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用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物及其應用的制作方法

文檔序號:12697651閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的特異性引物,其特征在于,所述特異性引物包括上游引物MeJB3F和下游引物MeJB4.5R,

所述MeJB3F的核苷酸序列為:5'-TGAAAGAATTCATGAATTGAAAACG-3';

所述MeJB4.5R的核苷酸序列為:5'-AGATTTCATATTGTATTTAATTTTTG-3'。

2.一種可用于檢測豬長刺后圓線蟲的檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應液、以及引物混合液,所述引物混合液包括如權利要求1所述的特異性引物。

3.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述檢測試劑盒還包括陽性對照液,所述陽性對照液包括豬長刺后圓線蟲DNA。

4.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述DNA裂解液主要由100mM NaCl70μl、pH值為8.0的10mM Tris-Cl 30μl、pH值為8.0的25mM EDTA150μl、1%W/V十二烷基硫酸鈉30μl和1.7μg/μL蛋白酶K200μl組成。

5.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述PCR反應液包括PCR緩沖液、25mM MgCl2溶液和2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液。

6.根據(jù)權利要求2所述的檢測試劑盒,其特征在于,所述引物混合液中,所述MeJB3F和MeJB4.5R的濃度均為100pmol/μL。

7.一種如權利要求1所述的特異性引物在檢測豬長刺后圓線蟲的應用。

8.根據(jù)權利要求7所述的應用,其特征在于,利用所述特異性引物制成檢測試劑盒,所述檢測試劑盒包括用于對樣品DNA進行裂解的DNA裂解液、對樣品DNA進行擴增的PCR反應液、以及引物混合液,所述引物混合液包括所述特異性引物,所述檢測試劑盒的使用方法包括以下步驟:

(1)DNA的提取:取待測蟲體樣品用雙蒸水反復吹打沖洗,移去雙蒸水,加入DNA裂解液置于37~55℃溫箱中16-18h,再提取DNA,制備得到樣品DNA;

(2)PCR擴增:取滅菌ddH2O、PCR反應液、Taq酶和引物混合液按適合的PCR反應體系加入離心管中,混勻后分裝放入多個離心管中制得多份分裝液,取步驟(1)制備的樣品DNA,每一樣品DNA對應加入一份分裝液中并標號,混勻,置于PCR擴增儀上按適合的PCR擴增條件反應,制得PCR擴增產物;

(3)PCR產物觀察:取步驟(2)制備的PCR擴增產物依標號加樣于1.0%瓊脂糖凝膠上,120~130V電壓電泳20~40分鐘后,置于紫外透射儀下觀察是否出現(xiàn)條帶,若存在400bp~410bp大小的條帶,則待測蟲體樣品為豬長刺后圓線蟲;若不存在400bp~410bp大小的條帶,則待檢測蟲體樣品不是豬長刺后圓線蟲。

9.根據(jù)權利要求8所述的應用,其特征在于,所述步驟(2)中PCR反應體系為緩沖液2~3μL、25mM的MgCl2溶液3~4μL、2.0mM脫氧核糖核苷酸溶液2μL、5U/μL的Taq酶0.25~0.3μL、樣品DNA0.8~1μL、引物混合液0.8~1.2μL,余量為ddH2O補至25μL。

10.根據(jù)權利要求8所述的應用,其特征在于,所述步驟(2)中PCR擴增條件為:94℃預變性5min;94℃變性30sec、52~58℃退火30sec、72℃延伸30sec,共38個循環(huán);72℃延伸5min。

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