一種無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種在基因診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，以基因芯片為平臺(tái)技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的方法。本發(fā)明所述的微陣列基因芯片包括片基及固定在片基上的探針，所述的探針如表1-2所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述的診斷方法包括如下步驟：待測(cè)DNA制備，多重PCR擴(kuò)增，芯片雜交，數(shù)據(jù)處理和圖像分析，芯片掃描并獲得結(jié)果。同時(shí)，本發(fā)明還包含所述微陣列芯片無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的試劑盒；本發(fā)明所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的診斷方法簡(jiǎn)便；檢測(cè)具有高通量、特異性好、高靈敏度的特點(diǎn)，可以快速篩查各個(gè)位點(diǎn)是野生型還是突變型，并將先天性耳聾疾病的診斷提高到基因水平上；采用無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)，節(jié)約成本時(shí)間，減少病人痛苦。
【專利說明】一種無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種以微陣列基因芯片技術(shù)為平臺(tái)技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]聾病是影響人類健康和造成人類殘疾的常見原因，我國(guó)現(xiàn)有2000多萬聾啞人， 占?xì)埣踩丝倲?shù)1/3，并以每年新生兒3萬的速度增長(zhǎng)。耳聾發(fā)生的原因、是否具有遺傳性、生育或再次生育是否安全，是耳聾患者及耳聾家庭極為關(guān)心的問題。據(jù)各國(guó)統(tǒng)計(jì)，有 1/2000(0.05% ) 一 1/1000(0.1% )的兒童出生時(shí)為極重度耳聾；同時(shí)，一半以上的兒童期耳聾是由于遺傳因素造成的。另外在大量的遲發(fā)性聽力下降患者中，亦有許多患者由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態(tài)性造成對(duì)致聾環(huán)境因素易感性增加而致病。
[0003]在遺傳性耳聾中，有70%為 NSHI (nonsyndromie hearingim pairment 非綜合征型耳聾)，大約75%?85%的NSHI表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳模式，15%?24%為常染色體顯性遺傳模式，其余1%?2%為X連鎖遺傳模式。隨著人類基因組計(jì)劃的完成以及對(duì)耳聾疾病致病機(jī)制的研究不斷深入，遺傳性耳聾的病因?qū)W研究有了很大進(jìn)展，目前至少有60余個(gè)耳聾基因被克隆，這些發(fā)現(xiàn)提示我們遺傳性耳聾具有很高的遺傳異質(zhì)性，遺傳性耳聾的基因診斷涉及到多個(gè)基因的檢測(cè)，從而加重了遺傳性耳聾分子診斷的難度。
[0004]大量的研究表明，GJB2、SLC26A4(PDS)和線粒體基因(mtDNA)的病理性突變導(dǎo)致了大部分的遺傳性耳聾，并被證明是中國(guó)聾啞人群三種最常見的致聾基因突變。利用基因診斷技術(shù)對(duì)這三個(gè)常見基因檢測(cè)，可在大約70 %的遺傳性耳聾患者發(fā)現(xiàn)致聾基因突變，這不僅可以耳聾患者明確病因，還使耳聾的遺傳咨詢與產(chǎn)前診斷成為可能。這不僅使耳聾患者明確病因，還為耳聾的遺傳咨詢提供了理論依據(jù)及科學(xué)手段，使先天性耳聾產(chǎn)前診斷結(jié)果更客觀準(zhǔn)確。
[0005]目前，可用于先天性耳聾產(chǎn)前診斷的技術(shù)主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光原位雜交及基因芯片等技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)該技術(shù)是分子實(shí)驗(yàn)室重要的診斷技術(shù)之一，在體外擴(kuò)增DNA片段用于遺傳學(xué)分析，包括巢式PCR、多重PCR、 熒光PCR、熒光定量PCR等。主要用于由于基因缺失而引起的疾病的診斷和多態(tài)性分析，即在致病基因附近尋找?guī)讉€(gè)與其緊密連鎖的DNA多態(tài)性位點(diǎn)，通過連鎖分析進(jìn)行診斷和攜帶者檢測(cè)。但是PCR技術(shù)受到擴(kuò)增效率、等位基因脫扣、污染的可能的影響可能導(dǎo)致誤診， 并且PCR僅能檢測(cè)已知的異常。突光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)該技術(shù)是利用熒光素標(biāo)記的探針與DNA片段特異性雜交，探針與特異DNA片段結(jié)合形成的 雜交分子可以在熒光顯微鏡熒光激發(fā)下顯示熒光信號(hào)，依據(jù)判定信號(hào)的有無及類型達(dá)到診斷染色體病的目的。此方法無需細(xì)胞培養(yǎng)，僅24小時(shí)即可得到結(jié)果，污染機(jī)率小、信號(hào)直觀、檢測(cè)時(shí)間短，應(yīng)用較廣泛。熒光原位雜交的探針包含以下幾種:著絲粒探針 (combining centromere probe, CEP)、位點(diǎn)特異性探針(focus-specific probe, LSI)、端粒探針(telomere probe, Tel)、全染色體涂抹探針(whole chromosome probe, WCP)和跨斷裂點(diǎn)探針(span break-point probe)。應(yīng)用不同類型的探針可以篩查先天性耳聾疾病基因攜帶者進(jìn)行遺傳學(xué)診斷。
[0006]PCR及FISH技術(shù)即成為大家公認(rèn)并相繼使用的方法。但是這兩種方法都存在本身的缺陷，PCR僅可檢測(cè)已知的異常。熒光原位雜交技術(shù)是利用熒光素標(biāo)記的探針與染色體特異性雜交，依據(jù)顯微鏡觀察熒光信號(hào)判定結(jié)果正常與否，信號(hào)直觀、檢測(cè)時(shí)間短。但是由于檢驗(yàn)的樣本來源極為有限，通常僅有1-2個(gè)卵裂球細(xì)胞。FISH技術(shù)僅可檢測(cè)少量染色體及基因。然而先天性耳聾疾病的發(fā)生涉及多條染色體的多個(gè)基因，F(xiàn)ISH技術(shù)并不能滿足產(chǎn)前先天性耳聾篩查的需要。
[0007]基因芯片技術(shù)是指將特定寡核苷酸片段作為探針固定于支持物上，摻入標(biāo)記物的目的DNA片段通過PCR等技術(shù)擴(kuò)增后，然后按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配用相關(guān)分析軟件對(duì)每一探針上的信號(hào)作出比較和檢測(cè)。目前該技術(shù)在疾病檢測(cè)領(lǐng)域已得到了廣泛的應(yīng)用。通過檢測(cè)孕婦及其配偶常見遺傳性耳聾致病基因突變攜帶情況，可早期發(fā)現(xiàn)遺傳性耳聾生育風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)合產(chǎn)前診斷有效降低遺傳性耳聾的發(fā)病率。相對(duì)PCR擴(kuò)增測(cè)序等方法，遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)具有結(jié)果可信度高、通量大、速度快、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于遺傳性耳聾產(chǎn)前基因檢測(cè)。
[0008]傳統(tǒng)的先天性耳聾診斷方法需要對(duì)孕17-20周的孕婦進(jìn)行羊水穿刺，對(duì)羊水細(xì)胞及羊水培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)耳聾基因全序列擴(kuò)增測(cè)序，從而對(duì)夫婦雙方攜帶先天性耳聾致病基因進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行遺傳性耳聾生育風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。這大大的加大了檢測(cè)的時(shí)間，并給受檢測(cè)者帶來了精神和身體上的雙重痛苦，不適用于產(chǎn)前診斷。因此，尋找一種高靈敏度的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的方法是非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的內(nèi)容在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種以基因芯片技術(shù)為平臺(tái)技術(shù)的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的方法。本發(fā)明診斷先天性耳聾遺傳病的診斷技術(shù)操作步驟簡(jiǎn)便，具有高通量的特點(diǎn)，可以快速篩查先天性耳聾相關(guān)基因的變異，并將先天性耳聾疾病的診斷提高到基因水平上；檢測(cè)的特異性好，且具有高分辨率、高靈敏度、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)，采用無創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)，節(jié)約成本時(shí)間，減少病人痛苦。能用于產(chǎn)前先天性遺傳病的診斷，在無創(chuàng)產(chǎn)前診斷領(lǐng)域具有很大的潛力。
·[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0011]第一方面，本發(fā)明涉及一種分布如表1-1所示的核苷酸序列的微陣列基因芯片， 包括微陣列芯片的片基及固定在片基上的檢測(cè)先天耳聾相關(guān)基因的探針。
[0012]優(yōu)選地，所述的探針的序列如表1-1所示:
[0013]表1-1?探針序列
[0014]
【權(quán)利要求】
1.一種無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，包括片基及固定在片基上的檢測(cè)先天性耳聾相關(guān)基因的探針。
2.權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，其上探針的序列如下所示:
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，其特征是:所述片基為載玻片、硅片或膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，其特征是:所述片基的材質(zhì)為高分子材料。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片的制備方法，包括如下步驟:片基的酸堿預(yù)處理，醛基化處理，異硫氰酸化處理，芯片探針的設(shè)計(jì)，探針的點(diǎn)制，立即將玻片在80°C烘烤lOmin，制成微陣列玻片，存儲(chǔ)在帶有干燥劑的盒子里，室溫保存即得。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片的使用方法，其特征在于包括如下步驟:待測(cè)DNA制備，多重PCR擴(kuò)增，芯片雜交，數(shù)據(jù)處理和圖像分析，芯片掃描獲得結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片的使用方法，其特征在于所述的PCR擴(kuò)增中所用的引物對(duì)如下表所示:
8.一種用于無創(chuàng)產(chǎn)前診斷先天性耳聾遺傳病的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權(quán)利要求I所述的微陣列基因芯片。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103436609SQ201310348724
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月13日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:康盈創(chuàng)新生物技術(shù)(北京)有限公司