本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒。
背景技術(shù)：
：肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，發(fā)病率仍持續(xù)升高，成為我國第二位癌癥死亡原因。腫瘤切除或肝移植是目前最有效的治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，5年生存率僅為5％左右。多數(shù)患者只有在轉(zhuǎn)移病灶引起異常癥狀或者影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶時(shí)才確診轉(zhuǎn)移發(fā)生，錯(cuò)失了治療的最佳時(shí)機(jī)，因此，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已成為阻礙HCC病人長期生存的關(guān)鍵。肝癌細(xì)胞具有容易侵犯血管的特性，極易造成癌細(xì)胞的血行播散。部分肝癌病人在肝癌切除或肝移植前，已有腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血循環(huán)系統(tǒng)中，入血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTCs)是導(dǎo)致肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的首要條件。腫瘤細(xì)胞在進(jìn)入外周血循環(huán)的過程中可能發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(ETM，Epithelial-mesenchymalTransition)，EMT過程中，除了細(xì)胞形態(tài)和移動(dòng)性發(fā)生改變外，細(xì)胞基因表達(dá)譜特別是上皮、間質(zhì)分子標(biāo)志物及其轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也發(fā)生改變，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞間黏附改變，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。根據(jù)CTCs抗原標(biāo)志物的差異，目前CTCs主要可分為上皮標(biāo)志物陽性表型(簡稱上皮細(xì)胞型)、間質(zhì)標(biāo)志物陽性表型(簡稱間質(zhì)細(xì)胞型)和上皮與間質(zhì)混合表型(簡稱上皮-間質(zhì)細(xì)胞型)等。不同類型CTCs具有不同的遷移和侵襲能力。因此，對(duì)肝癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分型對(duì)肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)監(jiān)測以及預(yù)后等具有重要意義。雖然CTCs檢測在其他癌癥，包括乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌等中得到較廣泛的應(yīng)用，但在肝癌中的研究較少，國內(nèi)外均沒有穩(wěn)定的用于肝癌患者CTCs鑒定和分型的產(chǎn)品。與其他癌癥類型一樣，目前肝癌患者CTCs的鑒定和分型主要依賴于通用CTCs上皮和間質(zhì)型標(biāo)志物分子的檢測，由于外周血中可能存在一定數(shù)量的非腫瘤性上皮細(xì)胞，且采血可能造成正常上皮細(xì)胞污染血樣，加上一些上皮和間質(zhì)型標(biāo)志物在不同癌癥類型中表達(dá)存在差異，從而會(huì)導(dǎo)致一些假陽性和假陰性的檢測結(jié)果。因此，急需一種能提高現(xiàn)有CTCs檢測和分型準(zhǔn)確度的檢測方法，實(shí)現(xiàn)肝癌患者CTCs的精確鑒定與分型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確度高的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒，包括針對(duì)每種標(biāo)志基因mRNA的捕獲探針、擴(kuò)增探針和標(biāo)記探針，所述標(biāo)志基因mRNA包括有三類：選自AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的至少兩種的肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA，選自KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的至少一種的上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA，選自AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的至少一種的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA；其中，所述捕獲探針連接標(biāo)志基因mRNA與擴(kuò)增探針，每條捕獲探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：與待檢測的標(biāo)志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、P2序列，所述P2序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P4和標(biāo)志基因mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列，針對(duì)同一類別的標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列相同；每條擴(kuò)增探針從5’端到3’端的堿基組成依次為：能與相應(yīng)捕獲探針的P2序列互補(bǔ)配對(duì)的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4序列為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；每條標(biāo)記探針具有與相應(yīng)擴(kuò)增探針P4序列互補(bǔ)配對(duì)的P5序列，且末端修飾有熒光基團(tuán)，不同細(xì)胞種類標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述標(biāo)志基因mRNA還包括有針對(duì)白細(xì)胞標(biāo)志基因的mRNA的一類，所述白細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)镃D45，使用白細(xì)胞標(biāo)志基因，有助于進(jìn)一步區(qū)分白細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，排除白細(xì)胞對(duì)檢測結(jié)果的干擾。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA捕獲探針中：針對(duì)AFP基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.1～SEQIDNO.10中的2條或2條以上，針對(duì)AST基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.11～SEQIDNO.20中的2條或2條以上，針對(duì)ALT基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.21～SEQIDNO.30中的2條或2條以上，針對(duì)DCP基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.31～SEQIDNO.40中的2條或2條以上，針對(duì)GGT基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.41～SEQIDNO.50中的2條或2條以上，針對(duì)GPC3基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.51～SEQIDNO.60中的2條或2條以上，針對(duì)GP73基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.61～SEQIDNO.70中的2條或2條以上，針對(duì)OPN基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.71～SEQIDNO.80中的2條或2條以上；針對(duì)肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.181；所述肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.185，P4序列為SEQIDNO.189。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA捕獲探針中：針對(duì)KRT7基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.81～SEQIDNO.90中的2條或2條以上，針對(duì)KRT8基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.91～SEQIDNO.100中的2條或2條以上，針對(duì)KRT17基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.101～SEQIDNO.110中的2條或2條以上，針對(duì)KRT18基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.111～SEQIDNO.120中的2條或2條以上，針對(duì)KRT19基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.121～SEQIDNO.130中的2條或2條以上；針對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.182；所述上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.186，P4序列為SEQIDNO.190。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA捕獲探針中：針對(duì)AKT2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.131～SEQIDNO.140中的2條或2條以上，針對(duì)HIF-1A基因特異性序列P1選自SEQIDNO.141～SEQIDNO.150中的2條或2條以上，針對(duì)SNAI1基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.151～SEQIDNO.160中的2條或2條以上，針對(duì)ZEB2基因的特異性序列P1選自SEQIDNO.161～SEQIDNO.170中的2條或2條以上；針對(duì)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.183；所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.187，P4序列為SEQIDNO.191。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述白細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA捕獲探針中：針對(duì)CD45基因特異性序列P1的選自SEQIDNO.171～SEQIDNO.180中的2條或2條以上；針對(duì)白細(xì)胞標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列為SEQIDNO.184；所述白細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA擴(kuò)增探針中，P3序列為SEQIDNO.188，P4序列為SEQIDNO.192。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述間隔臂序列為5－10個(gè)T。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光基團(tuán)選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，且針對(duì)不同細(xì)胞種類標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：(1)本發(fā)明在各種類型癌癥通用CTCs上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的基礎(chǔ)上增加了肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因的檢測，避免了血液中非腫瘤上皮細(xì)胞及采樣過程引入正常上皮細(xì)胞等因素造成的假陽性結(jié)果，確保檢測到上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和/或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的細(xì)胞為肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。(2)本發(fā)明所選擇的肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因，是發(fā)明人經(jīng)過大量試驗(yàn)進(jìn)行綜合評(píng)估、統(tǒng)計(jì)分析篩選得出的在肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞上特異表達(dá) 的基因。本發(fā)明標(biāo)志基因的選取，除了能實(shí)現(xiàn)單個(gè)標(biāo)志基因的檢測外，更與其它標(biāo)志基因一起使用，從而能夠最全面地檢測出肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞，并區(qū)分其細(xì)胞類型，解決了CTCs在不同癌癥類型之間由于某些標(biāo)志基因表達(dá)水平的差異以及EMT過程中丟失某些標(biāo)志抗原而造成假陰性結(jié)果，進(jìn)一步提高檢測的準(zhǔn)確性。(3)本發(fā)明所述鑒定方法采用多重RNA探針，能夠同時(shí)標(biāo)記多種肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因及CTCs特異性基因，并將CTCs分型為I型(上皮型)、II型(上皮-間質(zhì)混合型)及III型(間質(zhì)型)，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，特別的，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各種探針，能夠在均一的反應(yīng)條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)，且各種探針之間基本不存在非特異性結(jié)合；所設(shè)計(jì)的探針在檢測中特異性好、信噪比高。同時(shí)，多種探針的組合使用使鑒定試劑盒和檢測方法形成一個(gè)檢測效果完好的系統(tǒng)。(4)RNA原位雜交方法本身具有熒光信號(hào)靈敏度低的缺點(diǎn)，但是本發(fā)明采用新型的RNA原位雜交方法，通過信號(hào)放大體系提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。本發(fā)明檢測流程能夠在8h內(nèi)完成，單一拷貝的mRNA雜交探針通過信號(hào)放大系統(tǒng)，與相應(yīng)的熒光探針結(jié)合，顯著提高RNA原位雜交的檢測靈敏度。本發(fā)明使用的是探針的多位點(diǎn)特異配對(duì)、級(jí)聯(lián)放大的方式來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，而不是PCR擴(kuò)增的方法，提高了檢測信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了檢測的特異性，避免了逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的假陽性。附圖說明圖1是本發(fā)明陽性肝癌CTC鑒定結(jié)果示意圖；圖2是本發(fā)明陽性肝癌CTC分型結(jié)果示意圖。具體實(shí)施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本文所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所用到的各種常用化學(xué)試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任 意的和所有的組合。本發(fā)明涉及了肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定方法，主要包括以下步驟：(1)得到去除紅細(xì)胞后的生物體液樣本；(2)過濾，在濾膜上富集肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞，通過透化處理，消化細(xì)胞，使mRNA暴露；(3)檢測肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA是否存在，所述肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的兩個(gè)或兩個(gè)以上，所述上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的一個(gè)或一個(gè)以上；所述間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的一個(gè)或一個(gè)以上。所述檢測肝癌標(biāo)志基因mRNA、和上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA是否存在，包括以下步驟：(3.1)每種標(biāo)志基因的捕獲探針特異性序列P1與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)mRNA序列結(jié)合；每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的標(biāo)志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與對(duì)應(yīng)標(biāo)志基因的擴(kuò)增探針的P3互補(bǔ)配對(duì)的P2序列；所述P2為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P4和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.2)捕獲探針的P2序列與擴(kuò)增探針的P3序列特異性結(jié)合；所述擴(kuò)增探針堿基序列從5’端到3’端依次為：能與捕獲探針P2互補(bǔ)配對(duì)的P3序列、間隔臂序列、P4序列；所述P4分別為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.3)所述擴(kuò)增探針的P4序列與帶有熒光基團(tuán)修飾的標(biāo)記探針的P5序列特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大；不同細(xì)胞種類標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同；(3.4)通過熒光檢測儀檢測。所述檢測肝癌標(biāo)志物基因mRNA、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA是否存在，還可以包括以下步驟：(3.1)每種標(biāo)志基因的捕獲探針的特異性序列P1與對(duì)應(yīng)的目標(biāo)mRNA序列特異性結(jié)合；每條捕獲探針的堿基序列從5’端到3’端依次為與待檢測的標(biāo)志基因mRNA結(jié)合的特異性序列P1、間隔臂序列、能與對(duì)應(yīng)標(biāo)志基因的擴(kuò)增探針的P3互補(bǔ)配對(duì)的P2序列；所述P2為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P4和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.2)捕獲探針的P2序列與帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記的擴(kuò)增探針的P3序列結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的放大；所述擴(kuò)增探針堿基序列從5’端到3’端依次為：能與捕獲探針P2互補(bǔ)配對(duì)的P3序列、間隔臂序列、P4序列，每條擴(kuò)增探針的3’端還修飾有熒光基團(tuán)，不同細(xì)胞種類標(biāo)志基因的熒光基團(tuán)互不相同；所述P4為不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯(cuò)配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結(jié)合的序列；(3.3)通過熒光檢測儀檢測。實(shí)施例1本實(shí)施例所述的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒，有兩種類型，具有標(biāo)記探針的與不具有標(biāo)記探針。其中，具有標(biāo)記探針的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒A，主要包括有：一、捕獲探針捕獲探針由三部分組成，5’端至3’端依次是與對(duì)應(yīng)的標(biāo)志基因的mRNA互補(bǔ)配對(duì)的序列P1，間隔臂序列，與對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增探針P3序列互補(bǔ)配對(duì)的P2序列，同一類別的標(biāo)志基因其捕獲探針中的P2序列相同。所述間隔臂為用于將捕獲探針P2序列與目標(biāo)mRNA間隔開來，通過在探針內(nèi)部設(shè)置適當(dāng)長度的間隔臂序列，可減少空間位阻，提高雜交反應(yīng)的效率以及雜交反應(yīng)的特異性。本發(fā)明捕獲探針的間隔臂優(yōu)選為5－10個(gè)T，本實(shí)施例優(yōu)選為5個(gè)T。每個(gè)標(biāo)志基因分別設(shè)計(jì)10條捕獲探針，以提高檢測的特異性。(具體使用時(shí)，針對(duì)每種目標(biāo)基因，選擇2條或2條以上捕獲探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都很好，可參考實(shí)施例8)，本實(shí)施例優(yōu)選為使用10條捕獲探針，以使特異性達(dá)到最好。針對(duì)相應(yīng)的標(biāo)志基因的捕獲探針見表1、不同類型的標(biāo)志基因的捕獲探針的P2序列見表2。表1目標(biāo)基因捕獲探針的P1序列表2標(biāo)志基因捕獲探針的P2序列二、擴(kuò)增探針擴(kuò)增探針是連接捕獲探針與信號(hào)檢測組分之間的序列，擴(kuò)增探針由三部分組成，5’端是能與捕獲探針P2序列互補(bǔ)配對(duì)的P3序列，間隔臂序列，3’端是能與標(biāo)記探針互補(bǔ)配對(duì)的P4序列(如不運(yùn)用標(biāo)記探針檢測時(shí)，則P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)，如試劑盒B)，中間是5個(gè)寡聚核苷酸T的間隔臂序列(本發(fā)明的擴(kuò)增探針間隔臂優(yōu)選為5－10個(gè)T，本實(shí)施例優(yōu)選為5個(gè)T)。標(biāo)志基因的擴(kuò)增探針的P3序列見表3。所述P4序列內(nèi)部不存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，探針內(nèi)部和探針間都不形成二聚體、不存在錯(cuò)配，與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在非特異性結(jié)合的序列，本實(shí)施例P4序列優(yōu)選的堿基組成見表4。表3目標(biāo)基因的擴(kuò)增探針的P3序列表4目標(biāo)基因的擴(kuò)增探針的P4序列三、標(biāo)記探針標(biāo)記探針由兩部分組成，其5’端是能與擴(kuò)增探針P4序列互補(bǔ)結(jié)合的P5序列，3’端帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，通過與擴(kuò)增探針P4序列的結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)mRNA信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大。(當(dāng)檢測體系中使用標(biāo)記探針時(shí)，擴(kuò)增探針的P4序列3’端不帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，而由標(biāo)記探針的3’端帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，如試劑盒A)標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)可以選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，標(biāo)記探針的FL1、FL2、FL3和FL4選擇的熒光基團(tuán)互不相同，且 所選擇的熒光基團(tuán)的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同，以便于區(qū)分不同類型的標(biāo)志基因。本實(shí)施例標(biāo)記探針的熒光基團(tuán)標(biāo)記優(yōu)選如表5所示。表5標(biāo)記探針本實(shí)施例所述不具有標(biāo)記探針的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒B，主要包括有：一、捕獲探針：與上述具有標(biāo)記探針的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒中的捕獲探針相同。二、擴(kuò)增探針：與上述具有標(biāo)記探針的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒中的捕獲探針的序列相同，但P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)。所述P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)，具體為：針對(duì)肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL1，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL2，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL3，白細(xì)胞標(biāo)志基因檢測探針P4序列修飾的熒光基團(tuán)為FL4，所述熒光基團(tuán)選自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、TexasRed、LCRED640、Cy5、LCRED705、AlexaFluor488和AlexaFluor750，其中FL1、FL2、FL3和FL4對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)互不相同，即所對(duì)應(yīng)的熒光基團(tuán)的顏色互不相同或發(fā)射波長互不相同，以便于區(qū)分不同類型的標(biāo)志基因。本實(shí)施例標(biāo)志基因擴(kuò)增探針的P4序列的3’端的熒光基團(tuán)標(biāo)記優(yōu)選如表6所示。表6標(biāo)志基因的染料標(biāo)記實(shí)施例2運(yùn)用實(shí)施例1中的試劑盒A對(duì)肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測所述各種溶液的配方如下：本實(shí)施例中的探針混合液、擴(kuò)增混合液、顯色混合液均使用實(shí)施例1具有標(biāo)記探針的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒A相應(yīng)基因列表中的全部探針。一、樣本預(yù)處理，將肝癌CTCs過濾至濾膜上1.在樣本保存管中使用保存液保存血液樣本，600×g水平離心5min，棄上清，去除紅細(xì)胞。2.加入4mLPBS和1mL固定劑，渦旋混勻，室溫靜置8min。3.樣本過濾：將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中，打開真空抽濾泵抽盡液體；在樣本保存管中加入4mLPBS，洗滌管壁后抽濾液體。4.將濾膜轉(zhuǎn)移至24孔板中，加入400μl4％甲醛溶液，室溫固定1h。5.去除液體，每孔加入1mLPBS洗滌三次，每次浸泡2min。二、透化處理1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化劑，將濾膜從PBS中取出，濾膜片邊緣接觸吸水紙，去除多余的液體，將濾膜倒扣在透化劑上，即濾膜鐵圈刻有編碼的一面向下貼近液體。室溫孵育5min。2.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌兩次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。三、消化細(xì)胞，暴露mRNA，使其與探針雜交1.配制相應(yīng)濃度的消化酶工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量消化酶1.25μlPBS48.75μl總體積50μl2.消化酶工作液渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。室溫靜置1h。4.去除液體，每孔加入1mlPBS洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在PBS緩沖液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作。四、探針雜交，探針特異性序列與目標(biāo)mRNA序列結(jié)合1.探針緩沖液、擴(kuò)增緩沖液和顯色緩沖液使用前需40℃水浴預(yù)熱20min。2.配制探針工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量探針混合液8μl探針緩沖液(40℃預(yù)熱)42μl總體積50.0μl渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl。3.將濾膜取出，倒扣至24孔板中探針工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。4.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育3小時(shí)。5.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過30min。五、擴(kuò)增雜交，目標(biāo)mRNA序列信號(hào)放大1.配制擴(kuò)增工作液：試劑組分每個(gè)樣本用量擴(kuò)增混合液2μl擴(kuò)增緩沖液(40℃預(yù)熱)48μl總體積50.0μl渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中擴(kuò)增工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過30min。六、顯色，熒光標(biāo)記目標(biāo)信號(hào)1.配制顯色工作液避光渦旋混勻，分裝至24孔板中，每孔50μl2.將濾膜取出，倒扣至24孔板中顯色工作液上，保證濾膜向下一面與液體充分接觸，不能有氣泡存在。3.蓋上24孔板蓋，40±1℃孵育30min。4.去除液體，每孔加入1ml洗滌液洗滌三次，每次浸泡2min。將濾膜保持在洗滌液中至下一步實(shí)驗(yàn)操作，樣本在洗滌液中浸泡時(shí)間不能超過30min。七、熒光顯微鏡觀察肝癌CTCs本發(fā)明的對(duì)照品使用DAPI作為細(xì)胞核熒光基團(tuán)，其發(fā)射藍(lán)色熒光信號(hào)。1.將濾膜細(xì)胞面朝上置于載玻片上，沿鐵圈內(nèi)環(huán)將濾膜割下，加10μl含DAPI的抗淬滅劑，蓋上18mm×18mm的蓋玻片，直接鏡檢或置于-20℃保存。2.通過20倍物鏡計(jì)數(shù)CTC異性核數(shù)量。3.根據(jù)10倍物鏡定位異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。4.然后再根據(jù)10倍物鏡定位下一個(gè)異性核位置，滴油，用油鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并視野拍照記錄結(jié)果。5.重復(fù)操作至拍完所有的異性核，數(shù)量與20倍物鏡計(jì)數(shù)結(jié)果一致。顯微鏡使用通道如下：表7熒光基團(tuán)的激發(fā)波長和發(fā)射波長八、檢測結(jié)果判斷及分析1.陽性肝癌CTCs鑒定標(biāo)準(zhǔn)在濾膜上，富集有少量的肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞以及殘留的白細(xì)胞，肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)為(參見圖1)：1)具有肝癌細(xì)胞標(biāo)識(shí)物和循環(huán)腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在Cy5通道和/或Cy3通道和/或AlexaFluor488通道下能夠顯示紫色熒光信號(hào)點(diǎn)和/或紅色熒光信號(hào)點(diǎn)和/或綠色熒光信號(hào)點(diǎn)。2)不具有白細(xì)胞特異性標(biāo)識(shí)物，在本試劑盒中表現(xiàn)為在AlexaFluor750通道下不顯示熒光信號(hào)點(diǎn)。3)細(xì)胞核DAPI染色陽性。4)肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞核形狀不規(guī)則，直徑大于10μm，明顯大于濾膜孔徑，濾膜孔徑為7μm。白細(xì)胞大小與濾膜孔大小相近。2.陽性肝癌CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)：本試劑盒采用多重RNA探針，分別針對(duì)多種肝癌CTCs特異性基因，通過不同顏色熒光信號(hào)，可進(jìn)一步將肝癌CTCs分型。其中Ⅰ型(上皮型)CTCs攜帶Cy5熒光基團(tuán)(顯示為紫色熒光信號(hào)點(diǎn))和Cy3熒光基團(tuán)(顯示為紅色熒光信號(hào)點(diǎn))，Ⅲ型(間質(zhì)型)CTCs攜帶Cy5熒光基團(tuán)(顯示為紫色熒光信號(hào)點(diǎn))和AlexaFluor488熒光基團(tuán)(顯示為綠色熒光信號(hào)點(diǎn))，同時(shí)表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型特異性基因的CTCs為Ⅱ型(上皮-間質(zhì)混合型，同時(shí)顯示紫色熒光信號(hào)點(diǎn)、紅色熒光及綠色熒光信號(hào)點(diǎn))。參見圖2。肝癌CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)如下。表8陽性肝癌CTCs分型標(biāo)準(zhǔn)3.使用上述檢測方法，對(duì)20例肝癌患者外周血樣本進(jìn)行檢測和觀察，具體結(jié)果為(表中數(shù)據(jù)為CTC數(shù)目)。表9樣本檢測結(jié)果實(shí)施例3運(yùn)用實(shí)施例1中的試劑盒A對(duì)肝癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測一、細(xì)胞株的選擇本發(fā)明試劑盒肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的兩個(gè)或兩個(gè)以上；上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的一個(gè)或一個(gè)以上；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的一個(gè)或一個(gè)以上；白細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)镃D45。本發(fā)明選用的肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因中的各種標(biāo)志基因，是發(fā)明人經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)分析篩選得出的在肝癌CTCs上特異表達(dá)的基因，對(duì)肝癌CTCs的檢測具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2和HuH-7進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，陰性對(duì)照細(xì)胞株選用CCRF-HSB-2淋巴母細(xì)胞，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購買得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)21-25；取約1000個(gè)HuH-7細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)26-30；取約1000個(gè)CCRF-HSB-2淋巴母細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)31-35。二、樣本檢測運(yùn)用實(shí)施例1中的試劑盒A的全部探針(包括所有的標(biāo)志基因，肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN；上皮細(xì)胞標(biāo)志基因KRT7、KRT8、KRT17、 KRT18、KRT19；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2)，白細(xì)胞標(biāo)志基因CD45，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對(duì)樣本21-35進(jìn)行檢測，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來選取，針對(duì)目標(biāo)檢測標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測結(jié)果如下：表10樣本檢測結(jié)果通過比較樣本中三種細(xì)胞株的檢測結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒能實(shí)現(xiàn)肝癌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因的檢測，對(duì)樣本中肝癌細(xì)胞株HepG2和HuH-7、淋巴母細(xì)胞CCRF-HSB-2的檢出率均為100％，其中，肝癌標(biāo)志基因僅在肝癌細(xì)胞株中檢測到mRNA表達(dá)，而在淋巴母細(xì)胞中沒有表達(dá)，由此可見，本發(fā)明試劑盒能夠檢出肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因mRNA表達(dá)情況，同時(shí)，肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因的檢出具有癌種特異性，也就是說，肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因的檢出，能有效區(qū)分樣本中的肝癌細(xì)胞和白細(xì)胞，確保檢測到上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和/或間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的細(xì)胞為肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞，進(jìn)一步提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和可信度。實(shí)施例4不同細(xì)胞種類標(biāo)志基因的選擇一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(目標(biāo)檢測標(biāo)志基因數(shù)量和種類的選擇)本發(fā)明試劑盒肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組做相應(yīng)的選擇，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)椋篕RT7、KRT8、KRT17、KRT18和KRT19；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因?yàn)椋篈KT2、HIF-1A、SNAI1和ZEB2。肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因的選擇參見實(shí)施組1-4，分別選取一種、兩種、四種及八種的標(biāo)志基因，對(duì)比其檢測效果，而上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因使用全部的目標(biāo)基因以及白細(xì)胞標(biāo)志基因的全部目標(biāo)基因，具體設(shè)計(jì)如表11所示。本實(shí)施例每組相應(yīng)標(biāo)志基因的所述捕獲探針、擴(kuò)增探針與標(biāo)記探針的組成和數(shù)量、檢測方法等如實(shí)施例1試劑盒A和實(shí)施例2所述。表11肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因基因的選擇二、樣本檢測本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購買得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)36-40；取約1000個(gè)HuH-7細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)41-45；取約1000個(gè)QGY-7701細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)46-50。采用表11標(biāo)志基因制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對(duì)樣本36-50進(jìn)行檢測，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來選取，針對(duì)目標(biāo)檢測標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表12中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表13中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))：表12使用不同數(shù)量肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因檢測效果的比較表13使用不同數(shù)量肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因平均熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)檢測效果的比較對(duì)比實(shí)驗(yàn)組1-4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因分別選取一種、兩種、四種及八種，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因使用全部基因時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因檢測結(jié)果穩(wěn)定，而肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因檢測結(jié)果有差異：由于不同肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的差異，只選用一種標(biāo)志基因進(jìn)行檢測時(shí)，會(huì)造成一定程度的漏檢，使用2種或2種以上時(shí)，檢測效果達(dá)到穩(wěn)定，且紫色熒光信號(hào)點(diǎn)從實(shí)驗(yàn)組1到實(shí)驗(yàn)組4隨著肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因數(shù)量的增加而逐漸增加，檢測效果更優(yōu)，其中，選用全部的肝癌細(xì)胞標(biāo)記基因時(shí)，檢測信號(hào)最強(qiáng)最穩(wěn)定，效果最優(yōu)，同時(shí)，肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因的增加并不影響上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的檢測結(jié)果，由此可知，本發(fā)明試劑盒所設(shè)計(jì)的各種類型探針之間基本不存在非特異性結(jié)合，特異性好。上皮細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因基因數(shù)量的選擇實(shí)驗(yàn)結(jié)果與肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因一致。其它針對(duì)使用不同數(shù)量和種類的肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例5試劑盒目標(biāo)檢測標(biāo)志基因的選擇一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(目標(biāo)檢測標(biāo)志基因數(shù)量和種類的選擇)本發(fā)明試劑盒肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因選自：KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因選自：AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組5--8，分別選取三種、六種、十二種及十七種的標(biāo)志基因，對(duì)比其檢測效果，白細(xì)胞使用標(biāo)志基因CD45，具體設(shè)計(jì)如表14所示。本實(shí)施例每組相應(yīng)標(biāo)志基因的所述捕獲探針、擴(kuò)增探針與標(biāo)記探針的組成和數(shù)量、檢測方法等如實(shí)施例1試劑盒A和實(shí)施例2所述。表14試劑盒標(biāo)志基因基因的選擇二、樣本檢測本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購買得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)51-55；取約1000個(gè)HuH-7細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)56-60；取約1000個(gè)QGY-7701細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)61-65。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對(duì)樣本51-65進(jìn)行檢測，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來選取，針對(duì)目標(biāo)檢測標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表15中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表16中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))：表15試劑盒使用不同數(shù)量標(biāo)志基因檢測效果的比較表16試劑盒使用不同數(shù)量標(biāo)志基因平均熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)檢測效果的比較對(duì)比實(shí)驗(yàn)組5-8的檢測結(jié)果可知，使用3種標(biāo)志基因時(shí)(實(shí)驗(yàn)組5)會(huì)由于不同肝癌細(xì)胞上基因的差異表達(dá)而照成假陰性的結(jié)果，使用6種及6種以上標(biāo)志基因進(jìn)行檢測時(shí)效果達(dá)到穩(wěn)定，且細(xì)胞上3種細(xì)胞種類標(biāo)志基因?qū)?yīng)的熒光信號(hào)點(diǎn)從實(shí)驗(yàn)組5到實(shí)驗(yàn)組8隨著標(biāo)志基因數(shù)量的增加而逐漸增加，檢測效果更優(yōu)，其中，選用全部的標(biāo)記基因時(shí)，檢測信號(hào)最強(qiáng)最穩(wěn)定，效果最優(yōu)。其它針對(duì)使用不同數(shù)量和種類的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例6不同間隔臂的試劑盒對(duì)肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞mRNA原位雜交的檢測一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(間隔臂的選擇)以肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因(共8個(gè)基因)為例，分別選用不同的間隔臂，具體設(shè)計(jì)如表17所示。其余捕獲探針、擴(kuò)增探針與標(biāo)記探針的堿基組成以及所用數(shù)量全部與實(shí)施例1試劑盒A相同、不同之處僅在于間隔臂不同，檢測方法如實(shí)施例2所述。對(duì)應(yīng)的捕獲探針、擴(kuò)增探針的間隔臂相同。表17間隔臂及其長度間隔臂種類長度實(shí)驗(yàn)組poly(dT)59poly(dA)810(CH2)n1511poly(TTG)312二、樣本檢測本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購買得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)66-70；取約1000個(gè)HuH-7細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)71-75；取約1000個(gè)QGY-7701細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)75-80。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對(duì)樣本66-80進(jìn)行檢測，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來選取，具體檢測結(jié)果如下(表中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目)。表18肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因檢測探針使用不同間隔臂的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較經(jīng)過對(duì)比4個(gè)實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果可知，4組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的檢測效果沒有差異，因此，這4種間隔臂的設(shè)計(jì)是等效的。上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因以及白細(xì)胞標(biāo)志基因檢測探針使用不同的間隔壁檢測結(jié)果與肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因一致，具體數(shù)據(jù)省略。其它針對(duì)捕獲探針、擴(kuò)增探針和標(biāo)記探針內(nèi)部不同的間隔序列的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例7：標(biāo)記探針的運(yùn)用一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(信號(hào)檢測組分)本發(fā)明試劑盒信號(hào)檢測組分有兩種選擇，1)擴(kuò)增探針P4序列的3’端修飾有熒光基團(tuán)；2)擴(kuò)增探針3’端P4序列與標(biāo)記探針的P5序列通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，同時(shí)標(biāo)記探針的3’端帶有熒光基團(tuán)。這兩種信號(hào)檢測組分均能實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，檢測到正常信號(hào)。其中，使用熒光基團(tuán)修飾的標(biāo)記探針，檢測信號(hào)更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。以所述試劑盒的檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志基因的兩種信號(hào)檢測組分為例，具體設(shè)計(jì)如表19所示。即所述試劑盒的組成為：實(shí)驗(yàn)組13：相應(yīng)捕獲探針和擴(kuò)增探針組成和數(shù)量同實(shí)施例1試劑盒A，但擴(kuò)增探針3’端修飾有熒光基團(tuán)Cy3；沒有標(biāo)記探針；實(shí)驗(yàn)組14：相應(yīng)捕獲探針、擴(kuò)增探針和標(biāo)記探針組成和數(shù)量同實(shí)施例1試劑盒A，擴(kuò)增探針不具有熒光基團(tuán)，但配置有標(biāo)記探針，標(biāo)記探針的P5序列3’端修飾有熒光基團(tuán)Cy3。表19信號(hào)檢測組分二、樣本檢測本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購買得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)81-85；取約1000個(gè)HuH-7細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)86-90；取約1000個(gè)QGY-7701細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)91-95。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對(duì)樣本81-95進(jìn)行檢測，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來選取，針對(duì)目標(biāo)檢測標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表20中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表21中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))。表20上皮細(xì)胞標(biāo)志基因使用不同信號(hào)檢測探針的檢測結(jié)果比較表21上皮細(xì)胞標(biāo)志基因使用不同信號(hào)檢測探針平均熒光點(diǎn)數(shù)檢測結(jié)果比較將兩組設(shè)計(jì)的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，證明兩組設(shè)計(jì)對(duì)樣本中細(xì)胞數(shù)目的檢測結(jié)果沒有差異，因此，這兩種信號(hào)檢測組分對(duì)信號(hào)的檢測是等效的。其中，使用熒光基團(tuán)修飾的標(biāo) 記探針(即實(shí)驗(yàn)組14)，其檢測到上皮細(xì)胞標(biāo)志基因熒光點(diǎn)數(shù)更多，信號(hào)更加穩(wěn)定，效果較優(yōu)。其他針對(duì)肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因標(biāo)記探針的運(yùn)用檢測結(jié)果與上皮細(xì)胞標(biāo)志基因檢測結(jié)果一致，具體數(shù)據(jù)省略。實(shí)施例8標(biāo)志基因的捕獲探針的數(shù)量選擇一、試劑盒制備的設(shè)計(jì)(捕獲探針數(shù)量的選擇)本發(fā)明肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定試劑盒，針對(duì)不同細(xì)胞種類的每個(gè)標(biāo)志基因分別設(shè)計(jì)了10條捕獲探針，且同一細(xì)胞種類的標(biāo)志基因的捕獲探針中的P2序列相同。在實(shí)際使用時(shí)，可以針對(duì)每種標(biāo)志基因，選擇對(duì)應(yīng)的至少2條捕獲探針即可完成檢測，特異性和穩(wěn)定性都能達(dá)到需求。為考察捕獲探針數(shù)量的選擇對(duì)試劑盒檢測效果的影響，以上皮細(xì)胞標(biāo)志基因KRT7的捕獲探針數(shù)量選擇為例，參見實(shí)驗(yàn)組15-17，分別選取1條、2條及10條的捕獲探針，對(duì)比其檢測效果。在該對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，上皮細(xì)胞標(biāo)志基因僅使用KRT7(參見表22)，而肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因使用如實(shí)施例1試劑盒A所列出的全部的基因和探針以及白細(xì)胞標(biāo)志基因CD45及其對(duì)應(yīng)的檢測探針。表22上皮細(xì)胞標(biāo)志基因KRT7的捕獲探針的選擇二、樣本檢測本實(shí)施例選用上皮-間質(zhì)混合型肝癌細(xì)胞株HepG2、HuH-7和QGY-7701進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細(xì)胞株的名稱即可通過購買得到。取約1000個(gè)HepG2細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)96-100；取約1000個(gè)HuH-7細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)101-105；取約1000個(gè)QGY-7701細(xì)胞(通過細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本均分為5份，編號(hào)105-110。采用上述設(shè)計(jì)制備的試劑盒，按實(shí)施例2所述檢測過程和方法對(duì)樣本96-110進(jìn)行檢測，讀取每個(gè)樣本中有DAPI藍(lán)色熒光信號(hào)的50個(gè)細(xì)胞，其中，樣本中的細(xì)胞數(shù)通過熒光顯微鏡自動(dòng)掃描來選取，針對(duì)目標(biāo)檢測標(biāo)志物的熒光信號(hào)強(qiáng)度，分別讀取這50個(gè)肝癌細(xì)胞的相應(yīng)顏色的熒光點(diǎn)數(shù)量，并計(jì)算平均點(diǎn)數(shù)，具體檢測結(jié)果如下(表23中數(shù)據(jù)為細(xì)胞數(shù)目，表24中數(shù)據(jù)為平均熒光點(diǎn)數(shù))。表23上皮細(xì)胞標(biāo)志基因KRT7使用不同數(shù)量捕獲探針的檢測結(jié)果比較表24上皮細(xì)胞標(biāo)志基因KRT7使用不同數(shù)量捕獲探針平均熒光點(diǎn)數(shù)檢測結(jié)果比較通過三組實(shí)驗(yàn)對(duì)比可知，當(dāng)僅選用上皮細(xì)胞標(biāo)志基因KRT7，使用1條、2條和10條的捕獲探針均可完成檢測，當(dāng)捕獲探針使用2條或以上時(shí)，其特異性和穩(wěn)定性都很好。其中，當(dāng)使用全部10條的捕獲探針時(shí)，上皮基因檢測到的熒光信號(hào)點(diǎn)數(shù)更多，信號(hào)更強(qiáng)更穩(wěn)定，檢測效果最佳。其它針對(duì)肝癌細(xì)胞標(biāo)志基因、上皮細(xì)胞標(biāo)志基因、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因和白細(xì)胞標(biāo)志基因的使用不同數(shù)量捕獲探針的試劑盒，其結(jié)果依然穩(wěn)定可靠，具體數(shù)據(jù)省略。以上所述實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對(duì)上述實(shí)施例中 的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3