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肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒的制作方法

文檔序號:12697598閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,包括針對每種標志基因mRNA的捕獲探針、擴增探針和標記探針,所述標志基因mRNA包括有以下三類:選自AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73、OPN中的至少兩種的肝癌細胞標志基因mRNA,選自KRT7、KRT8、KRT17、KRT18、KRT19中的至少一種的上皮細胞標志基因mRNA,選自AKT2、HIF-1A、SNAI1、ZEB2中的至少一種的間質細胞標志基因mRNA;其中,所述捕獲探針連接標志基因mRNA與擴增探針,每條捕獲探針從5’端到3’端的堿基組成依次為:與相應待檢測的標志基因mRNA結合的特異性序列P1、間隔臂序列、P2序列,所述P2序列為不存在發(fā)夾結構,探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配,與P1、P4和標志基因mRNA之間均不存在特異性結合的序列,針對同一類別的標志基因的捕獲探針的P2序列相同;每條擴增探針從5’端到3’端的堿基組成依次為:能與相應捕獲探針的P2序列互補配對的P3序列、間隔臂序列、P4序列;所述P4序列為不存在發(fā)夾結構,探針內(nèi)部和探針間不形成二聚體、不存在錯配、與P1、P2、P3和總mRNA之間均不存在特異性結合的序列;每條標記探針具有與相應擴增探針P4序列互補配對的P5序列,且末端修飾有熒光基團,不同標志基因的熒光基團互不相同。

2.根據(jù)權利要求1所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述標志基因mRNA還包括有針對白細胞標志基因的mRNA的一類,所述白細胞標志基因為CD45。

3.根據(jù)權利要求1所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述肝癌細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對AFP基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10中的2條或2條以上,針對AST基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.20中的2條或2條以上,針對ALT基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.21~SEQ ID NO.30中的2條或2條以上,針對DCP基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.40中的2條或2條以上,針對GGT基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.41~SEQ ID NO.50中的2條或2條以上,針對GPC3基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.51~SEQ ID NO.60中的2條或2條以上,針對GP73基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.61~SEQ ID NO.70中的2條或2條以上,針對OPN基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.71~SEQ ID NO.80中的2條或2條以上;針對肝癌細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.181;所述肝癌細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.185,P4序列為SEQ ID NO.189。

4.根據(jù)權利要求1所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述上皮細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對KRT7基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.81~SEQ ID NO.90中的2條或2條以上,針對KRT8基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.91~SEQ ID NO.100中的2條或2條以上,針對KRT17基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.101~SEQ ID NO.110中的2條或2條以上,針對KRT18基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.111~SEQ ID NO.120中的2條或2條以上,針對KRT19基因的特異性序列P1的選自SEQ ID NO.121~SEQ ID NO.130中的2條或2條以上;針對上皮細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.182;所述上皮細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.186,P4序列為SEQ ID NO.190。

5.根據(jù)權利要求1所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述間質細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對AKT2基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.131~SEQ ID NO.140中的2條或2條以上,針對HIF-1A基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.141~SEQ ID NO.150中的2條或2條以上,針對SNAI1基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.151~SEQ ID NO.160中的2條或2條以上,針對ZEB2基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.161~SEQ ID NO.170中的2條或2條以上;針對間質細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.183;所述間質細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.187,P4序列為SEQ ID NO.191。

6.根據(jù)權利要求1至5任一項所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述白細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對CD45基因的特異性序列P1選自SEQ ID NO.171~SEQ ID NO.180中的2條或2條以上;針對白細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.184;所述白細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.188,P4序列為SEQ ID NO.192。

7.根據(jù)權利要求1至5任一項所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述標志基因mRNA有:AFP、AST、ALT、DCP、GGT、GPC3、GP73和OPN的肝癌細胞標志基因mRNA,KRT7、KRT8、KRT17、KRT18和KRT19的上皮細胞標志基因mRNA,AKT2、HIF-1A、SNAI1和ZEB2的間質細胞標志基因mRNA,CD45的白細胞標志基因的mRNA。

8.根據(jù)權利要求7所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述肝癌細胞標志基因mRNA捕獲探針,包括:針對AFP基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.10,針對AST基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.11~SEQ ID NO.20,針對ALT基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.21~SEQ ID NO.30,針對DCP基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.31~SEQ ID NO.40,針對GGT基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.41~SEQ ID NO.50,針對GPC3基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.51~SEQ ID NO.60,針對GP73基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.61~SEQ ID NO.70,針對OPN基因特異性序列P1的為SEQ ID NO.71~SEQ ID NO.80;針對肝癌細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.181;所述肝癌細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.185,P4序列為SEQ ID NO.189;

所述上皮細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對KRT7基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.81~SEQ ID NO.90,針對KRT8基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.91~SEQ ID NO.100,針對KRT17基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.101~SEQ ID NO.110,針對KRT18基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.111~SEQ ID NO.120,針對KRT19基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.121~SEQ ID NO.130;針對上皮細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.182;所述上皮細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.186,P4序列為SEQ ID NO.190;

所述間質細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對AKT2基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.131~SEQ ID NO.140,針對HIF-1A基因特異性序列P1為SEQ ID NO.141~SEQ ID NO.150,針對SNAI1基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.151~SEQ ID NO.160,針對ZEB2基因的特異性序列P1為SEQ ID NO.161~SEQ ID NO.170;針對間質細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.183;所述間質細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.187,P4序列為SEQ ID NO.191;

所述白細胞標志基因mRNA捕獲探針中:針對CD45基因特異性序列P1為SEQ ID NO.171~SEQ ID NO.180;針對白細胞標志基因的捕獲探針的P2序列為SEQ ID NO.184;所述白細胞標志基因mRNA擴增探針中,P3序列為SEQ ID NO.188,P4序列為SEQ ID NO.192。

9.根據(jù)權利要求1至5任一項所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述間隔臂序列為5-10個T。

10.根據(jù)權利要求1至5任一項所述的肝癌循環(huán)腫瘤細胞鑒定試劑盒,其特征在于,所述熒光基團選自:FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750,且針對不同細胞種類標志基因的熒光基團互不相同。

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