一種出生缺陷產(chǎn)前診斷ebv轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其主要特征是取因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目異常的剩余的活細(xì)胞，分離淋巴細(xì)胞，在含環(huán)胞霉素A和EBV的RPMI-1640培養(yǎng)液中經(jīng)37℃、5％CO2培養(yǎng)，B淋巴細(xì)胞形成具有無限繁殖能力的永生淋巴母細(xì)胞系，作傳代擴(kuò)增至所需量后凍存細(xì)胞系，臨用時按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細(xì)胞系只有1種染色體數(shù)目異常制成包含特定比例和多種組合的多項(xiàng)測試通用的更難鑒別診斷的染色體數(shù)目異常嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，原始細(xì)胞易得且將廢棄的多余細(xì)胞人為制成可按需倍增的實(shí)用而有效的質(zhì)控細(xì)胞。
【專利說明】一種出生缺陷產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其制備 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種出生缺陷產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，主要 應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室作常見染色體數(shù)目異常診斷的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控和室 間質(zhì)評。

【背景技術(shù)】
[0002] 染色體是細(xì)胞核中的遺傳物質(zhì)，人類有23對染色體，其中22對為常染色體，1對為 決定男女性別的性染色體。染色體上載有遺傳信息的基因，其中DNA占90%以上，RNA含量 隨細(xì)胞周期及生長情況而有所變化，一般占1%?10%。
[0003] 染色體結(jié)構(gòu)異常、數(shù)目異常及嵌合體，臨床上表現(xiàn)為染色體病，屬于常見的出生缺 陷，如先天愚型、原發(fā)性閉經(jīng)、兩性畸型等。染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體易位、缺失、倒位、環(huán) 狀等；染色體數(shù)目異常是指多出或缺少1條或數(shù)條染色體；嵌合體核型是指同一病例個體 并存數(shù)種染色體核型。目前診斷染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目異常的常規(guī)方法是染色體核型分析，即 用被檢的組織或細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)、〇. 02 μ Ι/ml秋水仙素終止細(xì)胞生長、分離中期細(xì)胞、 0.075mol/L KC1低滲、甲醇-冰乙酸（3 : 1)固定等染色體制片程序后，再經(jīng)胰酶消化、G 顯帶、染色體核型分析，從而作出染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目是否異常的判斷，但染色體核型分析需 經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和制片，一般需2?3周后才能作出診斷報告，不能達(dá)到快速診斷的目的。近年 來開展的熒光原位雜交技術(shù)，能快速作出常見染色體數(shù)目是否異常的診斷，一般在24小時 就能作出診斷報告，因?yàn)楫a(chǎn)前診斷中的重大遺傳病如21-三體、18-三體、13三體、性染色體 數(shù)目異常均屬常見染色體數(shù)目異常，均可經(jīng)熒光原位雜交作出快速診斷，所以近年來熒光 原位雜交技術(shù)已被越來越廣泛地應(yīng)用于被定義為常見染色體數(shù)目異常的21-三體、18-三 體、13三體、性染色體異常（X與Y染色體）的產(chǎn)前診斷。
[0004] 作為所開展的各類實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目，均應(yīng)有相應(yīng)規(guī)范的質(zhì)量控制措施。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì) 量控制是確保實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果準(zhǔn)確性的前提，已成為政府行為。為了加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制， 我國于1982年成立了衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，下設(shè)室間質(zhì)評辦公室，專職從事于實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng) 目的質(zhì)量控制。衛(wèi)生部[衛(wèi)醫(yī)發(fā)]1997第31號文件、《臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》、《醫(yī)院評審標(biāo) 準(zhǔn)實(shí)施細(xì)則》以及大量的文獻(xiàn)均指出，實(shí)驗(yàn)室必須有規(guī)范的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，所開展的實(shí)驗(yàn)診 斷項(xiàng)目必須參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)評。自1982年以來，在臨床檢驗(yàn)學(xué)科先 后開展了臨床實(shí)驗(yàn)的室內(nèi)質(zhì)控、室間質(zhì)評。包括了對各檢驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)前、中、后以及儀器、 試劑和實(shí)驗(yàn)人員的質(zhì)量控制。質(zhì)量控制已滲透到臨檢、生化、微生物、免疫、基因、細(xì)胞形態(tài) 學(xué)診斷等各個實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制已成為開展實(shí)驗(yàn)診斷項(xiàng)目的準(zhǔn)入制度、成為醫(yī) 院等級評審的重要標(biāo)準(zhǔn)。
[0005] 產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制已引起日益重視。隨著我國對生殖健康和出生缺陷工作的 日益重視，近年來各省市均建立了產(chǎn)前診斷中心，開展了 21三體綜合癥、18三體綜合征、 神經(jīng)管畸形等重大出生缺陷的產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷，其中與重大出生缺陷相關(guān)的胎兒羊水 染色體異常的診斷已成為目前產(chǎn)前診斷的主要項(xiàng)目。由于產(chǎn)前診斷是新開展的學(xué)科，大多 專業(yè)人員的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)較為缺乏，特別是對于疑難、罕見病例、國內(nèi)外首報病例以及如貓叫綜 合癥等染色體異常不明顯但臨床后果嚴(yán)重的病例，誤診現(xiàn)象時有發(fā)生。我國國家主席令 (1994年10月27日第三十三號）公布的"產(chǎn)前診斷法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)"以及國務(wù)院辦公廳[國發(fā)辦 (1999) 15號]轉(zhuǎn)發(fā)衛(wèi)生部"關(guān)于做好提高出生人口素質(zhì)工作意見"的通知中均強(qiáng)調(diào)指出， "各省、市產(chǎn)前診斷中心必須加強(qiáng)產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制、嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)"。
[0006] 產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制是許多學(xué)者致力于研究的重要課題。國外有較多的文獻(xiàn)報 道了產(chǎn)前診斷質(zhì)量控制的重要性，Sikkema-Raddatz B等對產(chǎn)前細(xì)胞遺傳學(xué)診斷的細(xì)胞培 養(yǎng)及制片過程的影響因素作了深入的研究，提出了室內(nèi)質(zhì)量控制的方法；Fries N和Merz E等提出了影像學(xué)產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制方法；Pihlk等認(rèn)為必須加強(qiáng)產(chǎn)前篩查的質(zhì)量控制； 在2002?2004年期間，Bastien P等對法國23家實(shí)驗(yàn)室作了弓形蟲產(chǎn)前分子診斷的室間 質(zhì)量評價，認(rèn)為室間質(zhì)評對促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室間的技術(shù)交流、發(fā)現(xiàn)問題、提高實(shí)驗(yàn)診斷質(zhì)量起到重 要的作用。
[0007] 雖然我國行政主管部門以及學(xué)術(shù)界十分重視產(chǎn)前診斷的質(zhì)量控制（包括室內(nèi)質(zhì) 控和室間質(zhì)評），但因沒有可行的質(zhì)控物，所以無法開展實(shí)質(zhì)性的質(zhì)量控制。也就是說，要開 展產(chǎn)前診斷的室間質(zhì)評和室內(nèi)質(zhì)控，首先必須要有質(zhì)控物。研制可行的質(zhì)控物、開展產(chǎn)前診 斷質(zhì)量控制是質(zhì)量管理人員以及本專業(yè)技術(shù)人員長期以來想方設(shè)法解決但始終沒有解決 的難題。
[0008] 文獻(xiàn)報道，EBV即為埃波斯坦病毒（Epstein-Barr Viruses)，基因組為大約160kb 的雙鏈DNA。它是一種人皰疹病毒，能引起許多疾病。如感染性單核細(xì)胞增多癥、鼻咽癌、淋 巴瘤等。EBV宿主范圍窄，體外實(shí)驗(yàn)表明，這種病毒可導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞癌。其致癌的基因是 BNLF-1，編碼一種膜蛋白。B淋巴細(xì)胞是EBV的天然宿主，EBV對B細(xì)胞有天然的親和力并可 使其發(fā)生轉(zhuǎn)化并增殖。EBV轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞是一種非裂解型細(xì)胞：病毒感染后不能在細(xì)胞 體內(nèi)復(fù)制后代，但能整合在宿主細(xì)胞基因組上，一部分整合了病毒基因組的細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化， 其性狀及生長特征發(fā)生改變。EBV并不攜帶一整套誘導(dǎo)宿主細(xì)胞性狀發(fā)生巨大變化的基因， 只是啟動與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的一系列事件的發(fā)生，而這些事件的發(fā)生需要細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)來實(shí) 現(xiàn)。從某種意義上來說，這些病毒只是扳動了改變靶細(xì)胞生長特性的調(diào)控開關(guān)。它們的轉(zhuǎn) 化活性來源于病毒基因組中的某些特殊基因，就是癌基因。如EBV中的BNLF-1，是一種晚期 基因。這些癌基因在病毒早期的裂解循環(huán)中，參與病毒顆粒的復(fù)制；當(dāng)轉(zhuǎn)化發(fā)生時，它們整 合進(jìn)入淋巴細(xì)胞的基因組中，持續(xù)表達(dá)癌蛋白（oncoproteins)，引起細(xì)胞無限制分裂等腫 瘤樣改變，遂形成淋巴母細(xì)胞系。
[0009] 在正常人群中約90%以上個體在兒童期都曾感染過EB病毒，其體內(nèi)有很好的抗 EB病毒免疫功能。在體外建立淋巴母細(xì)胞系的同時，有時回引起曾感染過EB病毒者T淋 巴細(xì)胞的免疫應(yīng)答，使已被EB病毒感染的B淋巴細(xì)胞迅速退化，造成B淋巴細(xì)胞死亡，導(dǎo)致 建系成功率降低（30%?40%)。環(huán)胞霉素 A(CyCl〇Sp〇rinA)是一種免疫抑制劑，其主要作 用是特異性抑制T淋巴細(xì)胞中的RNA聚合酶，使T淋巴細(xì)胞失去了對EB病毒感染的免疫反 應(yīng)，從而有效地防止已轉(zhuǎn)化的B淋巴細(xì)胞的退化。如果在轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中加入少 量環(huán)胞霉素 A，就可以引起細(xì)胞無休止的分裂和DNA無限的合成，即形成具有無限繁殖能力 的永生淋巴母細(xì)胞系。
[0010] 在產(chǎn)前診斷中，常有一些在診斷報告發(fā)出后剩余的病例活細(xì)胞，本可用作質(zhì)量控 制細(xì)胞，但因?yàn)檫@類細(xì)胞未作特殊處理，很易死亡、難以大規(guī)模擴(kuò)增以供許多實(shí)驗(yàn)室反復(fù)多 次使用，所以就難以作為質(zhì)控細(xì)胞使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了解決醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室作常見染色體數(shù)目異常診斷的技術(shù)考核、室 內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評無質(zhì)控物的問題，本發(fā)明人提出了本發(fā)明。
[0012] 本發(fā)明的目的是要提供一種用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室作常見染色體數(shù)目 異常診斷的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)評的出生缺陷產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞 及其制備方法。
[0013] 本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：取因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為 常見染色體數(shù)目異常之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體數(shù)目異常的剩余的活 細(xì)胞，分離淋巴細(xì)胞，在含環(huán)胞霉素 A和EBV的RPMI-1640培養(yǎng)液中經(jīng)37°C、5% C02培養(yǎng)， B淋巴細(xì)胞形成具有無限繁殖能力的永生淋巴母細(xì)胞系，作傳代擴(kuò)增至所需量后凍存細(xì)胞 系，臨用時提取細(xì)胞系，按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細(xì)胞系僅有1種染色體數(shù)目異常 轉(zhuǎn)變?yōu)楹幸欢ū壤亩喾N組合的染色體數(shù)目異常的嵌合體質(zhì)控細(xì)胞株，集中保存，備作 熒光原位雜交等常見染色體數(shù)目異常診斷的質(zhì)控細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明以因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目異常 之一的21 -三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的活細(xì)胞作為原始細(xì)胞，標(biāo)本 易得（如2012年1月至12月本室發(fā)現(xiàn)21-三體43例、18-三體28例、13三體7例、X染 色體數(shù)目異常15例、Y染色體數(shù)目異常12例）且將廢棄的剩余細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有永久生存、 無限擴(kuò)增、可按需復(fù)制足夠的細(xì)胞系以滿足質(zhì)量評價要求的質(zhì)控細(xì)胞，建系簡便；將5種 各具1種染色體數(shù)目異常的細(xì)胞系按質(zhì)控所需比例混合后，使原先每例細(xì)胞系只有1種染 色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢ū壤亩喾N組合的易誤診染色體異常嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，從而增加 了鑒別診斷、染色體嵌合體診斷的難度和復(fù)雜性，以疑難病例考核診斷水平、作室內(nèi)質(zhì)控和 室間質(zhì)評，對及時發(fā)現(xiàn)質(zhì)量問題、制定改進(jìn)預(yù)案、提高診斷水平具有意想不到的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是本發(fā)明提出的5種染色體數(shù)目異常細(xì)胞等比例混合的嵌合體質(zhì)控細(xì)胞的熒 光原位雜交結(jié)果模擬圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 1、原始細(xì)胞：所用的原始細(xì)胞來源于因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確 診為常見染色體數(shù)目異常之一的21-三體、18-三體、13三體、X或Y染色體異常的剩余的 活細(xì)胞，其活細(xì)胞也可以涉及染色體結(jié)構(gòu)異常、除5種常見染色體數(shù)目異常以外的第1號至 第22號染色體數(shù)目異常活細(xì)胞。細(xì)胞類型為外周血、臍血、骨髓的淋巴細(xì)胞。
[0017] 2、將血液與等量1640培養(yǎng)液混勻后，沿管壁漸漸加入到含有4ml淋巴細(xì)胞分離液 的離心管中（混合血：淋巴細(xì)胞分離液=6 : 4)，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘。
[0018] 3、吸取白細(xì)胞層，移入另一支離心管中，加入不含血清的1640培養(yǎng)液6ml，輕輕混 勻，進(jìn)行第一次洗滌。1500轉(zhuǎn)離心15分鐘。
[0019] 4、棄上清液，再加6mll640全培養(yǎng)液進(jìn)行第二次洗滌，離心1500轉(zhuǎn)15分鐘。
[0020] 5、棄上清液，加入2mll640全培養(yǎng)基（全培養(yǎng)基加入前，置37度水浴10分鐘），然 后加入環(huán)胞霉素 A (4% )和1. 2mlEBV液/份，充分混勻后移入到25平方厘米的培養(yǎng)瓶，置 37度、5% C02培養(yǎng)箱中。
[0021] 6、每2-3天加入3ml新鮮配制的培養(yǎng)基（1. 6% 1M HEPES緩沖液；15%胎牛血清 (FBS) ;1%青霉素和鏈霉素；PRMI1640補(bǔ)足到100%)。7天左右鏡下觀察，可見淋巴細(xì)胞明 顯增大，出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。
[0022] 7、如果細(xì)胞增長慢，或細(xì)胞密度低，或培養(yǎng)液pH值呈酸性，吸出半量培養(yǎng)液，進(jìn)行 等量換液。
[0023] 8、當(dāng)總量達(dá)到14ml時轉(zhuǎn)移到75ml培養(yǎng)瓶中，每2-3周加入5-10ml新鮮培養(yǎng)基。
[0024] 9、淋巴細(xì)胞株的凍存：約6-8周，當(dāng)總量達(dá)到45ml時，置50ml離心管中，離心1500 轉(zhuǎn)，10分鐘。棄上清，加入3ml凍存培養(yǎng)基（5%二甲基亞楓（dimethyl sufoxidehgS% FBS)混勻，成細(xì)胞懸浮液（細(xì)胞濃度約為105/ml)。凍存管分裝，lml/管，置-20°C 2h，再 置-70°C 2h，然后凍存在-196°C液氮中（或立即置零下80度，1-2小時后移入液氮罐中）。
[0025] 10、淋巴細(xì)胞株的復(fù)蘇與擴(kuò)增（質(zhì)控細(xì)胞株的制備）：從_196°C液氮中取出所需要 的1管或數(shù)管凍存細(xì)胞；迅速置37°C水浴，不斷震搖，使盡快融化，用吸管吸出細(xì)胞懸液，注 入離心管，適當(dāng)補(bǔ)充培養(yǎng)液，500-1000rpm離心lOmin，去上清液，再重復(fù)用培養(yǎng)液洗一次， 然后用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶，37°C、5% C02培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，以后按常規(guī)進(jìn) 行培養(yǎng)。按細(xì)胞增生的量，不斷更換大培養(yǎng)瓶，增加或半量更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增到 需要量時，分裝于50ml離心管中，離心1500轉(zhuǎn)，10分鐘，棄上清。
[0026] 11、原液質(zhì)控細(xì)胞的制備（含有1種染色體數(shù)目異常）：（1)原液活質(zhì)控細(xì)胞系的 制備：取經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增后的淋巴細(xì)胞系，加入適量的凍存培養(yǎng)基（5%二甲基亞楓、95% FBS) 混勻，使成約5X105個/ml，加入凍存管，經(jīng)4°C，0. 5h ;-20°C，2h ;-70°C，過夜，入_196°C 液氮凍存。（2)原液固定質(zhì)控細(xì)胞的制備：①終止培養(yǎng)：收獲細(xì)胞前2?3h，加入濃度為 20μ g/ml的秋水仙素，每5ml培養(yǎng)基中用7號針頭，加3?4滴使最終濃度為0. 1 μ g/ml。 輕輕搖勻后，再放入恒溫箱內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)2?3h，以積累較多停止在中期的分裂象。②收獲 細(xì)胞：由恒溫箱取出培養(yǎng)瓶，以〇. 25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞5分鐘，每次收獲1瓶，用吸 管充分吹打培養(yǎng)瓶瓶壁，使細(xì)胞全部脫離瓶壁，然后將細(xì)胞液移至錐形離心管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/ min,離心lOmin，去上清液。③低滲處理：加入37°C預(yù)溫的0. 075mol/L KC18ml，反復(fù)吹打 (約一百次）后，置37°C水浴箱中低滲處理25min左右。④預(yù)固定：加入新鮮制備固定液 lml (甲醇：冰醋酸=3 : 1)，輕輕混勻。⑤離心：2000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，吸棄上清液。 ⑥固定：沿離心管壁慢慢加入固定液8ml，輕輕混勻，固定lOmin。⑦離心：同上，吸去上清 液。⑧再固定：加固定液8ml，混勻，固定10min。⑨離心：同上，吸去上清液。（10)制備原 液質(zhì)控細(xì)胞懸液：根據(jù)細(xì)胞量多少，加入適量固定液，充分混勻，制成濃度為l〇 5/ml的細(xì)胞 懸液，保存?zhèn)溆谩?br> [0027] 12、應(yīng)用質(zhì)控細(xì)胞系的制備：⑴應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系的制備：提取5例在不同時 間制備的、凍存于_196°C液氮中的染色體數(shù)目異常的原液活質(zhì)控細(xì)胞系，以5例之比均為 1 : 1的等濃度、等體積或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng) 用活質(zhì)控細(xì)胞系，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占 20%;另外根據(jù)需要，取1例原液活質(zhì)控細(xì)胞系與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、 1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體 積比例或細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行混合，制成不等比應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系，含有不同類型和比例的染 色體數(shù)目異常，如某1例取lml與另1例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%， 后者為98%;如某1例取lml與另外1例染色體正常的同濃度細(xì)胞懸液50ml混合，則理論 上前者的嵌合體比例為2% ;5例染色體數(shù)目異常的細(xì)胞與染色體數(shù)目正常的細(xì)胞按不同例 次、比例相互混合，可制成許多種嵌合體質(zhì)控細(xì)胞。此外，應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系還可進(jìn)行傳代 擴(kuò)增后使用。（2)應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞的制備：提取5例在不同時間制備的染色體數(shù)目異常 的原液固定質(zhì)控細(xì)胞，以5例之比均為1 : 1的等濃度、等體積或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取 lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞，理論上21-三體、18-三體、13-三 體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20% ;另外根據(jù)需要，取1例原液固定質(zhì)控細(xì)胞與另 外的 1 例、2 例、3 例或 4 例按 1 : 0.5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、 1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20?50的體積比例或細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行混合，制成不等比應(yīng)用固 定質(zhì)控細(xì)胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常，如某1例取lml與另1例取50ml混 合，則理論上前者的嵌合體比例為2%，后者為98% ;如某1例取lml與另外1例染色體正 常的同濃度細(xì)胞懸液50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%。經(jīng)如此反復(fù)傳代擴(kuò)增 和混合不同病例的染色體數(shù)目異常細(xì)胞所制備的質(zhì)控細(xì)胞（株），不但數(shù)量足夠的多，達(dá)到 用之不盡，而且使原先一般每份原液活質(zhì)控細(xì)胞（株）或原液固定質(zhì)控細(xì)胞中只有一種染 色體數(shù)目異常轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性谕环輵?yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞（株）或應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞中同時含有 多種不同比例的、不同類型的易誤診染色體數(shù)目異常的特征，從而增加了鑒別診斷、染色體 嵌合體診斷的難度和復(fù)雜性，標(biāo)本易得且將廢棄的多余細(xì)胞轉(zhuǎn)化為可用于染色體核型分析 的技術(shù)考核、室內(nèi)質(zhì)控及室間質(zhì)評，在室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價、提高診斷水平的應(yīng)用 中具有顯著的效果。
[0028] 13、染色體數(shù)目異常永生化質(zhì)控細(xì)胞庫的建立：將上述在不同時間制備的固定質(zhì) 控細(xì)胞（原液固定質(zhì)控細(xì)胞和應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞）以（甲醇：冰醋酸=3 : 1的）固定液 配成濃度為l〇5/ml的細(xì)胞懸液，經(jīng)分裝、加滿固定液至管口和封口后，按年、月、日的制備日 期及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號，集中保存于_2〇°C，備作染色體數(shù)目診斷的質(zhì)量控 制之用。同時將相應(yīng)的5種染色體數(shù)目異常核型的標(biāo)準(zhǔn)描述、按照年、月、日的制備日期以 及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號錄入計算機(jī)，使用時從計算機(jī)中抽取待用質(zhì)控細(xì)胞編 號，然后從質(zhì)控細(xì)胞庫中找出相應(yīng)的質(zhì)控細(xì)胞作質(zhì)量評價；活質(zhì)控細(xì)胞系（原液活質(zhì)控細(xì) 胞系和應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系）以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）配成濃度為10 5/ml的 細(xì)胞懸液，經(jīng)每管lml分裝后，按年、月、日的制備日期及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編 號，集中保存于_196°C液氮中，備作染色體數(shù)目診斷的質(zhì)量控制之用。同時將相應(yīng)的各種染 色體數(shù)目異常核型的標(biāo)準(zhǔn)描述、按照年、月、日的制備日期以及標(biāo)本來源地址的大寫英文字 母編號錄入計算機(jī)，使用時從計算機(jī)中抽取待用質(zhì)控細(xì)胞編號，然后從質(zhì)控細(xì)胞庫中找出 相應(yīng)的質(zhì)控細(xì)胞作質(zhì)量評價
[0029] 10、室內(nèi)質(zhì)控中的應(yīng)用：從計算機(jī)中抽取質(zhì)控細(xì)胞編號，然后從質(zhì)控細(xì)胞庫中找出 相應(yīng)的質(zhì)控細(xì)胞，發(fā)送到各實(shí)驗(yàn)室或相關(guān)專業(yè)技術(shù)人員，在收到質(zhì)控細(xì)胞后，作為室內(nèi)質(zhì)控 物，與臨床待作染色體數(shù)目異常診斷的標(biāo)本在相同條件下作同步染色體數(shù)目診斷。如果質(zhì) 控細(xì)胞的染色體數(shù)目診斷結(jié)果沒有達(dá)到要求，則說明診斷方法的試劑、儀器、操作方法等方 面有問題，應(yīng)查明原因、重新檢測后報告結(jié)果。
[0030] 11、室間質(zhì)評中的具體應(yīng)用：
[0031] ①準(zhǔn)備質(zhì)控細(xì)胞：取1例或數(shù)例質(zhì)控細(xì)胞，按需要的例次或比例混合，混合的質(zhì)控 細(xì)胞株還可經(jīng)擴(kuò)增后發(fā)放使用。現(xiàn)以5例染色體數(shù)目異常質(zhì)控細(xì)胞系等比例細(xì)胞數(shù)混合為 例，每種染色體數(shù)目異常的細(xì)胞各占20%。然后將質(zhì)控細(xì)胞發(fā)送到各受試對象做室間質(zhì)量 評價。
[0032] ②熒光原位雜交（FISH)檢測質(zhì)控細(xì)胞染色體數(shù)目及結(jié)果判定：各受試對象收到 質(zhì)控細(xì)胞后，如為活質(zhì)控細(xì)胞株，則可酌情對質(zhì)控細(xì)胞株進(jìn)行傳代擴(kuò)增后測試，以增加細(xì) 胞數(shù)；如為固定質(zhì)控細(xì)胞，則直接測試。試劑采用瑞士雅培制藥有限公司的AneuVysion 試劑盒，含有兩個不同的雜交區(qū)域，共完成5條染色體的數(shù)目分析：第18號（Spectrum Aqua,青色）、X(Spectrum Green,綠色）、Y(Spectrum Orange,紅色）號染色體為計數(shù)探 針（Chromosome Enumerating Probe，CEP)，混合后雜交第 1 個區(qū)域；第 13 號（Spectrum Green,淺綠色）和21 (Spectrum Orange,紫紅色）號染色體為區(qū)域特異性探針（Locus Specific Identifier，LSI)，混合后雜交第2個區(qū)域。方法是取13和21號染色體為位點(diǎn) 特異探針，18、X和Y染色體為著絲粒探針，將質(zhì)控細(xì)胞株（與實(shí)驗(yàn)室被檢標(biāo)本）同步，經(jīng) 2000r/min離心10min，去上清，留沉淀0. 2ml，離心管中加入4ml膠原酶37°C溫浴30min， 2000r/min離心10min，去上清，然后加入5ml預(yù)溫的15mol/L KC1，在37水浴中低滲25min， 2000r/min離心10min，去上清。加入新配制的固定液（甲醇：冰醋酸=3 : 1)固定10min， 離心2000r/min離心10min去上清，反復(fù)兩次。滴片，自然干燥老化。將制備好的標(biāo)本片自 冰柜中取出，依次放人70 %、85%、100%乙醇中脫水，室溫干燥，預(yù)處理好的玻片置73°C， 70%甲酰胺中5min。在暗室中將兩種探針混合液各10 μ 1加在玻片的靶區(qū)域，蓋上蓋玻片， 避免產(chǎn)生氣泡，封片膠將蓋玻片封好，置暗濕盒中42°C雜交過夜，清洗，在高倍鏡下觀察雜 交效果，每例標(biāo)本計數(shù)60?100個細(xì)胞，記錄雜交信號數(shù)目并采集圖像，要求細(xì)胞核膜必須 完整，核內(nèi)雜交信號明亮清晰無重疊，信號彌散及微弱均不作統(tǒng)計。
[0033] ③測試結(jié)果：經(jīng)探針雜交后，細(xì)胞內(nèi)的18號染色體顯示青色的點(diǎn)，每條18號顯示 1個青色的點(diǎn)，2條則顯示2個青色的點(diǎn)，3條則顯示3個青色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)X(女性）染色 體顯示綠色的點(diǎn)，每條X染色體顯示1個綠色的點(diǎn)，2條則顯示2個綠色的點(diǎn)，3條則顯示3 個綠色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)Y(男性）染色體顯示紅色的點(diǎn)，每條Y染色體顯示1個紅色的點(diǎn)，2條 則顯示2個紅色的點(diǎn)，3條則顯示3個紅色的點(diǎn)；細(xì)胞內(nèi)的13號染色體顯示淺綠色的點(diǎn)， 每條13號顯示1個淺綠色的點(diǎn)，2條則顯示2個淺綠色的點(diǎn)，3條則顯示3個淺綠色的點(diǎn)； 細(xì)胞內(nèi)的21號染色體顯示紫紅色的點(diǎn)，每條21號顯示1個紫紅色的點(diǎn)，2條則顯示2個紫 紅色的點(diǎn)，3條則顯示3個紫紅色的點(diǎn)。
[0034] 圖1為5種染色體數(shù)目異常質(zhì)控細(xì)胞等濃度等量混合、制片、熒光原位雜交所得結(jié) 果模擬圖，如圖1所示，細(xì)胞1為18-三體細(xì)胞，1. 1、1. 2、1. 3各代表1條18號染色體，細(xì)胞 內(nèi)多了 1條18號染色體，有3個青色的點(diǎn)，正常細(xì)胞為2條18號染色體、2個青色的點(diǎn)；細(xì) 胞2為少1條性染色體的細(xì)胞，2. 1代表1條X染色體，只有1個綠色的點(diǎn)，正常細(xì)胞應(yīng)還有 1條X染色體（1個綠色的點(diǎn)）或1條Y染色體（1個紅色的點(diǎn)）；細(xì)胞3為多1條Y染色體 的細(xì)胞，3. 1、3. 2各代表1條Y染色體，正常細(xì)胞只有1條Y染色體、1個紅色的點(diǎn)；細(xì)胞4 為13-三體細(xì)胞，4. 1、4.2、4. 3各代表1條13號染色體，細(xì)胞內(nèi)多了 1條13號染色體，有3 個淺綠色的點(diǎn)，正常細(xì)胞為2條13號染色體、2個淺綠色的點(diǎn)；細(xì)胞5為21-三體細(xì)胞，5. 1、 5. 2、5. 3各代表1條21號染色體，細(xì)胞內(nèi)多了 1條21號染色體，有3個紫紅色的點(diǎn)，正常細(xì) 胞為2條21號染色體、2個紫紅色的點(diǎn)。
[0035] ④結(jié)果評價：各受試實(shí)驗(yàn)室將結(jié)果包括染色體數(shù)目異常的種類、比例回報室間質(zhì) 評組織者，由組織者對各室結(jié)果作統(tǒng)一評比成績，找出誤診原因、討論改正措施，以動態(tài)發(fā) 現(xiàn)質(zhì)量問題、加強(qiáng)質(zhì)量管理、提高診斷質(zhì)量。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其制備方法，其主要特征 是取因臨床診治需要而作染色體病診斷后并已確診為常見染色體數(shù)目異常的剩余的活細(xì) 胞，分離淋巴細(xì)胞，在含環(huán)胞霉素 A和EBV的RPMI-1640培養(yǎng)液中經(jīng)37°C、5% C02培養(yǎng)，B淋 巴細(xì)胞形成具有無限繁殖能力的永生淋巴母細(xì)胞系，作傳代擴(kuò)增至所需量后凍存細(xì)胞系， 臨用時按質(zhì)控所需比例混合，使原先每例細(xì)胞系只有1種染色體數(shù)目異常制成包含特定比 例和多種組合的多項(xiàng)測試通用的更難鑒別診斷的染色體數(shù)目異常嵌合體質(zhì)控細(xì)胞，原始細(xì) 胞易得且將廢棄的多余細(xì)胞人為制成可按需倍增的實(shí)用而有效的質(zhì)控細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其 制備方法，其特征是常見染色體數(shù)目異常包含21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體 數(shù)目異常5類。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及 其制備方法，其特征是以EBV轉(zhuǎn)染B淋巴細(xì)胞的簡便方法制成了具有無限繁殖能力的、可按 需要量擴(kuò)增的永生化淋色細(xì)胞系。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1、3所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及 其制備方法，其特征是按質(zhì)控所需比例混合包含：以5例染色體數(shù)目異常原液活質(zhì)控細(xì)胞 系之比均為1 : 1的等濃度、等體積或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)， 制成等比應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系，理論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的 核型各占20%;以1例原液活質(zhì)控細(xì)胞系與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0.5、1 : 1、 1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20 ?50 的體積比例或 細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行混合，制成不等比應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目 異常；以5例染色體數(shù)目異常的原液固定質(zhì)控細(xì)胞，以5例之比均為1 : 1的等濃度、等體 積或細(xì)胞數(shù)進(jìn)行混合（如各取lml，混合液總體積為5ml)，制成等比應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞，理 論上21-三體、18-三體、13-三體、X和Y染色體數(shù)目異常的核型各占20% ;以1例原液固 定質(zhì)控細(xì)胞與另外的1例、2例、3例或4例按1 : 0. 5、1 : 1、1 : 2、1 : 3、1 : 4、1 : 5、 1 : 6、1 : 7、1 : 8、1 : 9、1 : 10、1 : 20?50的體積比例或細(xì)胞數(shù)比例進(jìn)行混合，制成 不等比應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞，含有不同類型和比例的染色體數(shù)目異常，如某1例取lml與另1 例取50ml混合，則理論上前者的嵌合體比例為2%,后者為98%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及 其制備方法，其特征是每1份質(zhì)控細(xì)胞包含有1?5種不同的染色體數(shù)目異常，可同時用于 相對應(yīng)的1?5種染色體數(shù)目異常檢測的質(zhì)量控制，無需備用多份質(zhì)控物，使用方便、經(jīng)濟(jì)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1、4所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及 其制備方法，其特征是每1份質(zhì)控細(xì)胞由1?5種不同比例的染色體數(shù)目異常細(xì)胞組合而 成，能設(shè)定染色體數(shù)目異常檢出率（百分比）的界限和質(zhì)量指標(biāo)；5種染色體數(shù)目異常質(zhì)控 細(xì)胞之間以及與正常細(xì)胞之間可配制2%?100%的某1種或數(shù)種染色體數(shù)目異常的嵌合 體質(zhì)控細(xì)胞，能反映、控制低比例染色體數(shù)目異常的檢測質(zhì)量，或達(dá)到與低比例染色體數(shù)目 異常的實(shí)際病例的同步檢測，具有更有效的質(zhì)量控制和質(zhì)量評價效果。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其 制備方法，其特征是染色體數(shù)目異常永生化質(zhì)控細(xì)胞庫包含：以固定液（甲醇：冰醋酸= 3 : 1的）為媒介的、-20°C保存的、按年、月、日的制備日期及標(biāo)本來源地址的大寫英文字 母編號的、細(xì)胞濃度為l〇5/ml的、由原液固定質(zhì)控細(xì)胞和應(yīng)用固定質(zhì)控細(xì)胞構(gòu)成的固定質(zhì) 控細(xì)胞；以凍存液（5%二甲亞砜、95%胎牛血清）為媒介的、-196°C液氮保存的、按年、月、 日的制備日期及標(biāo)本來源地址的大寫英文字母編號的、細(xì)胞濃度為l〇 5/ml的、由原液活質(zhì) 控細(xì)胞系和應(yīng)用活質(zhì)控細(xì)胞系構(gòu)成的活質(zhì)控細(xì)胞系。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷EBV轉(zhuǎn)染嵌合體質(zhì)控細(xì)胞及其 制備方法，其特征在于，涉及以染色體結(jié)構(gòu)異常、除5種常見染色體數(shù)目異常以外的第1號 至第22號染色體數(shù)目異常的細(xì)胞為原始細(xì)胞所制備的質(zhì)控細(xì)胞系。
【文檔編號】C12Q1/70GK104059884SQ201310109782
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月19日
【發(fā)明者】翁炳煥 申請人:翁炳煥