本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及一種用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標記及其應用。

背景技術(shù)：

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，目前全球有超過1/3的人口感染了結(jié)核分枝桿菌，每年有200萬人因結(jié)核病死亡。結(jié)核分枝桿菌除感染人外，還感染50多種哺乳動物和20多種禽類；在家畜中，牛最易感染牛型結(jié)核分枝桿菌而發(fā)生結(jié)核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛，不但影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展，造成經(jīng)濟損失，而使人畜健康受到嚴重威脅。結(jié)核病是全球重要的公共衛(wèi)生問題，在一些發(fā)達國家如德國、澳大利亞等國的人結(jié)核病患者中，約0.2％～0.3％是由牛型結(jié)核分枝桿菌引起的，而在埃塞俄比亞、尼日利亞、坦桑尼亞等不發(fā)達國家中，這個比例高達17.0％一26.1％。由此可見，控制牛結(jié)核病不僅對于動物疫病防治，還是對人健康，都具有重大的公共衛(wèi)生學意義。

結(jié)核病的早期診斷對結(jié)核病的控制至關(guān)重要，而結(jié)核病防治的最大挑戰(zhàn)之一就是缺乏早期、快速、敏感和特異的診斷工具。目前分枝桿菌菌種的鑒定，傳統(tǒng)的分類、鑒定系統(tǒng)主要以形態(tài)和生理生化特征的綜合指標為依據(jù)，易受多種因素影響，鑒定結(jié)果極不可靠，存在著很大的異質(zhì)性，鑒定一種菌種耗時長約4周，還不包括培養(yǎng)所需時間4-8周，因此有較大局限性。如PNB、TCH鑒別培養(yǎng)基進行菌種鑒定，雖然已被常規(guī)應用，但其為臨床提供信息緩慢，而且鑒定出的菌種有一定局限性，只能區(qū)分出結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，不能進一步進行種的鑒定。

目前，應用分子生物學技術(shù)鑒定分枝桿菌菌種不僅快速可靠，而且具有成本低廉，可建立標準化操作程序的優(yōu)點，成為快速鑒定分枝桿菌的新方法?；谂Ｐ头种U菌PstS基因的特異性突變位點的分子生物學檢測技術(shù)，高效、靈敏、特異度高，用于檢測牛型結(jié)核分枝桿菌，可以將牛型結(jié)核分枝桿菌與其它分枝桿菌區(qū)分開。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標記及其應用。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標記，所述SNP標記位于牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，該序列第53位堿基C為SNP突變位點。利用該特異性突變位點將牛型分枝桿菌從分枝桿菌中分離出來。

本發(fā)明所述牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因的部分核苷酸序列如SEQID No:2所示。

本發(fā)明還提供用于實時熒光定量PCR檢測所述SNP標記的引物及探針，上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'，下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'。探針：5'-FAM-ACCAGGCTCATTTC-MGB-3'。

本發(fā)明還提供含有所述引物及探針的實時熒光定量PCR檢測試劑盒。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括標準陽性模板。

本發(fā)明還提供所述引物及探針或所述試劑盒在鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌中的應用。

包括以下步驟：

1)提取待測樣品的DNA；

2)以上述提取的DNA為模板，利用所述引物及探針，進行實時熒光定量PCR擴增；

3)分析PCR擴增產(chǎn)物。

其中，步驟2)中實時熒光定量PCR擴增反應體系：2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，上、下游引物及探針的終濃度為250nmol/L，DNA模板2μl，去離子水加至總量為20μl。

實時熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性10min；95℃變性15s，59.3℃退火60s，共40個循環(huán)。

實時熒光定量PCR所用的儀器為BIO RAD MJ MiniOpticon。

步驟3)根據(jù)是否出現(xiàn)擴增曲線，分析是否含有牛型結(jié)核分枝桿菌；含有牛型結(jié)核分枝桿菌的待測樣品會出現(xiàn)擴增曲線，表現(xiàn)為陽性結(jié)果；不含有牛型結(jié)核分枝桿菌的待測樣品不出現(xiàn)擴增曲線，表現(xiàn)為陰性結(jié)果。

本發(fā)明基于熒光定量PCR原理，提供一種檢測特異性堿基突變位點的實時熒光定量PCR方法。基本原理為：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個猝滅熒光基團。探針完整時，報告熒光基團發(fā)射的熒光信號被猝滅熒光基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和猝滅熒光集團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可以接受到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，即當有目的片段存在時，就會發(fā)生擴增反應，并通過熒光信號檢測到。

本方法適用于體外檢測牛型結(jié)核分枝桿菌感染。人或動物在感染了牛型結(jié)核分枝桿菌后，可通過檢測相應預處理的標本微量基因的方法，確認感染成立。檢測標本包括痰，組織，核酸等。

本發(fā)明在現(xiàn)有熒光定量PCR技術(shù)的基礎上，應用牛型結(jié)核分枝桿菌的特異性堿基突變位點，建立檢測牛型結(jié)核分枝桿菌的實時熒光定量PCR方法，并結(jié)合spoligotyping，多位點序列分析等方法對牛型結(jié)核分枝桿菌和其他分枝桿菌進行鑒定，從而評價基于該堿基突變位點建立起來的用于檢測牛型結(jié)核分枝桿菌熒光定量PCR方法的靈敏度和特異度。

本發(fā)明建立了一種高效、靈敏、特異度高的用于檢測牛型結(jié)核分枝桿菌的熒光定量PCR方法?；诒景l(fā)明的檢測方法可用于結(jié)核病的輔助診斷，流行病學監(jiān)測與感染篩查等相關(guān)領(lǐng)域。具有優(yōu)點如下：

(一)本發(fā)明采用的堿基突變位點特異性高，能夠特異性地將牛型分枝桿菌與其他分枝桿菌區(qū)分開來。

(二)本發(fā)明與熒光定量PCR方法相結(jié)合，即標本中有微弱的細菌存在即能被檢測到，因此靈敏度高。

(三)通過批間、批內(nèi)實驗檢測，實時熒光定量PCR方法重復性較好，有利于質(zhì)量控制，且成本較低，適合大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)及檢測。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例3中利用實時熒光定量PCR方法檢測牛型分枝桿菌的特異度結(jié)果；其中，牛型結(jié)核分枝桿菌標準株及卡介苗菌株出現(xiàn)陽性擴增曲線，表現(xiàn)為陽性結(jié)果，其他19種分枝桿菌標準株未出現(xiàn)陽性擴增曲線，表現(xiàn)為陰性結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實施例3中利用實時熒光定量PCR方法檢測牛型分枝桿菌的靈敏度結(jié)果；其中，A：利用實時熒光定量PCR方法檢測牛型分枝桿菌DNA靈敏度結(jié)果，DNA濃度范圍為1.0×10⁷～1.0×10⁰copies/μl，B：所建立的標準曲線。

圖3為本發(fā)明實施例3中利用實時熒光定量PCR方法檢測牛型分枝桿菌模擬樣本的靈敏度結(jié)果；其中，A：靈敏度檢測結(jié)果，濃度范圍為1.0×10⁸～1.0×10⁰cell/ml，B：所建立的標準曲線。

圖4為本發(fā)明實施例1中人型結(jié)核分枝桿菌與牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因部分序列比對結(jié)果；其中，*號上方序列來自人型結(jié)核分枝桿菌，*號下方序列來自牛型結(jié)核分枝桿菌,*表示相同堿基。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1牛型結(jié)核分枝桿菌SNP標記的開發(fā)及特異性探針、引物的設計與合成

根據(jù)牛型結(jié)核分枝桿菌的特異性堿基突變位點及所在DNA序列，利用軟件ABI primer Express 2.0設計引物及探針，由北京天一輝遠公司合成MGB標記的探針及普通PCR擴增所用引物。

本發(fā)明的牛型結(jié)核分枝桿菌SNP標記位于牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因上，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，該序列第53位堿基C為SNP突變位點。利用該特異性突變位點將牛型分枝桿菌從分枝桿菌中分離出來。

人型結(jié)核分枝桿菌與牛型結(jié)核分枝桿菌PstS基因部分序列比對結(jié)果見圖4。

根據(jù)該特異性突變位點設計出用于實時熒光定量PCR檢測所述SNP標記的引物及探針。

上游引物：5'-TTTCTGCACTGGGCGATCA-3'

下游引物：5'-CAACGCGTCAGACAACTTCAC-3'

探針：5'-(FAM)ACCAGGCTCATTTC(MGB)-3'

實施例2牛型結(jié)核分枝桿菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立

試劑組成如下：

(1)基于PstS基因的特異性突變點設計的特異性MGB標記探針及引物；

(2)擴增反應所需的酶，即2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)；

(3)去離子水；

(4)實時熒光定量PCR所用的儀器，即BIO RAD MJ MiniOpticon。

20μl反應總體系包括2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，終濃度為250nmol/L上、下游引物及探針，待測核酸樣品2μl，去離子水加至總量20μl。

實時熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性10min；95℃變性15s，59.3℃退火60s，共40個循環(huán)。

實施例3實時熒光定量PCR檢測方法的特異性及靈敏度評價

1、特異性檢測

分別取牛型結(jié)核分枝桿菌標準株，卡介苗(BCG)，結(jié)核分枝桿菌標準株H37RV，非結(jié)核分枝桿菌標準株(常見致病菌瘰疬分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌，胞內(nèi)分枝桿菌，膿腫分枝桿菌，鳥分枝桿菌，偶發(fā)分枝桿菌，蘇爾加分枝桿菌，龜分枝桿菌，蟾蜍分枝桿菌，施氏分枝桿菌，猿猴分枝桿菌，亞洲分枝桿菌，非洲分枝桿菌，戈登分枝桿菌，M.wolinskyi，M.peregrinum，M.diernhoferi，M.malmoense)共21種菌，采用水煮法提取相應基因組核酸存于-20℃冰箱備用。

20μl反應總體系包括2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，終濃度為250nmol/L上、下游引物及探針，待測核酸樣品2μl，去離子水加至總量20μl。

實時熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性10min；95℃變性15s，59.3℃退火60s，共40個循環(huán)。

實驗結(jié)果，除了牛型分枝桿菌標準株及BCG采用該方法結(jié)果為陽性，其余菌株都表現(xiàn)為陰性，該方法顯示出良好的特異性。(圖1)

2、靈敏度檢測

2.1構(gòu)建質(zhì)粒評估所述方法的靈敏度

將含有目的片段(SEQ ID No:1)的PCR產(chǎn)物鏈接到pMD-19T載體上，將重組體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH-5α上并37℃過夜培養(yǎng)，使用天根中提質(zhì)粒試劑盒提取含有目的片段的質(zhì)粒，并通過測序驗證目的片段，然后測量質(zhì)粒濃度并換算為拷貝數(shù)，并倍比稀釋質(zhì)?？截悢?shù)形成以下梯度1.0×10⁷～1.0×10⁰copies/μl。

20μl反應總體系包括2×Premix Ex Taq(TaKaRa DRR390)10μl，終濃度為250nmol/L上、下游引物及探針，待測核酸樣品2μl，去離子水加至總量20μl。

實時熒光定量PCR擴增程序：95℃預變性10min；95℃變性15s，59.3℃退火60s，共40個循環(huán)。

實驗結(jié)果，以上述的梯度濃度質(zhì)粒為模板，檢測該方法能夠檢測DNA的最低限，結(jié)果顯示最低限為1.0×10¹copies/μl，表明該方法靈敏度高。(圖2A和B)

質(zhì)量控制評估：

(1)批內(nèi)實驗，同時做三組不同濃度梯度的平行實驗，觀察Ct值差異情況。(表1)

表1批內(nèi)實驗ct值及變異系數(shù)分析

(2)批間實驗，不同時期做三組不同濃度梯度的平行實驗，觀察Ct值差異情況。(表2)

表2批間實驗ct值及變異系數(shù)分析

批間批內(nèi)實驗結(jié)果表明，變異系數(shù)范圍分別為0.38-3.65，0.09-2.44，表現(xiàn)出良好的重復性。

2.2模擬樣本靈敏度檢測

將牛型結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物磨菌比濁到1個麥氏濃度(對應的細菌數(shù)為3.0×10⁸cell/ml)，并分別稀釋到以下梯度濃度(1.0×10⁸～1.0×10⁰cell/ml)，然后80℃滅活以上梯度標本，100℃沸水浴提取基因組，采用上述方法，檢測模擬樣本最低限。結(jié)果顯示模擬樣本最低檢測限為1.0×10¹cell/ml，顯示良好的敏感度。(圖3A和B)

實施例4實時熒光定量PCR檢測方法用于檢測臨床樣本

選取經(jīng)spoligotyping分析結(jié)果驗證為牛型結(jié)核分枝桿菌或BCG菌株共27株進行驗證，該27株菌采用上述熒光定量PCR方法檢測結(jié)果為陽性；選取經(jīng)spoligotyping分析結(jié)果驗證為北京家族，T家族，U家族，MANU家族等共12種家族26株人型結(jié)核分枝桿菌臨床株進行驗證，結(jié)果為陰性；選取經(jīng)多位點序列分析(MLSA)結(jié)果驗證為胞內(nèi)分枝桿菌，膿腫分枝桿菌，堪薩斯分枝桿菌等6種16株非結(jié)核分枝桿菌臨床菌株進行驗證，結(jié)果為陰性。表明上述建立的方法具有良好的特異性。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的用于鑒定牛型分枝桿菌的實時熒光定量PCR方法，最低DNA檢測限為1.0×10¹copies/μl，最低模擬樣本檢測限為1.0×10¹cell/ml，顯示出良好的敏感度。根據(jù)DNA檢測靈敏度所建立的標準曲線，相關(guān)系數(shù)為0.997，斜率-3.144，表明線性關(guān)系較好。此外模擬樣本較DNA線性關(guān)系差，可以理解，因為菌液相比于純基因組中存在一些干擾雜質(zhì)，影響線性關(guān)系。

經(jīng)臨床菌株驗證，除牛型分枝桿菌及卡介苗菌株采用上述方法顯示陽性，其余分枝桿菌均為陰性，顯示良好的特異性。

批間批內(nèi)實驗，可見變異系數(shù)范圍分別為0.38-3.65，0.09-2.44，表現(xiàn)出良好的重復性，有利于質(zhì)量控制。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

序列表

<110> 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所

<120> 用于鑒定牛型結(jié)核分枝桿菌的SNP標記及其應用

<130> KHP171110553.4

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 102

<212> DNA

<213> 牛型結(jié)核分枝桿菌

<400> 1

tttctgcact gggcgatcac cgacggcaac aaggcctcgt tcctcgacca ggctcatttc 60

cagccgctgc cgcccgcggt ggtgaagttg tctgacgcgt tg 102

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> 牛型結(jié)核分枝桿菌

<400> 2

gtgaaaattc gtttgcatac gctgttggcc gtgttgaccg ctgcgccgct gctgctagca 60

gcggcgggct gtggctcgaa accaccgagc ggttcgcctg aaacgggcgc cggcgccggt 120

actgtcgcga ctacccccgc gtcgtcgccg gtgacgttgg cggagaccgg tagcacgctg 180

ctctacccgc tgttcaacct gtggggtccg gcctttcacg agaggtatcc gaacgtcacg 240

atcaccgctc agggcaccgg ttctggtgcc gggatcgcgc aggccgccgc cgggacggtc 300

aacattgggg cctccgacgc ctatctgtcg gaaggtgata tggccgcgca caaggggctg 360

atgaacatcg cgctagccat ctccgctcag caggtcaact acaacctgcc cggagtgagc 420

gagcacctca agctgaacgg aaaagtcctg gcggccatgt accagggcac catcaaaacc 480

tgggacgacc cgcagatcgc tgcgctcaac cccggcgtga acctgcccgg caccgcggta 540

gttccgctgc accgctccga cgggtccggt gacaccttct tgttcaccca gtacctgtcc 600

aagcaagatc ccgagggctg gggcaagtcg cccggcttcg gcaccaccgt cgacttcccg 660

gcggtgccgg gtgcgctggg tgagaacggc aacggcggca tggtgaccgg ttgcgccgag 720

acaccgggct gcgtggccta tatcggcatc agcttcctcg accaggccag tcaacgggga 780

ctcggcgagg cccaactagg caatagctct ggcaatttct tgttgcccga cgcgcaaagc 840

attcaggccg cggcggctgg cttcgcatcg aaaaccccgg cgaaccaggc gatttcgatg 900

atcgacgggc ccgccccgga cggctacccg atcatcaact acgagtacgc catcgtcaac 960

aaccggcaaa aggacgccgc caccgcgcag accttgcagg catttctgca ctgggcgatc 1020

accgacggca acaaggcctc gttcctcgac caggctcatt tccagccgct gccgcccgcg 1080

gtggtgaagt tgtctgacgc gttgatcgcg acgatttcca gctag 1125

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tttctgcact gggcgatca 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caacgcgtca gacaacttca c 21

<210> 5

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accaggctca tttc 14