常。尤其地，眾所周知基因數(shù)目異常在高齡孕婦中發(fā)生頻率更高。

通常使用羊膜穿刺術(shù)來(lái)診斷胎兒遺傳異常。然而，羊膜穿刺術(shù)是侵入性的測(cè)試方法，可能引起各種問(wèn)題，包括注射器對(duì)羊膜的細(xì)菌感染、注射器引起的傷口、和羊水泄漏，在嚴(yán)重情況下也可能引起流產(chǎn)。由于這個(gè)緣故，近年來(lái)，引入了通過(guò)從孕婦血液中提取胎兒DNA診斷胎兒遺傳異常的方法。然而，孕婦血液中所含的胎兒DNA數(shù)量比孕婦的DNA數(shù)量少得多，因此胎兒遺傳信息的分析準(zhǔn)確度很低。與此相關(guān)，韓國(guó)專利10-1387582披露了一種通過(guò)實(shí)時(shí)PCR能夠檢測(cè)孕婦體內(nèi)無(wú)細(xì)胞胎兒核酸的方法，所述實(shí)時(shí)PCR以存在于孕婦血液中的極少量的無(wú)細(xì)胞胎兒核酸為目標(biāo)。所述實(shí)時(shí)PCR是一種非侵入性方法，但其缺點(diǎn)在于，同時(shí)進(jìn)行多種測(cè)試是受限制的，為了精確檢測(cè)胎兒遺傳異常需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且需要一定量的或更多的樣本。

因此，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中出現(xiàn)的上述問(wèn)題而作出本發(fā)明，本發(fā)明目的在于一種能夠提高胎兒遺傳信息分析的準(zhǔn)確性的方法，所述方法在使用孕婦血液進(jìn)行產(chǎn)前診斷時(shí)通過(guò)濃縮胎兒DNA進(jìn)行。本發(fā)明的產(chǎn)前診斷方法對(duì)于所有孕婦和胎兒是安全、方便、準(zhǔn)確和可靠的，因此預(yù)期在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域是非常有用的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題而做出的，涉及使用數(shù)字PCR進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法。

然而，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)目標(biāo)不限于上述技術(shù)目標(biāo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可從以下描述中充分理解上述未提到的其它目標(biāo)。

在下文中，將參考附圖描述本文所述的各種實(shí)施例。在以下的描述中，闡述了許多具體細(xì)節(jié)，例如具體的配置、組成和過(guò)程等，以透徹理解本發(fā)明。然而，可以在沒(méi)有一個(gè)或多個(gè)這些具體細(xì)節(jié)的情況下，或者與其他已知的方法和配置相組合來(lái)實(shí)施某些實(shí)施例。在其它實(shí)例中，沒(méi)有特別詳細(xì)地描述已知的工藝和制備方法，以免不必要地混淆本發(fā)明。說(shuō)明書全文中提及的“一個(gè)實(shí)施例”或“某個(gè)實(shí)施例”意味著描述的與該特征相關(guān)的特定的特征、配置、組成或特性包括在本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例中。因此，說(shuō)明書全文中各處出現(xiàn)的短語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”或“某個(gè)實(shí)施例”不必指本發(fā)明的同一個(gè)實(shí)施例。另外，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，特定的特征、配置、組成或特性可以以任何合適的方式組合。

除非在說(shuō)明書中另有規(guī)定，本說(shuō)明書中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，“產(chǎn)前診斷”是指在出生前診斷先天性異常，也稱為出生前診斷或?qū)m內(nèi)診斷。使用胎兒的或來(lái)自胎兒的蛻膜材料作為樣本，通過(guò)使用細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)分析和成像的方法進(jìn)行測(cè)試。其目的在于早發(fā)現(xiàn)與發(fā)育和生育保護(hù)相關(guān)的先天性異常。技術(shù)包括侵入性方法(羊膜穿刺術(shù)、絨毛取樣術(shù)、胎兒臍血取樣術(shù)、胎兒皮膚活檢和胎兒肝臟活檢)和非侵入性方法(超聲波測(cè)試，來(lái)自孕婦的胎兒細(xì)胞取樣等)。

當(dāng)父母中的任意一人或多人表現(xiàn)出染色體異?；驀?yán)重的遺傳疾病時(shí)，或者當(dāng)孕婦有可能生出畸形兒，或者當(dāng)孕婦為高齡產(chǎn)婦，或者超聲波檢查出孕婦具有胎兒毒性(fetal poisoning)，或者懷疑其具有染色體異常、單一遺傳疾病或遺傳性代謝紊亂等，需要進(jìn)行遺傳產(chǎn)前診斷。在核型分析中，從安全性角度講，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行羊膜穿刺術(shù)，并且，一般來(lái)說(shuō)，在懷孕第15周和18周之間血液采樣。也可進(jìn)行絨毛取樣術(shù)用于DNA診斷，其中在懷孕第9周和11周之間通過(guò)陰道或腹部絨毛采樣。在懷孕16周后通過(guò)腹部從臍帶處采樣胎血。為進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)診斷，通過(guò)熒光原位雜交(FISH)進(jìn)行核型測(cè)試以培養(yǎng)胎兒細(xì)胞，通過(guò)Southern印跡雜交法或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行直接診斷用于分子基因診斷，或者通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)或PCR-RFLP技術(shù)等進(jìn)行間接診斷。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“染色體異?！币卜Q為“染色體異倍體”，并且意味著細(xì)胞中、個(gè)體中或種群中每個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)目不是基本數(shù)目的整倍數(shù)，而是比整倍數(shù)增加或減少一個(gè)或幾個(gè)數(shù)字，也就是說(shuō)，包括具有不完全結(jié)構(gòu)的基因組的狀態(tài)。處于這種狀態(tài)的細(xì)胞或個(gè)體稱為非整倍體(或異倍體)。通常，染色體數(shù)目大于基本數(shù)目的整數(shù)倍的情況被稱為超倍體，而染色體數(shù)目小于基本數(shù)目的整數(shù)倍的情況被稱為亞倍體。特別地，對(duì)于二倍體，缺失一對(duì)兩條同源染色體的情況被稱為缺體性(nullisomy)，將缺失一條同源染色體而另一條同源染色體繼續(xù)存在的情況稱為單體性(monosomy)，并且將除了一對(duì)同源染色體外還存在另外的染色體的情況稱為三體性。

通常的性染色體三體性為XXY，是主要由睪丸功能障礙引起的克氏綜合征(Klinefelter’s syndrome)。此外，還存在X染色體數(shù)目為1(XO)并且卵巢未發(fā)育的特納綜合征(Turner’s syndrome)，X染色體數(shù)為3的XXX女性，以及具有XYY的YY綜合征(YY男性)。典型的三體性障礙包括但不限于，21號(hào)染色體是三體性的唐氏綜合征，18號(hào)染色體是三體性的并且在胎兒期引起發(fā)育障礙的愛(ài)德華氏綜合征，以及13號(hào)染色體是三體性的并且包括嚴(yán)重畸形的帕陶綜合征。貓叫綜合征是指具有特征性哭泣聲音的癥狀的病癥，并且是由5號(hào)染色體短臂的部分缺失引起的。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，“實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(實(shí)時(shí)PCR)”也稱為定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)，是一種擴(kuò)增靶DNA分子并且同時(shí)測(cè)量靶DNA分子的量的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。通常使用的RT-PCR是指逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，而不是實(shí)時(shí)PCR。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員不能清楚地區(qū)分它們。實(shí)時(shí)PCR可以檢測(cè)某一DNA樣本中具有特定序列的一個(gè)或多個(gè)基因的絕對(duì)拷貝數(shù)目或相對(duì)量。

根據(jù)通常的PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一個(gè)重要的特征是實(shí)時(shí)測(cè)量擴(kuò)增的DNA。這與在最終階段觀察DNA的基礎(chǔ)PCR不同。在實(shí)時(shí)PCR中使用兩種通用方法：(1)可進(jìn)入任何DNA雙螺旋的非特異性熒光染色；和(2)由寡核苷酸組成的序列特異的DNA探針。用熒光標(biāo)記報(bào)告(基因)，并且在結(jié)合至互補(bǔ)DNA目標(biāo)后進(jìn)行檢測(cè)。通常，實(shí)時(shí)PCR與逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)合進(jìn)行，以測(cè)量未由細(xì)胞或組織的mRNA編碼的非編碼RNA的量。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，“數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(數(shù)字PCR)”是用于檢測(cè)和定量核酸的新方法，并且，與常規(guī)的qPCR相比，其能夠精確地定量分析和高靈敏度地檢測(cè)靶核酸分子。分析常規(guī)qPCR的結(jié)果的方法是模擬方法，其中，所述數(shù)字PCR方法，其結(jié)果是通過(guò)數(shù)字方法(因?yàn)榈玫降男盘?hào)具有“0”或“1”的數(shù)值)分析的，具有可分析大體積樣本、可同時(shí)檢測(cè)不同樣本以及同時(shí)進(jìn)行不同測(cè)試的優(yōu)點(diǎn)。數(shù)字PCR技術(shù)是一種可使用不具有標(biāo)準(zhǔn)曲線的單分子計(jì)數(shù)法來(lái)絕對(duì)定量DNA樣本的技術(shù)，并且可以通過(guò)PCR對(duì)每孔單個(gè)液滴進(jìn)行更精確的絕對(duì)定量(參見(jiàn)Gudrun Pohl和le-Ming Shih，數(shù)字PCR的原理和應(yīng)用(Principle and applications of digital PCR)，Expert Rev.Mol.Diagn.4(1),41-47(2004))。

在數(shù)字PCR中，含有經(jīng)制備從而可用于稀釋至平均拷貝數(shù)目為0.5-1的樣本基因模板、擴(kuò)增引物和熒光探針的各液滴分配到單個(gè)孔中，并進(jìn)行微乳液PCR。然后，顯示熒光信號(hào)的孔計(jì)數(shù)為數(shù)值“1”，因?yàn)榫哂谢蚩截悢?shù)目為1的樣本分配到所述孔中并且擴(kuò)增后顯示熒光信號(hào)，并且，沒(méi)有顯示信號(hào)的孔計(jì)數(shù)為“0”，因?yàn)榫哂谢蚩截悢?shù)目為0的樣本分配到所述孔中，由于無(wú)擴(kuò)增，不顯示熒光信號(hào)。采用這種方式，可以實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。

在數(shù)字PCR中，只有每個(gè)孔的基因拷貝數(shù)目顯示熒光信號(hào)為1時(shí)，數(shù)據(jù)的可靠性才能保證。在數(shù)字PCR的定量中，如果每孔的信號(hào)出現(xiàn)或不出現(xiàn)泊松分布，可認(rèn)為是數(shù)字值1或0，并且可計(jì)算正值(1)與負(fù)值(0)的比率。如果正值與正值和負(fù)值之和的比率大大偏離于泊松分布中的1的基因拷貝數(shù)目，可能意味著每孔的基因拷貝數(shù)目大于1。因此，在這種情況下，數(shù)據(jù)的可靠性不能得到保證。由于這個(gè)緣故，在數(shù)字PCR中，擴(kuò)增后定量的數(shù)值不滿足泊松分布。因此，如果每孔的基因拷貝數(shù)目遠(yuǎn)大于1，稀釋基因樣本以滿足泊松分布是重要的。如果每孔的基因拷貝數(shù)目接近1，校正該數(shù)值則是重要的(例如，可以使用Poisson9程序進(jìn)行校正)。

然而，在數(shù)字PCR方法中，盡管能簡(jiǎn)單進(jìn)行定量分析、高通量分析并且能處理大量樣本，但迄今為止仍需要校正定量分析的技術(shù)以保證數(shù)字PCR的數(shù)據(jù)可靠性，并且，將每孔的基因拷貝數(shù)目調(diào)整至1存在技術(shù)困難。特別地，如上所述，當(dāng)對(duì)來(lái)自孕婦的血液或血漿的胎兒基因數(shù)量的異常進(jìn)行基因分析，并且使用靶基因的特異性引物對(duì)和探針對(duì)染色體數(shù)目異常進(jìn)行數(shù)字PCR時(shí)，存在的問(wèn)題是，由于存在大量孕婦基因的背景信號(hào)，與存在于孕婦血液或血漿中的少量胎兒靶向基因相關(guān)的基因數(shù)目的異常無(wú)法檢測(cè)或者檢測(cè)為不清晰信號(hào)。該問(wèn)題成為難以將胎兒無(wú)細(xì)胞基因的基因型分析技術(shù)與數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合的障礙。

因此，當(dāng)通過(guò)使用存在于孕婦血液或血漿中的極少量胎兒基因，基于數(shù)字PCR技術(shù)分析胎兒染色體數(shù)目異常時(shí)，需要提供一種技術(shù)，其通過(guò)滿足數(shù)字PCR技術(shù)所需的泊松分布而顯示出可靠的定量結(jié)果，同時(shí)克服了難以分離僅來(lái)自胎兒基因的信號(hào)的問(wèn)題，以及由孕婦基因引起的背景信號(hào)的問(wèn)題。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，“對(duì)照基因”指的是用作測(cè)試參考以確定靶基因是否異常的正常基因。例如，如本文所用，所述“對(duì)照基因”是孕婦染色體組或來(lái)自于孕婦血液或血漿的胎兒染色體組中已知的與染色體異常無(wú)關(guān)的染色體上的基因，并且可以是1號(hào)染色體或2號(hào)染色體，但不限于此。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，待分析樣本的基因中，“靶基因”是具有利于基因型分析的突變的基因。靶基因的例子包括用于遺傳分型或個(gè)體識(shí)別的標(biāo)記基因、用于診斷特定疾病的標(biāo)記基因、顯示出染色體數(shù)值異常或染色體數(shù)目異常的基因、具有遺傳學(xué)顯著突變的基因、具有STR(短串聯(lián)重復(fù))的基因、以及具有單核苷酸多態(tài)性的基因。例如，本文所用的靶基因是位于已知與染色體異常有關(guān)的染色體上的基因，并且可以是21號(hào)染色體(唐氏綜合征)，18號(hào)染色體(愛(ài)德華氏綜合征)或13號(hào)染色體(帕陶綜合征)，但不限于此。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，“診斷”是指確認(rèn)病理的存在或特征。為了本發(fā)明的目的，診斷是指分析來(lái)自于孕婦血液的胎兒遺傳信息以確定染色體數(shù)目是否異常。

在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了為診斷胎兒中染色體非整倍性提供信息的方法，所述方法包括步驟：(a)從孕婦血液中提取DNA；(b)根據(jù)大小分級(jí)DNA，以獲得大小為1,000bp或更小的DNA；(c)使用步驟(b)獲得的DNA為染色體上與染色體非整倍性無(wú)關(guān)的對(duì)照基因和染色體上與染色體非整倍性相關(guān)的靶基因進(jìn)行數(shù)字PCR；(d)計(jì)算靶基因的定量數(shù)字PCR值與對(duì)照基因的定量數(shù)字PCR值的比率；以及，(e)當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比例為0.70-1.14時(shí)，確定胎兒的染色體數(shù)目是正常的。本發(fā)明的為診斷胎兒染色體非整倍性提供信息的方法包括步驟：當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比率為0.95-1.10時(shí)，確定胎兒的染色體數(shù)目是正常的。在本發(fā)明的用于提供診斷胎兒染色體非整倍性的信息的方法中，根據(jù)大小對(duì)DNA進(jìn)行分級(jí)的步驟(b)包括步驟：(a)將第一磁珠(珠A)添加到DNA中，并且分離出未結(jié)合至珠A的DNA；和(b)將第二磁珠(珠B)添加到分離的DNA中，并且洗脫出結(jié)合至珠B的DNA，其中所述珠A和珠B以0.75-1.25:1的比例(珠A或珠B：DNA)添加至DNA中。在本發(fā)明的為診斷胎兒染色體非整倍性提供信息的方法中，珠A或珠B以0.75-1.0:1的比例(珠A或珠B：DNA)加入DNA。

在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供為診斷胎兒中染色體非整倍性提供信息的方法，所述方法包括步驟：(a)從孕婦血液中提取DNA；(b)根據(jù)大小分級(jí)DNA，以獲得大小為1,000bp或更小的DNA；(c)使用步驟(b)的DNA為染色體上與染色體非整倍性無(wú)關(guān)的對(duì)照基因和染色體上與染色體非整倍性相關(guān)的靶基因進(jìn)行數(shù)字PCR；(d)計(jì)算靶基因的定量數(shù)字PCR值與對(duì)照基因的定量數(shù)字PCR值的比率；以及，(e)當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比例為0.10-0.69或1.15-1.80時(shí)，確定胎兒的染色體數(shù)目是異常的。本發(fā)明的為診斷胎兒染色體非整倍性提供信息的方法包括步驟：當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比率為0.45-0.69或1.15-1.31時(shí)，確定胎兒的染色體數(shù)目是異常的。本發(fā)明的為診斷胎兒染色體非整倍性提供信息的方法包括步驟：當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比例為0.10-0.69時(shí)，確定胎兒的染色體數(shù)目是單體性。在本發(fā)明的方法中，所述單體性是特納綜合征。本發(fā)明的的方法包括步驟：當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比例為1.15-1.80時(shí)，確定胎兒的染色體數(shù)目是三體性。在本發(fā)明的方法中，所述三體性是唐氏綜合征、愛(ài)德華氏綜合征或帕陶綜合征。在本發(fā)明的方法中，根據(jù)大小對(duì)DNA進(jìn)行分級(jí)的步驟(b)包括步驟：(a)將第一磁珠(珠A)添加到DNA中，并且分離出未結(jié)合至珠A的DNA；和(b)將第二磁珠(珠B)添加到分離的DNA中，并且洗脫出結(jié)合至珠B的DNA，其中所述珠A和珠B以0.75-1.25:1的比例(珠A或珠B：DNA)添加至DNA中。本發(fā)明的用于提供診斷胎兒染色體非整倍性的信息的方法中，珠A或珠B以0.75-1.0:1的比例(珠A或珠B：DNA)加入DNA。

此外，在上述為診斷胎兒中的染色體非整倍性提供信息的方法中，所述靶基因可以是選自下組的任何一種或多種基因：具有SEQ ID NO：1至4的核苷酸序列的基因。在本發(fā)明的方法中，SEQ ID NO：7和8的一對(duì)引物作為引物對(duì)用于擴(kuò)增具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的靶基因，并且，SEQ ID NO：9的寡核苷酸作為探針用于檢測(cè)具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。而且，SEQ ID NO：10和11的一對(duì)引物作為引物對(duì)用于擴(kuò)增具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的靶基因，并且，SEQ ID NO：12的寡核苷酸作為探針用于檢測(cè)具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列的靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，SEQ ID NO：13和14的一對(duì)引物作為引物對(duì)用于擴(kuò)增具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的靶基因，并且，SEQ ID NO：15的寡核苷酸作為探針用于檢測(cè)具有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。除此之外，SEQ ID NO：16和17的一對(duì)引物作為引物對(duì)用于擴(kuò)增具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的靶基因，并且，SEQ ID NO：18的寡核苷酸作為探針用于檢測(cè)具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

此外，在上述為診斷胎兒中的染色體非整倍性提供信息的方法中，所述對(duì)照基因可以是選自下組的任何一種或多種基因：具有SEQ ID NO：5至6的核苷酸序列的基因。在本發(fā)明的方法中，SEQ ID NO：19和20的一對(duì)引物作為引物對(duì)用于擴(kuò)增具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的對(duì)照基因，并且，SEQ ID NO：21的寡核苷酸作為探針用于檢測(cè)具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列的對(duì)照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。而且，SEQ ID NO：22和23的一對(duì)引物作為引物對(duì)用于擴(kuò)增具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的對(duì)照基因，并且，SEQ ID NO：24的寡核苷酸作為探針用于檢測(cè)具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列的對(duì)照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明提供一種為診斷胎兒染色體非整倍性提供信息的試劑盒，所述試劑盒包括：

(a)從孕婦血液中提取DNA的器件；

(b)根據(jù)大小分級(jí)DNA，以獲得具有1,000bp或更小的DNA的器件；

(c)使用步驟(b)獲得的DNA為染色體上與染色體異常無(wú)關(guān)的對(duì)照基因和染色體上與染色體非整倍性相關(guān)的靶基因進(jìn)行數(shù)字PCR的器件；

(d)計(jì)算靶基因的定量數(shù)字PCR值與對(duì)照基因的定量數(shù)字PCR值的比率的器件；和

(e)當(dāng)步驟(d)中計(jì)算的比例為0.70-1.14時(shí)，顯示胎兒的染色體數(shù)目是正常的器件。

在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明所述方法和試劑盒用于非診斷目的。

在下文中，本發(fā)明所述方法的每一步驟會(huì)詳細(xì)地描述。

附圖說(shuō)明

圖1顯示了21號(hào)、1號(hào)、2號(hào)染色體上各自的靶基因或?qū)φ栈虻幕蜃?/p>

圖2顯示了在正?；蛱剖暇C合征細(xì)胞上進(jìn)行數(shù)字PCR，并且將靶基因的定量數(shù)字PCR值相對(duì)于對(duì)照基因的定量數(shù)字PCR值標(biāo)準(zhǔn)化得到的結(jié)果。

圖3顯示了對(duì)懷有正常胎兒或唐氏綜合征胎兒的婦女的羊水樣本進(jìn)行數(shù)字PCR，并且將靶基因的定量數(shù)字PCR值相對(duì)于對(duì)照基因的定量數(shù)字PCR值標(biāo)準(zhǔn)化所得的結(jié)果。

圖4顯示了根據(jù)片段化顆粒大小對(duì)DNA樣本分級(jí)所得的結(jié)果，所述DNA樣本包含1：1的長(zhǎng)DNA(LD)和短DNA(SD)的混合物，并且根據(jù)加入DNA樣本的第一磁珠(珠A)的量分析LD是如何除去的。

圖5顯示了使用APP基因，通過(guò)定量來(lái)自孕婦血液樣本的胎兒DNA和孕婦DNA的比率所得結(jié)果。

圖6顯示了在gDNA樣本上進(jìn)行數(shù)字PCR所得結(jié)果，所述樣本含有以不同比例混合的正常gDNA和唐氏綜合征gDNA，并且計(jì)算了唐氏綜合征基因與正?；虻谋嚷省?/p>

圖7顯示了從懷有正?；蛱剖暇C合征胎兒(T21)的孕婦血漿中提取的cfDNA的所得結(jié)果，根據(jù)片段化顆粒大小對(duì)提取的DNA進(jìn)行分級(jí)，在DNA上進(jìn)行數(shù)字PCR，并且將靶基因的定量數(shù)字PCR值相對(duì)于對(duì)照基因的定量數(shù)字PCR值作標(biāo)準(zhǔn)化。

具體實(shí)施方式

在下文中，將進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)地知道這些實(shí)施例僅僅作為示例性目的，并不意圖限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：對(duì)照基因和靶基因的選取，以及引物對(duì)和探針的設(shè)計(jì)

為了進(jìn)行胎兒基因的遺傳分析，例如，諸如三體性等基因異常的分析，選取21號(hào)染色體(由于三體性引起唐氏綜合征)作為靶染色體，選取1號(hào)染色體和2號(hào)染色體作為對(duì)照染色體。然后，為了基因檢測(cè)，選取21號(hào)染色體上的四個(gè)區(qū)域的基因作為靶基因，選取1號(hào)染色體上的一個(gè)區(qū)域的基因和2號(hào)染色體上一個(gè)區(qū)域的基因作為對(duì)照基因。根據(jù)這些基因，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增各基因的引物對(duì)和能夠確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的熒光標(biāo)記探針。這些引物和探針?lè)謩e由Bioneer Co.,Ltd.(大田,韓國(guó))和Thermo Fisher Scientific(美國(guó))合成。21號(hào)染色體、1號(hào)染色體和2號(hào)染色體上所選取的區(qū)域如圖1所示，上述引物對(duì)和探針的序列和設(shè)計(jì)如下表1和表2所示。

表1

表2

實(shí)施例2：對(duì)于正常或唐氏綜合征細(xì)胞的數(shù)字PCR

正常的或唐氏綜合征(T21)的gDNA購(gòu)自Coriell，以獲得正常或唐氏綜合征(T21)gDNA的數(shù)字PCR結(jié)果數(shù)值。

使用gDNA作為模板，使用QX200數(shù)字PCR系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó))進(jìn)行數(shù)字PCR。為了建立用于數(shù)字PCR的樣本的合適濃度，在實(shí)驗(yàn)中將gDNA樣本逐級(jí)稀釋1-5000倍。制備20μl的含有0.5-1.0μM引物和0.1-0.25μM探針的反應(yīng)溶液作為數(shù)字PCR的預(yù)混液(master mix)，調(diào)節(jié)至2-10ng的樣品注射濃度(參見(jiàn)下表3)，并分配到各PCR管中。將含有該溶液的PCR管安裝在DG8微滴發(fā)生器筒中，然后將20μl樣品分配到樣品孔中，并將70μl微滴發(fā)生器油(墊圈(Gasket))分配到油孔中。接下來(lái)，將墊圈安裝在筒中，然后使用QX200微滴發(fā)生器進(jìn)行微滴產(chǎn)生反應(yīng)。將所產(chǎn)生的微滴分配到96孔PCR板上，然后在下表4所示的溫度條件下進(jìn)行PCR。

表3

表4

反應(yīng)完成后，將每個(gè)孔安裝在QX200微滴分析儀上，并且分析各探針的每μl拷貝數(shù)。使用各探針的每μl拷貝數(shù)，計(jì)算相對(duì)于各對(duì)照基因(SEQ ID NO:5或6)的定量數(shù)字PCR值作標(biāo)準(zhǔn)化的靶基因(SEQ ID NO:1至4)的定量數(shù)字PCR值。所得結(jié)果示于圖2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常體細(xì)胞樣本(n＝4)的計(jì)算比例值分別為1.1714、1.0256、1.0821和1.0255，其平均值為1.08，并且唐氏綜合征(T21)體細(xì)胞樣本(n＝4)的計(jì)算比例值分別為2.1000、1.4388、1.3611和1.1387，其平均值為1.51。因此，可以看出，唐氏綜合征樣本的計(jì)算值約為正常樣本的1.5倍。

實(shí)施例3：懷有正常或唐氏綜合征胎兒的孕婦的羊水樣本的數(shù)字PCR

從懷有正?；蛱剖暇C合征(T21)胎兒的孕婦的羊水樣品中提取胎兒cfDNA。使用胎兒cfDNA作為模板樣本，進(jìn)行數(shù)字PCR。

首先，使用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒(Qiagen目錄號(hào)55114，凱杰公司，德國(guó))，從細(xì)胞中提取gDNA。根據(jù)制造商的手冊(cè)進(jìn)行g(shù)DNA提取。具體地，將細(xì)胞用蛋白裂解緩沖液裂解，并將100μl蛋白酶K加入到50ml離心管中，以除去蛋白質(zhì)組分，從而提高樣品純度。然后，向含有蛋白酶K，含有1.0μg載體RNA的ACL緩沖液的50ml離心管中，隨后渦旋混合細(xì)胞裂解物與ACL緩沖液。將混合物在60℃下培養(yǎng)30分鐘，然后將3.6ml ACB緩沖液(裂解物緩沖液)加入離心管，隨后渦旋以獲得ACB緩沖液混合物，然后將其在冰上溫育5分鐘。

為提高提取的gDNA的產(chǎn)量，使用真空泵系統(tǒng)以提高QIAamp循環(huán)核酸試劑盒的柱上存在的膜的吸附能力。使用真空泵系統(tǒng)，使得ACB緩沖液混合物流入配備有20ml管延伸器的QIAamp Mini柱。在操作真空泵系統(tǒng)以允許ACB緩沖液混合物流動(dòng)之后，將真空泵系統(tǒng)的值調(diào)節(jié)至0，并且移除管延伸器。將最大可能量的反應(yīng)材料通過(guò)該過(guò)程結(jié)合到QIAamp Mini柱的膜上。然后，通過(guò)操作真空泵系統(tǒng)，將600μl的ACW1緩沖液流入QIAamp Mini柱，所述ACW1緩沖液是用于洗滌結(jié)合至QIAamp Mini柱上的反應(yīng)材料的第一緩沖液，然后，將真空泵系統(tǒng)的值調(diào)整至0，移除管延伸器。結(jié)合至QIAamp Mini柱的DNA通過(guò)該過(guò)程被洗滌。除此之外，進(jìn)行第二次洗滌操作以得到高純度的DNA。通過(guò)操作真空泵系統(tǒng)，將750μl作為第二緩沖液的ACW2緩沖液流入QIAamp Mini柱，然后將真空泵系統(tǒng)的值調(diào)整至0，移除管延伸器。結(jié)合至QIAamp Mini柱的DNA通過(guò)該過(guò)程進(jìn)一步被洗滌以得到高純度的DNA。

通過(guò)操作真空泵系統(tǒng)，使作為最終洗滌溶液的750μl的乙醇(96％至100％)流至QIAamp Mini柱，然后將真空泵系統(tǒng)的值調(diào)整至0，移除管延伸器。此外，通過(guò)干燥在最大可能范圍內(nèi)除去乙醇組分，從而提高提取的DNA的純度，然后關(guān)閉QIAamp Mini柱，然后在20,000g和14,000rpm下離心3分鐘。打開QIAamp Mini柱，隨后在56℃下干燥10分鐘。此后，向QIAamp Mini柱中加入20μl的AVE緩沖液，隨后在室溫下培育3分鐘，隨后關(guān)閉QIAamp Mini柱，之后在20,000g和14,000rpm下離心1分鐘。因此，得到了來(lái)自于正常體細(xì)胞或唐氏綜合征(T21)體細(xì)胞的各個(gè)相應(yīng)的cfDNA樣本。

在實(shí)施例2描述的相同條件下，采用相同方法，進(jìn)行各樣本的數(shù)字采樣。結(jié)果示于圖3。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，懷有正常胎兒的孕婦羊膜樣本(n＝4)的計(jì)算比例值分別為1.1991、1.0574、1.0006和0.9560，因此其平均值為1.05，并且，懷有唐氏綜合征(T21)胎兒的孕婦羊膜樣本(n＝4)的計(jì)算比例值分別為1.6584、1.6954、1.4886和1.5062，因此其平均值為1.59。因此，可以看出，唐氏綜合征樣品的計(jì)算比率約為正常樣品的1.5倍，并且該結(jié)果值與使用正?；蛱剖暇C合征細(xì)胞作為樣品進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果值相似。

實(shí)施例4：以不同比例的SPRIselsect磁珠根據(jù)片段化顆粒大小對(duì)DNA進(jìn)行分級(jí)的驗(yàn)證

因?yàn)樘篋NA在大小上小于孕婦DNA，選擇根據(jù)DNA長(zhǎng)度提取cfDNA的方法以提高顯示短長(zhǎng)度(bp)的胎兒cfDNA的信息反映率(reflection rate)。為了構(gòu)建具有不同大小的DNA，根據(jù)制造商手冊(cè)，使用Ion Shear^TM Plus Reagents Kit(目錄號(hào)4471252,Thermo Fisher Scientific)，gDNA在兩個(gè)條件下片段化(大長(zhǎng)度和短長(zhǎng)度；5和15分鐘)。根據(jù)制造商手冊(cè)，使用SPRIselsect試劑盒(Beckman Coulter,德國(guó))根據(jù)片段化顆粒大小進(jìn)行g(shù)DNA分級(jí)?，F(xiàn)在將詳細(xì)描述。

首先，將含gDNA的樣本和磁珠(稱為“珠A”)彼此混合，使得長(zhǎng)DNA(LD)可首先吸附到磁珠上。隨后，使用磁鐵分離珠子，然后將保留在上清液中而未被吸附到珠子上的DNA轉(zhuǎn)移到新管中，并向管中加入新鮮珠子(稱為“珠B”)，以提取剩余的DNA(短DNA(SD))。在各管中從珠A和珠B中提取吸附的DNA。

對(duì)于含有根據(jù)上述方法以1:1比例混合的LD和SD的DNA樣本，根據(jù)加入DNA樣本中的珠A的量分析LD是怎樣除去的。分析結(jié)果示于圖4。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)加入相當(dāng)于DNA樣品的0.5倍的量的珠A時(shí)，珠A和珠B都不影響DNA大小的鑒別。然而，可以看出，當(dāng)加入相當(dāng)于DNA樣品的0.75倍的量的珠A時(shí)，珠A吸附具有400bp或更大長(zhǎng)度的DNA，珠B吸附具有500bp或更短長(zhǎng)度的DNA，當(dāng)加入相當(dāng)于DNA樣品的1.0倍的量的珠A時(shí)，珠A吸附具有200bp或更大長(zhǎng)度的DNA，珠B吸附具有300bp或更短長(zhǎng)度的DNA，當(dāng)加入相當(dāng)于DNA樣品的1.25倍的量的珠A時(shí)，珠A吸附具有150bp或更大長(zhǎng)度的DNA，珠B吸附具有200bp長(zhǎng)度的DNA。這表明，隨著珠A的添加量的增加，除去的LD的量也增加。考慮到胎兒cfDNA的長(zhǎng)度約為150bp或更小，可以確定，加入到DNA樣本中用于濃縮胎兒cfDNA的珠A的比率優(yōu)選0.75-1.25，更優(yōu)選地為DNA樣本的0.75-1.0倍。

實(shí)施例5：定量測(cè)定來(lái)自孕婦血液樣本的胎兒DNA和孕婦DNA的比例

眾所周知，孕婦的血液或血漿中的胎兒DNA的尺寸小于孕婦的DNA。因此，當(dāng)具有相對(duì)較小尺寸的胎兒DNA和具有較大尺寸的孕婦DNA通過(guò)與特定基因有關(guān)的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增時(shí)，可以定量存在于孕婦的血液或血漿中的與特定基因相關(guān)的胎兒DNA和孕婦的DNA，并且可以計(jì)算這些基因的數(shù)量的比例。

因此，在本實(shí)施例中，APP(淀粉樣前體蛋白)基因(GenBank登錄號(hào)NM_000484)和β-肌動(dòng)蛋白基因是在孕婦血液或血漿中的胎兒DNA和孕婦DNA中通常存在的特異性基因。另外，設(shè)計(jì)了能夠擴(kuò)增與APP基因和β-肌動(dòng)蛋白基因相關(guān)的胎兒DNA和孕婦DNA的引物對(duì)，以及能夠確認(rèn)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的熒光標(biāo)記探針(參見(jiàn)下表5)。

表5

供參考，在上表5中，為了通過(guò)實(shí)時(shí)PCR定量地比較胎兒DNA與孕婦DNA以評(píng)價(jià)這些基因數(shù)量的比例，鑒于以下事實(shí)設(shè)計(jì)了引物對(duì)：胎兒DNA的大小小于孕婦DNA的大小。特別地，如上表5所示，為了準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)孕婦基因的數(shù)量和胎兒基因的數(shù)量，并且在定量評(píng)估中標(biāo)準(zhǔn)化分析條件，將用于胎兒DNA和孕婦DNA的一組短擴(kuò)增子，以及孕婦DNA的一組長(zhǎng)擴(kuò)增子的檢測(cè)探針和正向引物設(shè)計(jì)成一樣的，，而將反向引物設(shè)計(jì)成不同的。另外，為了確認(rèn)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并定量分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用熒光物質(zhì)和淬滅物質(zhì)雙重標(biāo)記每個(gè)檢測(cè)探針。在本實(shí)施例中，用熒光物質(zhì)FAM標(biāo)記每個(gè)檢測(cè)探針的5’端，并用猝滅物質(zhì)TAMRA標(biāo)記3’端。

如上表5所示，在APP靶基因的情況下，從SEQ ID NO：25和26所示引物對(duì)獲得來(lái)自胎兒DNA和孕婦DNA的短擴(kuò)增子(67bp長(zhǎng)度)，以及從SEQ ID NO：25和27所示引物對(duì)獲得來(lái)自孕婦DNA的長(zhǎng)擴(kuò)增子(180bp長(zhǎng)度)。

使用本實(shí)施例中采用的短長(zhǎng)度DNA濃縮方法，從懷有正常胎兒的孕婦體內(nèi)獲得cfDNA，并進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR以測(cè)量SD與LD的比率。在本實(shí)施例中，使用7900HT快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Life Technologies，美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。

如下表6所示制備包含APP基因的各引物對(duì)和檢測(cè)探針、如上所述制備的DNA模板以及實(shí)時(shí)PCR預(yù)混液的實(shí)時(shí)PCR組合物，并且，在以下表7所示的實(shí)時(shí)PCR條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。同時(shí)，PCR擴(kuò)增組合物的PCR預(yù)混液由，例如，PCR緩沖液、dNTP、DNA聚合酶等組成，并且，在該實(shí)施例中，使用TaqMan通用預(yù)混液II,無(wú)UNG(Life Technologies,目錄號(hào)4440040)作為實(shí)時(shí)PCR的預(yù)混液。每當(dāng)重復(fù)一次實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，在FAM波長(zhǎng)下測(cè)量熒光，并使用SDS軟件分析每個(gè)反應(yīng)循環(huán)的熒光強(qiáng)度。對(duì)于每個(gè)樣品，總結(jié)了APP基因的實(shí)時(shí)PCR定量結(jié)果，并且將短擴(kuò)增子(67bp長(zhǎng)度)的量除以長(zhǎng)擴(kuò)增子(180bp長(zhǎng)度)的量，并示于圖5。

表6

表7

實(shí)施例6：對(duì)包含正?；蛱剖暇C合征gDNA混合物的樣本進(jìn)行數(shù)字PCR

將正常gDNA和唐氏綜合征gDNA以不同比例彼此混合以制備gDNA混合物。使用各gDNA混合物作為模板，使用如上表2所示的引物和探針進(jìn)行數(shù)字PCR，計(jì)算唐氏綜合征基因數(shù)量與正?；驍?shù)量的比率。計(jì)算結(jié)果示于圖6中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著添加的唐氏綜合征gDNA的百分比的下降，唐氏綜合征基因數(shù)量與正常基因數(shù)量之比接近1。特別地，結(jié)果表明，當(dāng)關(guān)于唐氏綜合征基因的信息反映率低至低于10％時(shí)，該比率接近正常值(1.1或更低)。考慮到孕婦血液中只有約3-13％的cfDNA通常是胎兒cfDNA，可以看出，從孕婦血液中提取的cfDNA本身用于進(jìn)行產(chǎn)前診斷，診斷的準(zhǔn)確性非常低。

實(shí)施例7：根據(jù)片段化顆粒大小和對(duì)cfDNA進(jìn)行的數(shù)字PCR，對(duì)提取自孕婦血液的cfDNA進(jìn)行分級(jí)

以下列方式，從懷有正?；蛱剖暇C合征(T21)的胎兒的孕婦血漿中提取cfDNA。

首先，使用MagMAX^TM無(wú)細(xì)胞DNA提取試劑盒(MagMAX^TM Cell-Free DNA Isolation Kit(目錄號(hào)A29319,Thermo Fisher Scientific))，從血漿中提取cfDNA。根據(jù)制造商的手冊(cè)使用2mL血漿進(jìn)行cfDNA提取。

通過(guò)實(shí)施例4的方法根據(jù)片段化顆粒大小對(duì)提取的cfDNA進(jìn)行分級(jí)。使用含有所得SD區(qū)域的各樣本作為模板，進(jìn)行數(shù)字PCR。從各樣本的結(jié)果值，計(jì)算靶基因與對(duì)照基因的比例。計(jì)算結(jié)果示于圖7中。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常樣本(n＝3)的計(jì)算比例分別為1.04、1.08和0.98，但是唐氏綜合征樣本(n＝3)的計(jì)算比例分別為1.31和1.15(對(duì)于兩個(gè)樣本)。在使用根據(jù)片段化顆粒大小由DNA獲得的SD區(qū)域進(jìn)行數(shù)字PCR的情況下，可以確定的是，當(dāng)靶基因與對(duì)照基因的計(jì)算比例為0.70-1.14時(shí)，胎兒的染色體數(shù)目是正常的，更優(yōu)選地，當(dāng)計(jì)算比例為0.95-1.10時(shí)，胎兒的染色體數(shù)目是正常的。除此之外，可以確定的是，當(dāng)計(jì)算比例為0.10-0.69或1.15-1.80時(shí)，胎兒的染色體數(shù)目是異常的，更優(yōu)選地，當(dāng)計(jì)算比例為0.45-0.69或1.15-1.31時(shí)，胎兒的染色體數(shù)目是異常的。

如上所述，采用本發(fā)明的數(shù)字PCR進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法，使用非侵入性的取樣方法，因此對(duì)孕婦和胎兒都是安全的。另外，本發(fā)明的方法使得能夠穩(wěn)定分離少量胎兒基因的信號(hào)與孕婦基因的背景信號(hào)，因此提高了胎兒基因信息的準(zhǔn)確性。因此，可以預(yù)期本發(fā)明的方法對(duì)于胎兒遺傳疾病的早期診斷是非常有用的。

盡管本發(fā)明結(jié)合具體特征進(jìn)行了詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知曉，這種描述僅僅是其一種優(yōu)選實(shí)施方式，并不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍將由附加的權(quán)利要求及其等同范圍所限制。

序列表

<110> 博康有限公司

<120> 使用數(shù)字PCR的產(chǎn)前診斷方法

<130> P2016-1693

<150> KR 10-2015-0151313

<151> 2015-10-29

<150> KR 10-2016-0133529

<151> 2016-10-14

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶基因

<400> 1

ctgcagttct ttgtgaacac tctcatttgt tgtatctgta ggctgtctct ctcagtggta 60

aatgccttcg tgtgtttgta atgctgatgg ttacttgagg taaataagaa tgtaccactt 120

ggctcagtgt gcatgatgta agcttgtctt tgttgtatgt tggct 165

<210> 2

<211> 161

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶基因

<400> 2

tgactatcac atgtctttgg ttgtaaactg ctgtgatagt taccctaagt aatgggacag 60

gagatgaacc cacccattaa ataacacagc aattaagcag ccacttttag aaaaatttaa 120

atgtgtggct tcgagttggg tacttgcatg tacagcttac t 161

<210> 3

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶基因

<400> 3

cccaggctat gctagaaggt atgcttacaa ttggaaaagt gtaggcagat aacattaaat 60

ggcaatagca tgtgtaaact aactgcaaat gaggaaaagg acattctaaa gacaggat 118

<210> 4

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 靶基因

<400> 4

ggaccagagg tttattggag gtctaaatat ttatggagag caatgatggc taattttaga 60

aaccattagg ttgctatttt taaacgtgtg ctataaggat ttgctaattt 110

<210> 5

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)照基因

<400> 5

gaggaagcaa ctagaaaaca atggaaggga cttcagatgg taaggtttct gtttagtact 60

tatttcaatt ttaggcctcc tgaatagtag aggtggtgac aggaggatac ctgaaacctt 120

ggttata 127

<210> 6

<211> 112

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)照基因

<400> 6

gggaacatcc caggttcagt aaaaatacag agtatttgcg ttaaactgga cctcagtggg 60

gatgtgatgg gaggtatgag acagattgtg cccttatcct tttctcttct tg 112

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

cgtgtgtttg taatgctgat ggt 23

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

catcatgcac actgagccaa gt 22

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 9

acttgaggta aataagaatg tac 23

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

ccctaagtaa tgggacagga gatg 24

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

aagtggctgc ttaattgctg tgt 23

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 12

acccacccat taaat 15

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

tgctagaagg tatgcttaca attgga 26

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

tcatttgcag ttagtttaca catgct 26

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 15

aagtgtaggc agataac 17

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gaccagaggt ttattggagg tctaaat 27

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cacgtttaaa aatagcaacc taatgg 26

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 18

tttatggaga gcaatgat 18

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

caactagaaa acaatggaag ggactt 26

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

tcaggaggcc taaaattgaa ataag 25

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 21

agatggtaag gtttctgttt ag 22

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

catcccaggt tcagtaaaaa tacaga 26

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

ctgtctcata cctcccatca catc 24

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 24

tatttgcgtt aaactggacc 20

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

tcaggttgac gccgctgt 18

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

ttcgtagccg ttctgctgc 19

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

tctataaatg gacaccgatg ggtagt 26

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 28

accccagagg agcgccacct g 21

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

tacaggaagt cccttgccat 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

cctgtgtgga cttgggagag 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

cacgaaggct catcattcaa 20

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 32

cccacttctc tctaaggaga atggccc 27

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

agagctacga gctgcctgac 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

ccatctcttg ctcgaagtcc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

ggcaggactt agcttccaca 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探針

<400> 36

ttccgctgcc ctgaggcact 20