專利名稱：一種螢火蟲熒光素酶的編碼基因及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子酶學與生物技術，更具體涉及一種高熱穩(wěn)定性及高酶活螢火蟲熒光素酶的編碼基因，同時涉及該突變株編碼基因的制備方法。該突變基因編碼的高熱穩(wěn)定性及高酶活螢火蟲熒光素酶突變株蛋白的用途，螢火蟲熒光素酶的編碼基因可以廣泛應用于食品、醫(yī)藥及生物等領域。
背景技術：
熒光素酶是現(xiàn)今生物領域中最重要的工具酶之一，北美螢火蟲熒光素酶是其中應用較廣泛的熒光素酶，其由于不需要激發(fā)光源，發(fā)光能量主要來自化學反應并且發(fā)光可持續(xù)一定的時間得到科研，醫(yī)藥及食品行業(yè)的青睞。在科研領域，螢火蟲熒光素酶較突出的應用在于它可以作為報告基因來使用。其內(nèi)源性低，哺乳動物無內(nèi)源性表達；熒光素酶檢測不受其他物質(zhì)的影響；采用發(fā)光檢測，簡單易操作；并且檢測靈敏度高，檢測范圍廣。還可用于細胞增殖，細胞毒性檢測等其他方面的應用。在醫(yī)藥行業(yè)，特別是在做新型藥物篩選方面，很多公司都采用螢火蟲熒光素酶來篩選新型藥物，可以實現(xiàn)快速，便捷，高通量的篩選，大大提高了工作效率，節(jié)省了時間，對于新藥物的篩選有著很大的貢獻。在食品衛(wèi)生行業(yè)，螢火蟲熒光素酶同樣有著重要的作用。由于螢火蟲熒光素酶其中一個底物是ATP，而ATP是細胞能量的直接來源，存在于從微生物到高等動植物細胞的所有生物體中，通過ATP的測定可以直接反應細胞或微生物的含量。2005年，衛(wèi)生部發(fā)布的 《衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)建設指導意見》中規(guī)定省、市、縣三級衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)必須配備ATP熒光檢測儀，用于食品衛(wèi)生和醫(yī)療衛(wèi)生的現(xiàn)場檢測。雖然螢火蟲熒光素酶存在著重要的應用價值，但由于該酶自身存在的熱穩(wěn)定性差，抗蛋白酶降解功能較差的缺陷，故有很多針對提高螢火蟲熒光素酶穩(wěn)定性或酶活方面的改造，以期更好的發(fā)揮和實現(xiàn)螢火蟲熒光素酶的功能和作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種螢火蟲熒光素酶的編碼基因，具有SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變體酶，該突變酶具有SEQ IDN0. 2所示的氨基酸序列。在北美螢火蟲firefly Iuciferase基因中通過overlap PCR引入突變，連接于表達載體，生產(chǎn)高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的FIREFLYLUCIFERASE突變酶，該突變酶的發(fā)光強度是野生型的15-20倍左右，并且較野生型具有良好的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白的制備方法，該方法是構(gòu)建原核表達載體，利用親和層析方法純化高酶活高熱穩(wěn)定性的螢火蟲熒光素酶，該方法簡單易行，操作簡便，成本低廉。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白在食品、醫(yī)藥上的應用，其中一個比較重要的應用就是利用該突變酶在菌體檢測中的應用。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施本發(fā)明的一個目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，其特征是在野生型 firefly Iuciferase基因上具有1060位由G突變?yōu)锳，1267位由A突變?yōu)門，1307位由A 突變?yōu)镚，1589位由T突變?yōu)镚的4個點突變。一種高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白的編碼基因的制備方法，其步驟是1.突變酶 FIREFLY LUCIFERASE-E354K，I423L, D436G, L530R 突變位點的引入(1)設計兩組誘變引物，采用overlap-PCR的方法將實驗室購買的!Iomega公司的 pGL3-Basic Vector質(zhì)粒上的野生型firefly Iuciferase (源于北美螢火蟲)基因1060位由G突變?yōu)锳，1267位由A突變?yōu)門，1307位由A突變?yōu)镚，1589位由T突變?yōu)镚 ；其中第一次用一組誘變引物引入1267位，1307位及1589位的突變；(2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，通過購買的Promega公司的pGEMT-vector試劑盒連接載體，將連接產(chǎn)物pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α 感受態(tài)細胞，獲得 DH5 α -pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G, L530R ；2.鑒定重組質(zhì)粒 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R 將上述轉(zhuǎn)化獲得的菌經(jīng)過培養(yǎng)后用OMEGA公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒 pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G，L530R，通過酶切進行鑒定，并測序檢驗，待測序驗證正確后再進行下一輪突變位點的引入；3.以測序正確的 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R 質(zhì)粒為模板， 再通過overlap-PCR的分子生物學方法(是一種技術方法)獲得帶有1060位突變位點的 PCR片段；4.將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶BioI及EcoRI進行酶切，經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pET28a(實驗室保存，最早購自^witrogen公司)片段連接后，轉(zhuǎn)化實驗室自己制備的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，獲得大腸桿菌菌株DH5 α -pET28a-firefIy luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R ；5.鑒定重組質(zhì)粒 pEI^8a-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R 將上述轉(zhuǎn)化獲得的菌經(jīng)過培養(yǎng)后用OMEGA公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒pET28a-firefly luciferase-E354K, I423L，D436G，L530R用酶切的方法進行鑒定，并測序驗證，由此得到一種改造的高熱穩(wěn)定性及高酶活性突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明所述的編碼高熱穩(wěn)定性及高酶活螢火蟲熒光素酶突變株蛋白的基因 firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R，具有 SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列， 有以下特征1.本發(fā)明所用的firefly Iuciferase基因來自北美螢火蟲，長度為1650bp。2.具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結(jié)構(gòu)基因上具有4處點突變，即1060位由G突變?yōu)锳，1267位由A突變?yōu)門，1307位由A突變?yōu)镚，1589位由T
4突變?yōu)镚。本發(fā)明要求保護的高熱穩(wěn)定性及高酶活螢火蟲熒光素酶突變株蛋白可用如下方法生產(chǎn)。該方法包括以下具體的操作按照常規(guī)實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版社中所述的條件進行。1.突變酶 FIREFLYLUCIFERASE-E3MK，I423L, D436g, L530R 突變位點的引入(1)設計兩組誘變引物，采用overlap-PCR的方法將野生型firefly Iuciferase 基因上1060位由G突變?yōu)锳，1267位由A突變?yōu)門，1307位由A突變?yōu)镚，1589位由T突變?yōu)镚 ；其中第一次用一組誘變引物引入1267位，1307位及1589位的突變；(2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，通過購自Promega公司的pGEMT-vector 試劑盒連接載體，轉(zhuǎn)化實驗室自己制備的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，獲得 DH5α -pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G, L530R ；2.鑒定重組質(zhì)粒 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G, L530R 將上述轉(zhuǎn)化獲得的菌經(jīng)過培養(yǎng)后用OMEGA公司的質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒 pGEMT-fireflyluciferase-I423L, D436G，L530R，通過酶切進行鑒定，并測序檢驗，待測序驗證正確后再進行下一輪突變位點的引入；3.以測序正確的 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R 質(zhì)粒為模板， 再通過overlap-PCR的方法(一種實驗方法)獲得帶有1060位突變位點的PCR片段；4.將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶BioI及EcoRI進行酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pET28a(實驗室保存，購自^witrogen公司)片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(實驗室自己制備)，獲得大腸桿菌菌株DH5 α -pET28a-firefIy luciferase-E354K, I423L, D436g, L530R ；5.鑒定重組質(zhì)粒 pEI^8a-f iref Iy luciferase_E354K，I423L, D436g, L530R 用酶切的方法進行鑒定，并測序驗證，由此得到一種改造的蛋白基因，一種分離的高熱穩(wěn)定性及高酶活性突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；6.培養(yǎng)大腸桿菌 DH5 α-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R，提取重組質(zhì)粒 pET28a-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R ；7.將重組質(zhì)粒 pET28a_firefly luciferase_E354K，I423L，D436G，L530R 轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)細胞，得到可以表達突變酶 FIREFLY LUCIFERASE-E354K, I423L, D436G, L530R的菌株；8.將上述獲得的BL21(DE3)表達菌株進行放大培養(yǎng)，按照1 100的轉(zhuǎn)接比例將其轉(zhuǎn)入到500ml的LB液體培養(yǎng)基中，同時按照1 1000的比例添加卡納抗生素(原液濃度為50mg/ml)，于37°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期后添加誘導物IPTG至終濃度為0. 5mM,于16°C 低溫搖床誘導過夜；9.將500ml表達蛋白的菌液4°C，8000rpm離心8min進行集菌，再通過超聲破碎，離心獲取上清，通過親和層析使用GE Healthcare的AKATApurifier蛋白純化儀及GE Healthcare公司的HisiTrap FF crude columns進行柱純化，由此得到一種改造的蛋白，一種分離的蛋白，其序列為SEQ ID N0. 2所示的氨基酸序列，即高熱穩(wěn)定性及高酶活的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白；10.用Pierce公司生產(chǎn)的BCA蛋白濃度測定試劑盒進行濃度的測定，以BSA作標準曲線。蛋白定量后配制0. lmg/ml的蛋白液，以!Iomega公司的E1500熒光素酶檢測試劑盒進行發(fā)光測定，測定體系為IOul 0. lmg/ml的蛋白液，30ul pH7. 4、50mMTris-Hcl、
IOmM MgCl2的緩沖液以及IOul的底物混合液，使用!Iomega測定發(fā)光的儀器GloMax'
20/20Luminometer進行發(fā)光測定。按照以上方法可以檢驗本發(fā)明要求保護的突變酶的活性。純度檢測可以用 SDS-PAGE方法檢測。注以上提到的LB培養(yǎng)基配方如下LB培養(yǎng)基(L—1):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g。本發(fā)明獲得的高熱穩(wěn)定性及高酶活性的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白在食品，醫(yī)藥及生物相關領域有著廣泛的應用。螢火蟲熒光素酶在環(huán)境微生物檢測中的作用主要可以用于食品中微生物的殘留，餐具潔凈度，消毒效果的檢測以及水中微生物含量等的測定。具體方法是，配置一系列的ATP標準品，利用底物反應液熒光素和螢火蟲熒光素酶測定以ATP為唯一變量的標準曲線，再將待測定的樣品經(jīng)過裂解液的裂解釋放待測樣本中菌體的ATP，使其與配制好的檢測工作液，即熒光素、螢火蟲熒光素酶和緩沖液進行反應，根據(jù)標準曲線可以測得樣本中ATP 的含量，而ATP存在于所有的生物體內(nèi)，可以作為生物體量的一個標準，從而獲知樣本中微生物的含量。螢火蟲熒光素酶有著較為廣泛的應用，在食品工業(yè)中可用于快速檢測菌體數(shù)是否達標；在醫(yī)藥行業(yè)中可以用于分子影像，醫(yī)學診斷；在生物領域中，可以用于細胞內(nèi)報告基因及其他方面的研究。所述表達載體pET_28a和感受態(tài)細胞DH5a及BL21 (DE3)(均為實驗室保存， PET28a 質(zhì)粒最早購自 hvitrogen)。所述的重組質(zhì)粒 pET28a_firefIy luciferase_E354K， I423L，D436G，L530R為本發(fā)明所構(gòu)建。所述的大腸桿菌菌株DH5 α -firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 是具有質(zhì)粒 pEI^8a_firefIy luciferase-E354K, I423L，D436G，L530R的大腸桿菌菌株，保藏編號CCTCC NO. M2011062，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2011. 3. 14，分類命名 Escherichia coli DH5 α -firefly luciferase_E354K，I423L，D436G，L530R。所述的編碼基因 firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 是具有 SEQUENCE NO. 1 的核苷酸序列的高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白編碼基因。所述的蛋白FIREFLY LUCIFERASE-E354K, I423L, D436G, L530R 是具有 SEQUENCE NO. 2 的氨基酸序列的高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的螢火蟲熒光素酶突變株蛋白。上面所述的菌株均為實驗室常用工程菌株，均為大腸桿菌，大小在 0. 4-0. 7*l-3um，沒有芽孢，有普通菌毛與性菌毛，為革蘭氏陰性桿菌。大腸桿菌的合成代謝能力很強，最適生長溫度為37°C，為兼性厭氧菌，在有氧條件下生長良好，最適生長pH為 6. 8-8.0，所用LB培養(yǎng)基pH為7. 0-7. 5。其中DH5a為克隆菌株，用于質(zhì)粒的有效擴增， BL2KDE3)為表達菌株，待其生長到對數(shù)期后添加誘導物IPTG后可進行目的蛋白的誘導表達。本發(fā)明的優(yōu)點和效果本發(fā)明提供的FIREFLYLUCIFERASE突變株的核苷酸序列和蛋白質(zhì)序列是一種FIREFLY LUCIFERASE高熱穩(wěn)定性及高酶活特性突變株的基因和蛋白質(zhì)序列，未見報道。本株FIREFLY LUCIFERASE突變株發(fā)光能力是野生型酶的20倍左右，并且具有很好的熱穩(wěn)定性，符合實際應用的要求。螢火蟲熒光素酶在食品、醫(yī)藥及生物等領域有著廣泛的應用，是一種重要的工具酶，在同等條件下，高酶活的螢火蟲熒光素酶可以有效減低同一反應所需要的酶量，節(jié)約成本；同時，高熱穩(wěn)定性的螢火蟲熒光素酶可以更好的滿足它的實際需要， 可以用于30°C以上的實際運用，比如用于生物傳感器需要很好的穩(wěn)定性，而野生型的螢火蟲熒光素酶不能很好的滿足這樣的應用。


圖1為一種重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖(1)用OMEGA公司的提質(zhì)粒試劑盒抽提實驗室保存有firefly Iuciferase基因的質(zhì)粒，用作后面overlap-PCR的模板；(2)設計兩組誘變引物，第一組誘變引物通過overlap-PCR用來引入1267位，1307 位及1589位的突變；(3)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，通過pGEMT-vector試劑盒連接T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a 感受態(tài)細胞，獲得 DH5 a-firefly luciferase_I423L，D436G，L530R ；(4)鑒定重組質(zhì)粒 pGEMT-firefIy luciferase_I423L，D436G，L53OR 通過酶切進行鑒定，并測序檢驗，待測序驗證正確后再進行下一輪突變位點的引入；(5)以測序正確的 pGEMT-f iref Iy luciferase_I423L，D436G，L530R 質(zhì)粒為模板， 再通過overlap-PCR的方法獲得帶有1060位突變位點的PCR片段；(6)將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶BioI及EcoRI進行酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pET_28a片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，獲得大腸桿菌菌株 DH5 α -firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R。圖2為一種重組質(zhì)粒的酶切鑒定，其中圖2(a)是重組質(zhì)粒 pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G, L530R 的酶切鑒定結(jié)果；圖 2 (b)是重組質(zhì)粒 pET28a-fireflyluciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 的酶切鑒定結(jié)果 (1 %瓊脂糖凝膠電泳)。如圖2(a)所示，使用酶切位點Ncol，NdeI進行重組質(zhì)粒 pGEMT-f iref lyluciferase-I423L, D436G, L530R，獲得兩條片段，其中一條是與 firefly Iuciferase基因大小1650bp相對應，另一條為pGEMT載體的線性大??；圖2(b)所示的為第二輪overlap-PCR構(gòu)建的重組質(zhì)粒的鑒定，使用的酶切位點為EcoRI和BioI，同樣鑒定出陽性克隆，獲得最終所要的 pEI^8a-fireflyluciferase-E354K，I423L, D436G, L530R 重組表達載體。鑒定所用的酶切位點均為基因firefly Iuciferase上所不存在的。圖3為一種純化后的BL21 (DE3)菌株誘導表達產(chǎn)生的高熱穩(wěn)定性及高酶活性的突變株蛋白(10% SDS-PAGE膠電泳檢測)示意圖螢火蟲熒光素酶分子量約為61KD，與電泳所示結(jié)果相符。圖4為一種與野生型的發(fā)光強度比較示意圖利用Promega公司的E1500Luciferase Assay System進行熒光測定，比較經(jīng)過改造的螢火蟲熒光素酶與野生型的螢火蟲熒光素酶的發(fā)光強度。測定體系為50ul，其中包括 0. lmg/ml 的蛋白酶 10ul、Luciferase Assay System 不同梯度的底物 10ul、30ul pH 7.4的Tris-Hcl緩沖液，測定儀器為GloMax 20/20Luminometer,根據(jù)測得結(jié)果可以判斷，改造的螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度提高了 20倍左右。圖5(a)為一種與野生型的不同水浴溫度下的熱穩(wěn)定性比較示意圖將野生型螢火蟲熒光素酶與改造的熒光素酶分別在25°C，30°C，350C，40°C水浴鍋中水浴20min后置于冰上，待冷卻后同等條件下測定水浴后的熒光素酶發(fā)光情況，與水浴前的發(fā)光強度進行比較。野生型的在40°C水浴后發(fā)光強度降至原來的10%不到，而改造型的還可以有50%左右的發(fā)光強度。圖5(b)為一種與野生型37°C水浴不同時間后的熱穩(wěn)定性比較示意圖將野生型螢火蟲熒光素酶與改造的熒光素酶分別在37°C水浴鍋中水浴5min， IOmin, 15min, 20min后置于冰上，待冷卻后同等條件下測定熒光素酶的發(fā)光情況，與水浴前的發(fā)光強度進行比較。野生型在5min后發(fā)光強度降至原來的20%左右，隨著水浴時間的加長，發(fā)光性能幾乎散失，而改造型的在水浴20min以后還可以保有超過50%的發(fā)光強度，這對熒光素酶可以用于固相免疫分析等有著重要意義。
具體實施例方式實施例1 一種高熱穩(wěn)定性及高酶活特性的熒光素酶突變株蛋白的編碼基因的制備方法，其步驟是1. PCR模板的制備將實驗室現(xiàn)有的保存購自Promega公司的帶有firefly Iuciferase基因的 pGL3-Basic Vector質(zhì)粒大腸桿菌菌株于固體LB活化，挑取單克隆于5mlLB液體培養(yǎng)基中 37°C搖床培養(yǎng)后，用OMEGA公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，用作PCR的模板。2. Overlap PCR擴增獲得含有4個點突變的firefly Iuciferase片段(1)設計兩組誘變引物(誘變引物見表1)，以第一組誘變引物Al，Bi, Cl，Dl按照如下條件進行擴增以野生型熒光素酶基因為模板，引物Al，Bl擴增片段A1B1，按照 940C IOmin ；94°C lmin，63°C lmin，72°C lmin25sec，30 個循環(huán)；72°C IOmin 的擴增條件。引物 Cl，Dl 擴增片段 C1D1，按照 94°C IOmin ；94°C Imin, 65°C lmin，72°C 30sec，30 個循環(huán)； 72°C IOmin的擴增條件，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)(質(zhì)量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。將回收的兩種PCR產(chǎn)物AlB 1和ClD 1等摩爾比混合，加入上、下游引物A1，D1進行第二次 PCR，PCR 反應條件為94°C IOmin ；94°C lmin, 56°C 45sec，72°C lmin25sec，5 個循環(huán)；94°C lmin, 65°C lmin, 72°C lmin35sec，30 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊 脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點I423L，D436G，L530R的螢火蟲熒光素酶基因片段；(2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，通過pGEMT-vector試劑盒與T載體于16 °C 連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，用氨芐青霉素(Amp)-LB平板篩選得到陽性菌落，經(jīng)過鑒定(見下一步驟)，命名為大腸桿菌DH5a-fireflyluciferase-I423L，D436G， L530R ；(3)鑒定重組質(zhì)粒 pGEMT-firefIy luciferase_I423L，D436G, L530R 用 OMEGA 公司的質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒pGEMT-E354K，I423L，D436G，L530R，用限制性內(nèi)切酶NcoI和NdeI進行雙酶切鑒定，1 %瓊脂糖膠電泳檢查，結(jié)果產(chǎn)生約1. 7Kb和3Kb大小的兩條帶，如圖 2(a)，與預期大小相符。質(zhì)粒上firefly luciferase_I423L，D436G, L530R基因的測序由華大基因生物技術有限公司進行。測序引物是利用購自Promega公司的質(zhì)粒pGEMT上的通用引物5’M13F/ T7 和 3，SP6/M13R，測序結(jié)果表明獲得的 fireflyluciferase-I423L，D436G, L530R 基因序列與預期設計完全一致；(4)以測序正確的 pGEMT-firefly luciferase_I423L，D436G, L530R 質(zhì)粒為模板，以第二組誘變引物A2，B2, C2，D2按照如下條件進行擴增以 pGEMT-fireflyluciferase-I423L, D436G, L530R 質(zhì)粒為模板，引物 A2，B2 擴增片段 A2B2， 按照 940C IOmin ；94°C Imin, 58. 5°C lmin，72°C 55sec，30 個循環(huán)；72°C IOmin 的擴增條件， 引物C2，D2擴增片段C2D2，擴增條件同片段A2B2。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。將回收的兩種PCR產(chǎn)物A2B2和C2D2混合，加入上、下游引物A2，D2進行第二次 PCR，PCR 反應條件為94°C IOmin ；94°C lmin，55°C 45sec，72°C 50sec，5 個循環(huán)；94°C lmin, 59°C lmin，72°C lmin35sec，30個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點E3MK，I423L，D436g，L530R的螢火蟲熒光素酶基因片段。(5)將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶BioI及EcoRI進行酶切，與經(jīng)過相同酶切的質(zhì)粒pET_28a片段16°C過夜連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞， 于帶有卡納抗性(Kan)的LB平板上篩選陽性克隆，經(jīng)過鑒定(見下一步驟)獲得大腸桿菌菌株 DH5 α-firefly luciferase_E354K，I423L, D436G, L530R ； (6)鑒定重組質(zhì)粒 pET28a-firefly luciferase-E354K, I423L, D436G, L530R 用 OMEGA 質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒pET28a-E;354K，I423L，D436G，L530R，用限制性內(nèi)切酶XhoI和EcoRI進行雙酶切鑒定， 1 %瓊脂糖膠電泳檢查，結(jié)果產(chǎn)生約1. 7Kb和5. 4Kb大小的兩條帶，如圖2 (b)，與預期大小相符。質(zhì)粒上firefly luciferase_E354K，I423L，D436g，L530R 基因的測序由北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司進行。測序引物是利用針對PETISa質(zhì)粒上的通用引物5，T7和3，T7ter (由測序公司提供)，測序結(jié)果表明獲得的fireflyluCiferase-E354K， I423L，D436G，L530R基因序列與預期設計完全一致，由此得到具有SEQ ID NO. 1所示序列的高熱穩(wěn)定性及高酶活性編碼基因fireflyluciferase-E;354K，I423L，D436G，L530R 基因全長1650(不包括終止密碼TAA)，編碼550個氨基酸的蛋白。將產(chǎn)生的質(zhì)粒命名為 pET28a-fireflyluciferase-E354K, I423L, D436G, L530R。表1 用于構(gòu)建帶有4個突變位點的firefly Iuciferase基因的引物序列
權利要求
1.一種大腸桿菌，其特征在于大腸桿菌DH5 α -firefly luciferase--E354K, I423L, D436G, L530R, CCTCC NO. M2011062。
2.一種分離的蛋白編碼基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
3.一種分離的蛋白，其序列為SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。
4.權利要求3所述的一種分離的蛋白在細菌檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明一種螢火蟲熒光素酶的編碼基因及制備方法和應用，包括步驟1.突變酶突變位點的引入2．鑒定重組質(zhì)粒；3．測序，獲得帶有1060位突變位點的PCR片段；4．經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶，獲得大腸桿菌；5．鑒定重組質(zhì)粒，得到一種分離的蛋白基因；6．培養(yǎng)大腸桿菌；7．將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞，得到表達突變酶的菌株；8．將上述獲得的BL21表達菌株培養(yǎng)；9．將5蛋白的菌液離心，再通過超聲破碎，離心獲取上清；10．測定，獲得有高熱穩(wěn)定性又有高酶活的螢火蟲熒光素酶。一種螢火蟲熒光素酶的基因在食品、醫(yī)藥、菌體檢測上的應用。該突變酶的發(fā)光強度是野生型的15-20倍左右，并且較野生型具有良好的熱穩(wěn)定性。
文檔編號C12N1/21GK102191213SQ20111009348
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權日2011年4月14日
發(fā)明者危宏平, 張先恩, 張治平, 王殿冰, 趙金鳳 申請人:中國科學院武漢病毒研究所