專利名稱：基于茜素的新型顯色底物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)利用有效顯色底物檢測(cè)水解酶的方法，尤其是檢測(cè)糖酶、酯酶和肽酶的方法。
本發(fā)明的技術(shù)背景許多年來(lái)，一直利用特定的底物來(lái)檢測(cè)是否存在典型微生物的酶活性。通過(guò)利用特定的底物，有可能以是否發(fā)生反應(yīng)為基礎(chǔ)來(lái)描述微生物菌屬的特征，或者區(qū)分屬于給定菌屬的不同菌株和/或菌種。
合成酶底物由兩部分組成第一部分是特異于被檢測(cè)的酶活性并且在下文中被定義為靶部分；第二部分起著標(biāo)識(shí)的作用并且在下文中被定義為標(biāo)記部分。
這種特定底物可以是熒光的或產(chǎn)色的。事實(shí)上，如果第二個(gè)標(biāo)記部分不再與第一個(gè)靶部分結(jié)合，那么第二個(gè)標(biāo)記部分或者其與一種或多種其它化合物發(fā)生反應(yīng)的產(chǎn)物變得具有熒光或顯色(在本文中，參考由申請(qǐng)人申請(qǐng)的專利申請(qǐng)PCT/FR99/00781)。
本發(fā)明涉及基于茜素或蒽三酚的顯色底物，所述茜素或蒽三酚被摻入到底物中時(shí)通常具有一些顏色。然而，由標(biāo)記部分產(chǎn)生的顏色隨著導(dǎo)致所述標(biāo)記部分與所述底物靶部分分離的水解過(guò)程而增強(qiáng)或發(fā)生改變。優(yōu)選地，由于顯色因子(例如金屬或高pH)的存在，生成產(chǎn)物的顏色特征被進(jìn)一步增強(qiáng)。
在19世紀(jì)，發(fā)現(xiàn)了茜素具有與金屬形成有色螯合絡(luò)合物的能力。始于1826年，當(dāng)茜素被首次從歐茜草植物中分離出來(lái)時(shí)，其作為染料的特性被開發(fā)應(yīng)用于織物的染色。
1869年，Graebe和Liebermann研究出茜素的完全合成途徑。同年，W.H.Perkin研究出更多的不同茜素，所述茜素通過(guò)取代蒽環(huán)的R3，R4，R5，R6，R7和R8位置上的不同基團(tuán)來(lái)進(jìn)行合成(如下所示) 所述茜素本身并不是染料，但是與金屬氧化物卻能形成不溶性色素。例如，當(dāng)R3位置被砜基團(tuán)所取代，與鋁鹽的螯合作用產(chǎn)生了鮮亮的猩紅色而與鉻鹽的螯合作用則產(chǎn)生了暗棗紅色。舉另外一個(gè)例子，3-硝基茜素和4-硝基茜素根據(jù)它們與之螯合的金屬鹽而產(chǎn)生不同顏色的絡(luò)合物。茜素在染料工業(yè)中的用途主要由于它們與金屬以皂、酸或堿金屬的氫氧化物形式形成穩(wěn)定的螯合絡(luò)合物。
在容易合成的茜素衍生物中，可以發(fā)現(xiàn)3-氨基茜素和4-氨基茜素可以由3-硝基茜素和4-硝基茜素產(chǎn)生。4-氨基茜素由下式表示 由于該化合物在有鋁存在的條件下能產(chǎn)生紫色，因而具有特別的意義。而且，它是利用本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的斯克洛浦(Skraup)反應(yīng)合成喹啉茜素的起點(diǎn)，其中一種茜素喹啉(綠色)由下式表示 取代和閉環(huán)反應(yīng)能夠產(chǎn)生完整系列的具有不同特性的改構(gòu)茜素。
現(xiàn)有技術(shù)還表明這些化合物已經(jīng)具有生物和生物化學(xué)方面的應(yīng)用。鑒于在有螯合絡(luò)合物存在條件下羥基蒽醌與其發(fā)生反應(yīng)的速率，他們發(fā)現(xiàn)優(yōu)選應(yīng)用于檢測(cè)生物樣品中是否存在金屬的試驗(yàn)中。
由茜素還原反應(yīng)產(chǎn)生的所述蒽三酚(也被定義為脫氧茜素或蒽-1，2，10-三醇)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已經(jīng)很熟悉了。還原反應(yīng)由氫氧化鋅、氨、酸性氯化錫等介導(dǎo)。該化合物的通式如下所示 然而，至今，還沒(méi)有關(guān)于應(yīng)用茜素、蒽醌型衍生物和蒽三酚的特定領(lǐng)域的參考文獻(xiàn)，所述特定領(lǐng)域是指酶活性的檢測(cè)。該領(lǐng)域必然包括合成其中至少有一個(gè)靶部分與茜素分子結(jié)合的底物。只要沒(méi)有發(fā)生裂解所述兩個(gè)不同部分的水解反應(yīng)，這些底物就具有在金屬離子存在的條件下不發(fā)生反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。所形成的螯合絡(luò)合物不可溶的事實(shí)帶來(lái)了許多顯著的優(yōu)點(diǎn)·即使低濃度下，也具有較高的靈敏度，就是說(shuō)只需要使用少量的底物，·通過(guò)改變反應(yīng)介質(zhì)的組成，尤其是其含有的多價(jià)陽(yáng)離子(其定義將在說(shuō)明書結(jié)尾處的特定地方給出)的濃度和/或pH可以方便地調(diào)節(jié)水解產(chǎn)物的顏色以便適合特定應(yīng)用的要求，·他們可以容易地進(jìn)行合成并且只需要少量底物(由于上述的高靈敏度)，兩種因素都能降低生產(chǎn)成本，·由于所述有色產(chǎn)物擴(kuò)散效率低因此菌落容易進(jìn)行分解和鑒別，和·由于只需要痕量水平的這種底物(由于上述的高靈敏度)，生長(zhǎng)基本上不受抑制。
通過(guò)相當(dāng)經(jīng)典的被稱作Koenigs-Knorr方法的途徑-(Koenigs，W.和Knorr，E.，Ber.，34，957，1901)已經(jīng)合成出主要與糖苷結(jié)合的茜素的衍生物。利用改版的Helferich方法(Helferich B.等，Ber.，66，378(1933)和Ber.，77，194(1944)合成α-糖苷。其它衍生物與短鏈脂肪酸和磷酸酯或硫酸酯結(jié)合。
迄今為止，所使用的底物是例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷，該底物將在隨后的比較分析中與本發(fā)明的一種稱作茜素β-D-半乳糖苷的底物一起進(jìn)行處理。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的所述底物比現(xiàn)有技術(shù)中的那些底物更有效。因此，它們檢測(cè)多種用于微生物菌種和/或菌株的酶比活性測(cè)定。
本發(fā)明的底物在其它文獻(xiàn)中也都有不同程度的提及。
因此，由Masawaki，Teruyuki等撰寫的文章″從茜草根中選擇性溶劑提取茜根酸并且隨后采用β-糖苷酶進(jìn)行水解(Selective solventextraction of ruberythric acid from madder roots and subsequenthydrolysis with β-glucosidase)″，發(fā)酵生物工程雜志(J.Ferment.Bioeng).(1996)，81(6)，567-569，涉及利用選擇性溶劑從茜草根中提取蒽醌-被作為染料-的方法。一種目的是從與糖結(jié)合的蒽醌中提取茜素；其中一種是茜素-2-o-櫻草苷。為了達(dá)到此目的，他們利用β-糖苷酶水解茜素-2-o-櫻草苷。
由Van der Plas，Linus H.W.等發(fā)表在植物生理雜志(J.Plant.Physiol.)，(1998)，152(2/3)，235-241中的另一篇題目為″蒽醌糖基化和在Morinda citrifolia細(xì)胞懸浮液中的水解(Anthraquinoneglycosylation and hydrolysis in Morinda citrifolia cellsuspensions.Regulation and function)″的文章給出了一種糖-糖基化櫻草苷存在于植物細(xì)胞中的生物學(xué)解釋(參見第240頁(yè)第1欄，第3段)。根據(jù)這一點(diǎn)，其通過(guò)某種蒽醌的水解而產(chǎn)生。
由Mateju，J.等發(fā)表在Folia Microbiol.(布拉格)(1974)，19(4)，307-316中的最后一篇題目為″二羥蒽醌的微生物葡糖苷化.葡糖苷化系統(tǒng)的一般特性(Microbial glucosidation of dihydroxyanthraquinones.General properties of the glucosidation system)″的文章涉及金霉素鏈霉菌的B96突變株的“葡糖苷化”活性。
然而，這些與本申請(qǐng)人的發(fā)明相差甚遠(yuǎn)。盡管事實(shí)上所述三篇文章都提及到基于茜素(或其它蒽醌)的底物，但是他們的多樣性受到限制(只提及到少數(shù)幾種化合物)，并且全部通過(guò)生物學(xué)途徑來(lái)產(chǎn)生(底物與一種櫻草苷結(jié)合并且由頭兩篇文章中的植物產(chǎn)生；底物與各種葡糖苷結(jié)合并且由第三篇文章中的灰色鏈霉菌產(chǎn)生)。而且，這些底物不被用來(lái)進(jìn)行基于酶檢測(cè)的診斷試驗(yàn)。
針對(duì)這一結(jié)果，本發(fā)明涉及一種用來(lái)檢測(cè)酶活性的顯色底物，該底物具有下列通式 其中-R1是一個(gè)靶部分或H，而R2是一個(gè)靶部分H，R1和R2中的至少一個(gè)是靶部分，-R3是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，或一個(gè)酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一個(gè)烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或一種α-氨基酸殘基如丙氨酸，-R4是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，OH或一個(gè)酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一個(gè)烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或一個(gè)α-氨基酸殘基如丙氨酸，-按照一種修飾的方式，R3和R4互相形成鍵從而創(chuàng)建一個(gè)具有至少五條邊，優(yōu)選地六條邊的環(huán)，-R5，R6，R7和R8各自由下列一種原子或原子基團(tuán)組成H，一種鹵素(特別是Cl或Br)，OH，SO3H，或一個(gè)烷基或烷氧基團(tuán)，而-R9，R10各自獨(dú)立地是一個(gè)甲基，烷基，芳基，芳烷基團(tuán)，或一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(哌啶，吡咯烷，嗎啉等)而另一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)氫原子。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，中心環(huán)的酮基被還原從而形成其中至少一個(gè)氫原子被甲基，烷基，芳基或芳烷基團(tuán)取代的羥基。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)酶活性的存在的顯色底物，該底物具有以下通式 其中-R1是一個(gè)靶部分或H，而R2是一個(gè)靶部分H，并且R1和R2中的至少一個(gè)是靶部分，-R3是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，或一個(gè)酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一個(gè)烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或一個(gè)α一氨基酸殘基如丙氨酸，-R4是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH22，NR9R10，OH或一個(gè)酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一個(gè)烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或一個(gè)α-氨基酸殘基如丙氨酸，-按照一種修飾的方式，R3和R4互相形成鍵從而創(chuàng)建一個(gè)具有至少五條邊，優(yōu)選地六條邊的環(huán)，-R5，R6，R7和R8各自由下列一種原子或原子基團(tuán)組成H，一種鹵素(特別是Cl或Br)，OH，SO3H，或一個(gè)烷基或烷氧基團(tuán)，和-R9，R10各自是一個(gè)甲基，烷基，芳基，芳烷基團(tuán)，或一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(哌啶，吡咯烷，嗎啉等)而另一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)氫原子，-R11由下列原子或原子基團(tuán)組成H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，或一個(gè)烷基，芳基，芳烷基，酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一個(gè)烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或一個(gè)α-氨基酸殘基，而-R12由H，或甲基，烷基，芳基或芳烷基團(tuán)組成。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，上述一種底物被水解，所述標(biāo)記部分由在位置1和2具有兩個(gè)羥基的茜素組成。該化合物的名稱為1，2-二羥基蒽醌-β-D-半乳糖苷并且當(dāng)它與由半乳糖組成的靶部分結(jié)合時(shí)，其通式為 該化合物被β-半乳糖苷酶水解所生成的產(chǎn)物在有一種鐵鹽存在的條件下形成下列螯合絡(luò)合物 在上述所有實(shí)例中，R1優(yōu)選地是H而R2優(yōu)選地是靶部分。
更準(zhǔn)確地說(shuō)，所述靶部分由下列種類中的一種組成-一種糖苷，由單-、雙-或多糖亞單位組成，通過(guò)α或β鍵與所述羥基連接，-一種α-氨基酸或肽，-一種有機(jī)酸，如-O-CO-(CH2)n-CH3，其中n的值在0至20之間，或，-硫酸鹽，磷酸鹽，焦硫酸鹽，焦磷酸鹽或磷酸二酯。
在一個(gè)特定的實(shí)例中，R3和R4是這樣的，當(dāng)R3或R4通過(guò)C3N鏈(可以取代或不取代)互相連接時(shí)N優(yōu)選鄰接R3或R4，則形成了一個(gè)六邊環(huán)。
按照上述至少一種底物用于酶活性檢測(cè)的第一個(gè)技術(shù)方案，該用途在于-將至少一種底物與懷疑含有至少一種微生物的樣品以及至少一種陽(yáng)離子接觸，所述底物的靶部分與需要進(jìn)行分析的酶活性相匹配，所述微生物表達(dá)需要測(cè)定的酶活性，和-監(jiān)控不溶性、有色螯合絡(luò)合物的形成。
優(yōu)選地，所述底物被引進(jìn)至少一種陽(yáng)離子，所述陽(yáng)離子適合于由所述酶活性釋放的標(biāo)記部分。
更優(yōu)選地，能夠用來(lái)形成不溶性螯合絡(luò)合物的陽(yáng)離子包括Fe2+，Al3+，Mn2+，Sn2+或Cu2+。
為了能夠檢測(cè)至少兩種不同的酶活性，如果使用了至少上述兩種底物，所述用途在于-將至少兩種底物與懷疑含有至少一種微生物的樣品接觸，加入至少一種陽(yáng)離子，所述底物的靶部分與需要進(jìn)行分析的兩種(至少)酶活性相匹配，所述微生物表達(dá)需要測(cè)定的酶活性，和-監(jiān)測(cè)至少兩種不同顏色或第三種顏色的形成。
根據(jù)最后的實(shí)例，所述底物被引進(jìn)至少一種陽(yáng)離子，優(yōu)選地一種單一類型的陽(yáng)離子，所述陽(yáng)離子適于由酶活性釋放的標(biāo)記部分。
在所有的實(shí)施例中，上述至少一種底物檢測(cè)酶活性的用途，或者與一種前面已經(jīng)描述的用途平行進(jìn)行的該用途在于-將至少一種底物與懷疑含有至少一種微生物的樣品在具有合適pH的反應(yīng)介質(zhì)中接觸，所述底物的靶部分與需要進(jìn)行分析的酶活性相匹配，所述微生物表達(dá)需要測(cè)定的酶活性，和-監(jiān)測(cè)至少一種顏色的形成。
優(yōu)選地，當(dāng)使用了至少兩種底物時(shí)，只能使用一種單一類型的的陽(yáng)離子，該陽(yáng)離子適合于由酶活性釋放的所有標(biāo)記部分。
按照優(yōu)選的技術(shù)方案，上述用途包括一種中間步驟，該中間步驟在于使得所述微生物能夠在一種添加了所述底物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
如果需要檢測(cè)的是糖苷酶，所使用的靶部分可以是(在其它的可能性之中)·葡萄糖，·半乳糖，·甘露糖，
·木糖，·葡糖醛酸，或·N-乙酰氨基葡萄糖。
如果需要檢測(cè)的是磷酸酯酶活性，所用靶部分可以是(在其它的可能性之中)磷酸或其一種取代的衍生物。
如果需要檢測(cè)的是硫酸酯酶活性，所用靶部分可以是(在其它的可能性之中)硫酸或其一種取代的衍生物。
如果需要檢測(cè)的是脂酶、磷脂酶或酯酶活性，所用靶部分可以是(在其它的可能性之中)·一種脂肪酸(飽和的或不飽和的)，或其一種取代的衍生物，·醋酸，或其一種取代的衍生物，·丁酸，或其一種取代的衍生物，·辛酸或其一種取代的衍生物，或·一種酯化的磷酸基團(tuán)如肌醇-1-磷酸。
本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)至少一種微生物菌株和/或微生物菌種的制劑，該制劑包括至少一種上述底物和一種培養(yǎng)基。
如果所述制劑含有至少兩種底物，所形成的反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)具有不同的顏色以便區(qū)分不同酶活性，所述酶活性是由至少一種微生物菌株和/或微生物菌種表達(dá)的。
優(yōu)選地，所述制劑的表現(xiàn)形式是液體、半固體或固體(例如，一種適合于再懸浮在一種適當(dāng)溶液中的干燥物形式)。
更優(yōu)選地是，所述底物的濃度在10至500mg/l之間，優(yōu)選地在30至150mg/l之間，以及更優(yōu)選地是50mg/l。
因此，該發(fā)明涉及一種新型底物，該底物起初顏色不明顯，一方面在一種需要進(jìn)行檢測(cè)的微生物或一種酶存在的條件下，另一方面(在某些實(shí)例中)在一種陽(yáng)離子存在的條件下，所述底物呈現(xiàn)出明顯的顏色。本發(fā)明還涉及這種底物的用途以及含有這種底物的制劑。
盡管不是絕對(duì)必需，但是陽(yáng)離子的存在特別有利；在后面的實(shí)例中，所用制劑優(yōu)選地具有堿性pH。還有可能將該兩種條件結(jié)合起來(lái)，即陽(yáng)離子的存在和堿性pH。
如果使用不同的陽(yáng)離子，檢測(cè)的微生物菌落呈不同顏色。為了防止或降低檢測(cè)樣品中的游離離子對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用，以非常低的濃度使用陽(yáng)離子如鐵、錳、錫和鋁。
然而，高濃度的某些金屬離子誘導(dǎo)選擇性抑制，該抑制可以被用來(lái)選擇微生物菌種，因而具有附加的優(yōu)點(diǎn)。底物合成1°)茜素-2-β-D-葡糖苷的合成按照Robertson等的方法(學(xué)協(xié)會(huì)雜志(J.Chem.Soc.)(1930)，1136et(1933)，1167)，茜素在位置2上的羥基被特異性糖基化，盡管這種添加也可以在位置1上進(jìn)行。然而位置2上的結(jié)合更容易些。
利用Robertson(1933)所述方法的改進(jìn)方法制備所述底物。將質(zhì)量為6g的茜素再懸浮在70ml的丙酮中并且與70ml的氫氧化鉀(0.28mol/l)溶液混合以便形成一種鹽。向該溶液中加入一種40ml的含有6.6g乙酰-溴-葡萄糖的混合物，該混合物是含有1∶1醚和丙酮的混合物。將所述混合物攪拌大約14小時(shí)。然后，加入7ml的氫氧化鉀溶液(1.25mol/l)，隨后加入15ml的乙酰-溴-葡萄糖(0.6mol/l)的丙酮溶液。將該預(yù)混合物繼續(xù)攪拌10小時(shí)。在低壓下蒸發(fā)掉所述的醚和丙酮并且采用冰醋酸將pH調(diào)到約5.5。將含有某些未反應(yīng)的茜素的混合物過(guò)濾后用水沖洗，然后在50℃下過(guò)夜干燥。
得到的黃色固體被重新懸浮在70ml的丙醋酸中和///在其中震蕩5分鐘。過(guò)濾前將其冷卻下來(lái)然后用醋酸沖洗。將所述濾出物擱置1小時(shí)，使得與殘余茜素分離開來(lái)。然后在10℃下重復(fù)該過(guò)程以便產(chǎn)生一種暗綠色的濾出物。
將所述產(chǎn)品進(jìn)行干燥并溶解在200ml的二氯甲烷中，然后加入2ml的三乙胺。將氧化鋁預(yù)混合到所述的溶液中直到測(cè)試樣品的薄層色譜(TLC)結(jié)果表明沒(méi)有殘留的茜素存在。除去所述的氧化鋁并且采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)掉殘留溶液，從而產(chǎn)生一種黃色固體。該固體從含有幾滴醋酸的熱乙醇中再結(jié)晶出來(lái)。由此產(chǎn)生2.02g的茜素四-乙酰-葡糖苷。
將質(zhì)量為1.1g的茜素四-乙酰-葡糖苷重新懸浮在60ml的乙醇中，然后加入30ml的含水氫氧化鈉(0.125mol/l)從而得到一種紅色溶液。該混合物在65℃下保持10分鐘后被冷卻到0℃。然后通過(guò)真空過(guò)濾除去所述的紅色糖基化茜素鈉鹽，采用醚沖洗并且最終進(jìn)行干燥。所述過(guò)程產(chǎn)生了0.9g的茜素-2-β-D-葡糖苷的鈉鹽。利用本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)進(jìn)一步純化該產(chǎn)物以便得到茜素-2-β-D-葡糖苷。2°)茜素-2-β-D-半乳糖苷的合成還是利用Robertson(1933)所述方法的改進(jìn)方法制備該底物。將質(zhì)量為6g的茜素重新懸浮在70ml的丙酮中并且與70ml的氫氧化鉀(0.28mol/l)溶液混合以便形成一種鹽。向該溶液中加入一種40ml的含有6.6g乙酰-溴-半乳糖的混合物，該混合物是含有1∶1醚和丙酮的混合物。將所述混合物攪拌大約14小時(shí)。然后，加入7ml的氫氧化鉀溶液(1.25mol/l)，隨后加入15ml的乙酰-溴-半乳糖(0.6mol/l)的丙酮溶液。將該預(yù)混合物繼續(xù)攪拌10小時(shí)。在低壓下蒸發(fā)掉所述的醚和丙酮并且采用冰醋酸將pH調(diào)到約5.5。將含有某些未反應(yīng)的茜素的混合物過(guò)濾后用水沖洗，然后在50℃下過(guò)夜干燥。
將所述產(chǎn)品進(jìn)行干燥并溶解在200ml的二氯甲烷中，然后加入2ml的三乙胺。將氧化鋁預(yù)混合到所述的溶液中直到測(cè)試樣品的薄層色譜(TLC)結(jié)果表明沒(méi)有殘留的茜素存在。除去所述的氧化鋁并且采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)掉殘留溶液，從而產(chǎn)生一種黃色固體。該固體從含有幾滴醋酸的熱乙醇中再結(jié)晶出來(lái)。由此產(chǎn)生1.96g的茜素四-乙酰-半乳糖苷。
將質(zhì)量為1.1g的茜素四-乙酰-半乳糖苷重新懸浮在60ml的乙醇中，然后加入30ml的含水氫氧化鈉(0.125mol/l)從而得到一種紅色溶液。該混合物在65℃下保持10分鐘后被冷卻到0℃。然后通過(guò)真空過(guò)濾除去所述的紅色糖基化茜素鈉鹽，采用醚沖洗并且最終進(jìn)行干燥。所述過(guò)程產(chǎn)生了0.86g的紅色晶狀粉末形式的茜素-2-β-D-半乳糖苷的鈉鹽。3°)茜素-2-醋酸酯的合成利用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法制備所述底物。將2克的茜素溶解在5ml的吡啶中并用2.5ml的醋酸酐與5ml的吡啶的混合物進(jìn)行處理。室溫下16小時(shí)后，將所述黃色溶液倒入100ml的含冰鹽酸中。通過(guò)抽濾回收沉淀的醋酸酯，然后用水沖洗。從丙酮中再結(jié)晶后產(chǎn)生1.4g的茜素-2-醋酸酯的黃色晶體。4°)茜素-2-硫酸鹽的合成通過(guò)在10ml的含有4g吡啶-硫三氧化物復(fù)合物的吡啶中加熱2.4g的茜素(即10mmol)制備所述底物。60℃下2小時(shí)后，低壓除去吡啶。通過(guò)將氫氧化鉀仔細(xì)加入到甲醇中直到pH達(dá)到9，硫酸酯以與鉀鹽相同的方式再結(jié)晶。逐漸形成所述鉀鹽并且通過(guò)抽濾進(jìn)行回收，然后用醚沖洗以便產(chǎn)生1.2g的白色晶狀粉末，茜素-2-硫酸鹽。5°)茜素-1-半乳糖苷的合成由茜素-2-醋酸酯制備所述底物(其合成見本章3°)。將質(zhì)量為2,82g的酯(即10mmol)混合到75ml的二氯甲烷中并向該混合物添加2至3ml的2，4，6-三甲基吡啶或2，6-二甲基吡啶從而產(chǎn)生深紫色的溶液。1小時(shí)后，加入碳酸銀，然后加入5g(即12.5mmol)的乙酰-溴-半乳糖，所述碳酸銀是按照Wolfrom and Lineback的″碳水化合物化學(xué)2中的方法(Methods in Carbohydrate Chemistry 2)″(1963)，342-43制備的。所述反應(yīng)在一個(gè)恒定攪拌器中于室溫(即10至15℃)下進(jìn)行兩天。薄層層析表明發(fā)生了向四-乙酰半乳糖苷(在板上快速遷移)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。所述溶液通過(guò)二氧化硅或硅藻土床進(jìn)行過(guò)濾并且利用足量(即大約100ml)的二氯甲烷沖洗所述助濾劑。然后用0.2M的鹽酸(3×100ml)在水(x2)中的溶液沖洗所述化合物在二氯甲烷中的溶液。干燥后(MgSO4)，在低壓下蒸發(fā)淡褐色提取物，然后溶解在一種新等分甲醇中。薄層層析(醋酸乙酯/甲苯)的結(jié)果表明含有快速遷移樣品和硫酸，所述快速遷移樣品在紫外線輻射下產(chǎn)生陽(yáng)性信號(hào)。然后利用甲醇鈉的甲醇溶液按照已經(jīng)記載的方法將受保護(hù)的半乳糖苷去乙酰基化，結(jié)果產(chǎn)生1.32g的茜素-1-半乳糖苷。6°)茜素-1-磷酸-2-辛酸酯通過(guò)100ml二氯甲烷中的2.4g(即10mmol)與3ml的三乙胺發(fā)生反應(yīng)來(lái)制備該底物。室溫下將1.62g的辛酰氯(10mmol)緩慢添加到該溶液中，整個(gè)添加過(guò)程需要30分鐘并且需要攪拌。按照已有方法利用鋁進(jìn)行處理來(lái)純化所述辛酸酯，然后除去溶劑并將所述產(chǎn)物從甲醇中再結(jié)晶出來(lái)以便回收所述的辛酸酯。冷卻到-12℃后，30ml干乙腈中的質(zhì)量為1.84g的辛酸酯(5mmol)繼續(xù)采用下列物質(zhì)進(jìn)行處理·3.6g的四氯化碳，·1.6g的二異丙乙胺，和·80mg的4-二甲基氨基吡啶。
低溫下大約2分鐘后，將含有2.2g的二芐基亞磷酸鹽的溶液加到8ml的乙腈中以防止溫度升得過(guò)高。1小時(shí)后，按照SilverbergL.J.，DillonJ.L.et Vermeshetti P.在Tet.Lett.，37N°6(1996)中描述的方法處理所述混合物，并且以30ml的醋酸乙酯作溶劑，在有0.4g的鈀/碳催化劑(10％w/w)存在的條件下，利用氫裂解所述的二芐基磷酰酯。通過(guò)將所述溶液與甲醇混合來(lái)去除醋酸酯并小心加入pH為8的碳酸鉀含水甲醇溶液，然后，再以與鉀鹽相同的方式回收磷酸酯?；厥哲缢?1-磷酸-2-辛酯的沉淀鉀鹽，用甲醇沖洗，將2.05g的酯進(jìn)行真空干燥并且不需要進(jìn)一步純化就可以使用。7°)脫氧茜素的合成通過(guò)采用由Liebermann-Ber.，21 444(1888)給出的途徑制備這種底物。為了合成還原蒽醌的9-和10-O-甲基衍生物，首先利用甲基按照適當(dāng)?shù)姆椒?本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的)或者利用乙醛二甲基醋酸酯(通過(guò)亞乙基保護(hù))將所有的1，2-二醇基團(tuán)保護(hù)起來(lái)，其中所述方法包括按照Scheline-Acta.Chem.Scand.20 1182(1966)中的記載與硼酸形成復(fù)合物。應(yīng)用許多應(yīng)用是可能的1.在半固體培養(yǎng)基或在膜上檢測(cè)和鑒定特定的微生物菌種。
2.在含有來(lái)源于組織活細(xì)胞的提取物的溶液中或在真核或原核細(xì)胞的懸浮液中檢測(cè)酶活性。
3.基于它們表達(dá)的酶活性鑒定生物體。
4.如在ELISA方法中，目測(cè)和定位抗原與抗體之間的特異性反應(yīng)。例如，在分析標(biāo)記酶過(guò)程中進(jìn)行β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酯酶活性檢測(cè)的方法中可以使用茜素-β-半乳糖苷或茜素-磷酸酯。在這種情況下，所述酶底物首先被用于涉及一種酶活性(涉及那些堿性磷酸酯酶或β-半乳糖苷酶)的檢測(cè)反應(yīng)中，如在一種ELISA-型版本中的檢測(cè)抗體或抗原的反應(yīng)中，所述ELISA-型版本，例如由Y.Barbier編輯的并由ACOMEN，Lyon出版的″免疫分析(Immunoassays)(從理論到實(shí)踐from Theory toPractice)″109至133頁(yè)(1988)；或者，所述酶底物首先被用于核酸的檢測(cè)中，例如由Keller G.H.，Manak，M.M.撰寫的″DNA probes″，第二版，Stockton出版社，5至9節(jié)(1993)。
5.測(cè)定基因，例如編碼β-半乳糖苷酶的基因存在的分子生物學(xué)技術(shù)及其用途″分子克隆(Molecular cloning)實(shí)驗(yàn)室指南(alaboratorymanual)″第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社Cold Spring Harbor Laboratory Press)，16.56節(jié)和1.85節(jié)(1989)。
6.組織化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)和流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)的技術(shù)。這種在醫(yī)學(xué)診斷和其它領(lǐng)域，例如水質(zhì)檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、食品工業(yè)等中具有重要應(yīng)用價(jià)值的酶特異性底物的用途。
7.利用聚丙酰胺凝膠或其它用于電泳和其它分離方法中的物質(zhì)進(jìn)行酶檢測(cè)的方法。
從表1中可以看到濃度為0.03g/l的茜素-2-β-D-半乳糖苷產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度近似于采用大約7倍濃度的6-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷所產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度。產(chǎn)生有效顏色強(qiáng)度的茜素-2-β-D-半乳糖苷的濃度范圍為0.03g/l至0.08g/l，優(yōu)選地為0.05g/l.。因此茜素基的底物比吲哚酚基的底物的敏感度高。實(shí)施例2利用茜素2-β-D-半乳糖苷檢測(cè)半固體培養(yǎng)基上的微生物產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性按照以下方法制備添加了茜素-2-β-D-半乳糖苷的半固體培養(yǎng)基將46.37g的哥倫比亞瓊脂與誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶活性的50mg的茜素-2-β-D-半乳糖苷，500mg的含氨檸檬酸鐵和30mg的異丙基1-β-D-硫代半乳糖苷一起加到1升蒸餾水中。將所述培養(yǎng)基在116℃下高壓滅菌10分鐘。然后將其緩慢冷卻到55℃，在該溫度下將其倒入20ml的培養(yǎng)皿中。將該培養(yǎng)基與以同樣方式采用46.37g的哥倫比亞瓊脂與80mg的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷和30mg的異丙基1-β-D-硫代半乳糖苷制備的另一種半固體培養(yǎng)基進(jìn)行比較。
利用20E API(注冊(cè)商標(biāo))條(strips)(bioMérieux，法國(guó))按照參考方法鑒定從臨床和環(huán)境樣本中收集的三百六十七(367)株不同的菌株。利用哥倫比亞瓊脂將所有菌株在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，然后針對(duì)每一菌株制備大約108微生物/ml(相當(dāng)于0,5的McFarland示度)的接種液。利用一種Denley接種器，每種培養(yǎng)基的一個(gè)培養(yǎng)皿接種1毫升的每種懸浮液，即如上述制備的添加了茜素-2-β-D-半乳糖苷的培養(yǎng)基以及含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-如糖苷的培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)18小時(shí)。
培養(yǎng)后，目測(cè)長(zhǎng)出的菌落。在含有茜素-2-β-D-半乳糖苷的培養(yǎng)基上，表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的菌落是紫色而在含有5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷的培養(yǎng)基上，菌落是綠松石色。顯示這些顏色中的一種顏色的任何菌株被認(rèn)為對(duì)β-半乳糖苷酶和相應(yīng)底物是陽(yáng)性的。所述結(jié)果結(jié)果如下表2所示。
表2添加了茜素-2-β-D-半乳糖苷的半固體培養(yǎng)基上的微生物產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶活性的檢測(cè)茜素-2-β-D-半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷兩欄中給出的數(shù)字對(duì)應(yīng)于陽(yáng)性菌株的百分比。大多數(shù)的菌株(96.5％)以完全相同的方式—即陽(yáng)性地或陰性地—與兩種底物發(fā)生反應(yīng)。八個(gè)菌株選擇性地水解茜素-2-β-D-半乳糖苷。然而，所有這八個(gè)菌株具有β-半乳糖苷酶活性，該β-半乳糖苷酶活性通過(guò)在有底物4-甲基繖形基(umbelliferyl)-β-D-半乳糖苷存在的條件下產(chǎn)生熒光信號(hào)來(lái)進(jìn)行顯示。因此該表中的結(jié)果表明所述底物針對(duì)β-半乳糖苷酶活性是一種靈敏度高于參照底物5-溴-4-氯-3-吲哚基--β-D-半乳糖苷的有效標(biāo)記。因此，這些底物及其靈敏并且能以非常底的濃度進(jìn)行使用。
實(shí)施例3不同金屬鹽對(duì)標(biāo)記部分顏色的影響向添加了茜素-2-β-D-葡萄糖苷(50mg/l)的哥倫比亞基培養(yǎng)基(46.37g/l)中以50mg/l的濃度加入氯化錳、含氨檸檬酸鐵、氯化錫或硫酸鋁。并列檢測(cè)不含金屬鹽的對(duì)照培養(yǎng)基。高壓滅菌后，這些不同的培養(yǎng)基被用來(lái)制備培養(yǎng)皿(每塊板20ml)。將這些培養(yǎng)皿分成三個(gè)區(qū)域，然后每個(gè)區(qū)域接種上從申請(qǐng)人保藏中心取來(lái)的微生物懸浮液(密度＝0.5McFarland)。所述培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。接種24和48小時(shí)后通過(guò)目測(cè)檢測(cè)長(zhǎng)出的菌落。記錄顏色和顏色強(qiáng)度。結(jié)果如下表3所示。應(yīng)當(dāng)指出強(qiáng)度讀數(shù)是任意單位。給出這些數(shù)值的唯一目的使得一個(gè)菌株與另一菌株在這方面進(jìn)行比較成為可能。對(duì)于后面的實(shí)施例也是同樣的。類似地，檢測(cè)的菌株取自申請(qǐng)人保藏并且給出的編碼代表該保藏特有的內(nèi)部索引號(hào)。所述相同的內(nèi)部編碼系統(tǒng)也用于以后給出的一些表3不同金屬鹽對(duì)標(biāo)記部分顏色的影響所述底物水解產(chǎn)生的顏色隨著使用的金屬鹽發(fā)生變化。即使在沒(méi)有金屬鹽存在的條件下(即對(duì)照培養(yǎng)基)也能觀察到顏色。然而，所述顏色不如有金屬鹽如鐵鹽(其不影響真實(shí)顏色)存在的條件下觀察到的顏色強(qiáng)度強(qiáng)。
這意味著為了適應(yīng)特定的需要，可以改變顏色及其強(qiáng)度(例如，當(dāng)與其它酶底物或pH指示劑一起使用時(shí))。實(shí)施例4在有茜素-2-β-D-半乳糖苷存在的條件下pH對(duì)檢測(cè)β-D-半乳糖苷酶的影響向十八支含有5ml透析純凈水的試管中的每一支中加入茜素-2-β-D-半乳糖苷(0.05g/l)和5μl的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23Sigma)。向這些試管中的一半試管中加入含氨檸檬酸鐵(0.05g/l)。將所有18支試管在37℃下培養(yǎng)4小時(shí)，然后不含含氨檸檬酸鐵的試管呈淺粉紅色，而添加了含氨檸檬酸鐵的試管中的粉紅色看起來(lái)顏色更深一些。最后，在24℃下將這些試管的pH調(diào)到不同值(2-3-4-5-6-7-8-9-10)。在不同值pH下所觀察到的顏色見下表4。
表4在有2-茜素-β-D-半乳糖苷存在的條件下pH對(duì)β-D-半乳糖苷酶檢測(cè)的影響顏色隨著pH而變化。作為一般的規(guī)律，低pH時(shí)呈黃色，而較高pH時(shí)呈粉紅色或紫色。這意味著顏色可以進(jìn)行變化以便滿足需要或檢測(cè)不同的代謝參數(shù)(例如，酶水解和pH變化)。該實(shí)驗(yàn)還表明可以利用一個(gè)寬范圍變化的pH值。實(shí)施例5在一種半固體培養(yǎng)基中將基于茜素的底物與另外一種底物相結(jié)合-檢測(cè)至少兩種不同的酶活性下列培養(yǎng)基·哥倫比亞基(46.37g/l)，·茜素-2-β-D-葡糖苷(0.05g/l)，·含氨檸檬酸鐵(0.05g/l)，·5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(0.05g/l)，和·異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(30mg/l)誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶活性，被用來(lái)灌注培養(yǎng)皿(每塊板30ml)。將這些培養(yǎng)皿分成三個(gè)區(qū)域，然后將每個(gè)區(qū)域接種上取自申請(qǐng)人保藏的微生物懸浮液(密度＝0.5McFarland)。將這些培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。
培養(yǎng)24和48小時(shí)后通過(guò)目測(cè)觀察長(zhǎng)出的菌落。記錄顏色和顏色強(qiáng)度。結(jié)果見下表5
表5同步檢測(cè)兩種底物茜素-2-β-D-葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷在表5中，符號(hào)″-″表示無(wú)色。不產(chǎn)生任何顏色而只產(chǎn)生陰性結(jié)果的菌株被用作陰性對(duì)照。
通過(guò)利用兩種不同底物的混合物可以辨別四組不同的微生物·第一組，產(chǎn)生綠松石色的成員代表只表達(dá)β-半乳糖苷酶活性的菌種，·第二組，產(chǎn)生紫色的成員代表只表達(dá)β-葡糖苷酶活性的菌種，·第三組的成員表示一種上述兩種模式的組合，也就是說(shuō)一種藍(lán)色或淡紫色，代表表達(dá)兩種待分析酶活性的菌種，和·第四組，無(wú)色組代表沒(méi)有上述任何一種酶活性的菌種。
因此有可能通過(guò)茜素基底物與其它酶底物的結(jié)合，在微生物表達(dá)生化活性的基礎(chǔ)上來(lái)辨別一組或多組微生物。實(shí)施例6利用茜素-2-β-D-葡糖苷檢測(cè)半固體培養(yǎng)基上的微生物所產(chǎn)生的β-葡糖苷酶活性向一種API(注冊(cè)商標(biāo)，bioMérieux，法國(guó))帶(strip)的一個(gè)孔中加入3μl茜素-2-β-D-葡糖苷(0.12g/l)與含氨檸檬酸鐵(0.05g/l)的混合物，然后進(jìn)行干燥。同時(shí)建立一個(gè)含有終濃度為0.4g/l的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷的對(duì)照孔。然后將50μl的哥倫比亞基加到所述兩種孔中，隨后接種上100μl的細(xì)菌懸浮液(密度＝2McFarland)。在37℃下培養(yǎng)4和24小時(shí)后，記錄孔中產(chǎn)生的顏色。所述結(jié)果見下表6。
表6檢測(cè)添加了茜素-2-β-D-葡糖苷的半固體培養(yǎng)基上的微生物產(chǎn)生的β-葡糖苷酶活性在表6中，符號(hào)″-″表示無(wú)色。這些不產(chǎn)生任何顏色而只產(chǎn)生陰性結(jié)果的菌株被用作陰性對(duì)照。
茜素基底物檢測(cè)8個(gè)測(cè)試菌種中的7個(gè)菌種有該活性，而6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷只檢測(cè)這些菌種中6個(gè)菌種有該種活性。而且，其中的兩種菌種(蘇云金芽孢桿菌和斯氏利斯特氏菌)，其活性在利用茜素基底物的較早時(shí)間點(diǎn)就顯示出來(lái)了。因此，這些底物不但可以用于肉湯培養(yǎng)基，而且還比吲哚酚基底物更靈敏。實(shí)施例7茜素-1-β-D-葡糖苷與茜素-2-β-D-葡糖苷在半固體培養(yǎng)基中的比較向哥倫比亞基質(zhì)中加入任一·0.05g/l的茜素-2-β-D-葡糖苷和0.05g/l的含氨檸檬酸鐵，·0.05g/l和0.1g/l的茜素-1-β-D-葡糖苷，對(duì)于該兩種濃度，加0.05g/l的含氨檸檬酸鐵，·0.15g/l的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷而不加入含氨檸檬酸鐵。
利用這四種培養(yǎng)基制備培養(yǎng)皿(每只皿20ml的培養(yǎng)基)。將這些培養(yǎng)皿分成三個(gè)區(qū)域并且將每個(gè)區(qū)域接種上細(xì)菌懸浮液(密度＝0.5McFarland)。將所述培養(yǎng)皿在37℃下培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)18，24和48小時(shí)后通過(guò)目測(cè)檢測(cè)長(zhǎng)出的菌落。記錄菌落的顏色和顏色強(qiáng)度。所述結(jié)果見下表7。
表7茜素-1-β-D-葡糖苷與茜素-2-β-D-葡萄苷在半固體培養(yǎng)基中的比較在表7中，符號(hào)″-″表示無(wú)色。沒(méi)有產(chǎn)生任何顏色而只產(chǎn)生陰性結(jié)果的菌株被用作陰性對(duì)照。
在相同的濃度0.05g/l下，所述兩種底物針對(duì)3個(gè)表達(dá)活性菌株中的兩個(gè)菌株產(chǎn)生的顏色不相同。茜素-2-β-D-葡糖苷比茜素-1-β-D-葡糖苷的靈敏度略高些。然而，在0.1g/l的濃度下，茜素-1-β-D-葡糖苷比茜素-2-β-D-葡糖苷產(chǎn)生的顏色深。
從該表可以看出，利用0.05g/l濃度的茜素-1-β-D-葡糖苷針對(duì)所有測(cè)試菌株觀察到的顏色強(qiáng)度比利用三倍濃度的6-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷產(chǎn)生的顏色深。
因此茜素基底物比吲哚酚基底物的靈敏度高。
對(duì)使用茜素-1-β-D-葡糖苷還是使用茜素-2-β-D-葡萄苷的選擇還受其它因素的影響，諸如生產(chǎn)成本、穩(wěn)定性，應(yīng)用領(lǐng)域的特殊性等。特點(diǎn)一種通過(guò)目測(cè)檢驗(yàn)來(lái)鑒別菌落的細(xì)菌種類的方法包括在添加了至少一種如上述合成的底物的半固體培養(yǎng)基上以及在有至少一種適當(dāng)?shù)暮哿筷?yáng)離子存在的條件下培養(yǎng)所述細(xì)菌。長(zhǎng)出的菌落呈現(xiàn)出一種取決于所用底物以及與其結(jié)合的陽(yáng)離子的強(qiáng)烈顏色(紅色，紫色，藍(lán)色等顏色)。底物與陽(yáng)離子之間存在的比值在1/100至100/1之間，優(yōu)選地在1/10至10/1之間，更優(yōu)選地在1/2至2/1之間。
在某些條件下，所述底物R3位置上的SO3H基團(tuán)有助于克服與底物類型有關(guān)的穩(wěn)定性和溶解性問(wèn)題。
術(shù)語(yǔ)“多價(jià)陽(yáng)離子”是指Xn+型的多價(jià)金屬陽(yáng)離子，其中n＝2，3或4。可以使用的金屬離子是Mg，Al，Ca，Ti，V，Cr，Mn，F(xiàn)e，Co，Ni，Cu，Zn，Sr，Zr，Sn，Sb，Ba，La和Hf，以及鑭系元素Ce，Sm，Eu，Gd和Tb。
由茜素產(chǎn)生的所述蒽三酚(也被稱作脫氧茜素或蒽-1，2，10-三醇)對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已經(jīng)非常熟悉。還原反應(yīng)通過(guò)氫氧化鋅，氨，酸性氯化錫等的作用來(lái)介導(dǎo)。該化合物的通式如下所示 由于不存在蒽醌的中心醌型環(huán)，1，2-二醇體系的金屬螯合絡(luò)合物的反應(yīng)性不同，例如亞鐵螯合絡(luò)合物是黑顏色。由于茜素鐵螯合絡(luò)合物是紅色，所以檢測(cè)兩種不同酶活性的兩種不同底物可以與相同的金屬離子一起使用。這對(duì)底物可以是，例如·檢測(cè)糖酶活性的茜素-2-β-D-葡糖苷，和·檢測(cè)磷酸酶的脫氧茜素-2-β-D-磷酸酶。
還有可能將蒽三酚位置10上羥基保護(hù)起來(lái)，其中例如，氫原子可以被甲基取代從而產(chǎn)生具有下列結(jié)構(gòu)的化合物 類似地，所述茜素還可以通過(guò)還原酮基從而生成一種9，10-二醇結(jié)構(gòu)而得到保護(hù)；然后所述醇基可以被烷基化，例如，生成如下所示的1，2-二羥基-9，10-二甲氧基蒽 這些烷基化蒽三酚和茜素不易自發(fā)氧化生成茜素因而成為底物糖苷化(優(yōu)選地在位置2上糖苷化)的出色候選物質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)酶活性存在的顯色底物，該底物具有以下通式 其中-R1是一個(gè)靶部分或H，而R2是一個(gè)靶部分H，并且R1和R2中的至少一個(gè)是靶部分，-R3是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或α-氨基酸殘基如丙氨酸，-R4是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，OH或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或α-氨基酸殘基如丙氨酸，-按照一種修飾的方式，R3和R4互相形成鍵從而創(chuàng)建一個(gè)具有至少五條邊，優(yōu)選地六條邊的環(huán)，-R5，R6，R7和R8各自由下列一種原子或原子基團(tuán)組成H，一種鹵素(特別是Cl或Br)，OH，SO3H，或一個(gè)烷基或烷氧基團(tuán)，而-R9，R10各自獨(dú)立地是一個(gè)甲基，烷基，芳基，芳烷基團(tuán)，或一個(gè)R9或R10)是一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(哌啶，吡咯烷，嗎啉等)而另一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)氫原子。
2.如權(quán)利要求1所述的底物，其特征在于所述中心環(huán)的酮基團(tuán)被還原成其中至少一個(gè)氫原子可以被甲基，烷基，芳香基或芳烷基取代的羥基。
3.一種檢測(cè)酶活性存在的產(chǎn)色底物，該底物具有以下通式 其中-R1是一個(gè)靶部分或H，而R2是一個(gè)靶部分或H，并且R1和R2中的至少一個(gè)是靶部分，-R3是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或α-氨基酸殘基如丙氨酸，-R4是H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，OH或酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一個(gè)烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或α-氨基酸殘基如丙氨酸，-按照一種修飾的方式，R3和R4互相形成鍵從而創(chuàng)建一個(gè)具有至少五條邊，優(yōu)選地六條邊的環(huán)，-R5，R6，R7和R8各自由下列一種原子或原子基團(tuán)組成H，一種鹵素(特別是Cl或Br)，OH，SO3H，或一個(gè)烷基或烷氧基團(tuán)，和-R9，R10各自是一個(gè)甲基，烷基，芳基，芳烷基團(tuán)，或一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)(哌啶，吡咯烷，嗎啉等)而另一個(gè)(R9或R10)是一個(gè)氫原子，-R11由下列一種原子或原子基團(tuán)組成H，SO3H，Cl，Br，F(xiàn)，I，NO2，NH2，NR9R10，或一個(gè)烷基，芳基，芳烷基，酰氨基氨基芳基或NHCOX型的氨基酰氨基基團(tuán)，其中X是一種烷基，芳基或芳烷基基團(tuán)或一種α-氨基酸殘基如丙氨酸，而-R12由H，或甲基，烷基，芳基或芳烷基團(tuán)組成。
4.如權(quán)利要求1至3中的任一權(quán)利要求所述的底物，其特征在于R1是H而R2是一個(gè)靶部分。
5.如權(quán)利要求1至4中的任一權(quán)利要求所述的底物，其特征在于所述靶部分由下列化合物中的一種化合物組成-一種糖苷，由單-、雙-或多糖亞單位組成，通過(guò)α或β鍵與所述羥基連接，-一種α-氨基酸或一種肽，-一種有機(jī)酸，如-O-CO-(CH2)n-CH3，其中n的值在0至20之間，或，-硫酸酯，磷酸酯，焦硫酸酯，焦磷酸酯或磷酸二酯。
6.如權(quán)利要求1至5中的任一權(quán)利要求所述的底物，其特征在于R3和R4是這樣的，當(dāng)通過(guò)其中N優(yōu)選地連接R3或R4的C3N鏈(可以取代或不取代)互相連接時(shí)，則形成了一個(gè)六邊環(huán)。
7.如權(quán)利要求1至6中的任一權(quán)利要求所述的至少一種底物用于檢測(cè)一種酶活性存在的用途，其特征在于其包括-將至少一種底物與懷疑含有至少一種微生物的樣品以及至少一種陽(yáng)離子接觸，所述底物的靶部分與需要進(jìn)行分析的酶活性相匹配，所述微生物表達(dá)需要測(cè)定的酶活性，和-監(jiān)測(cè)不溶性、有色螯合絡(luò)合物的形成。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述底物被引進(jìn)至少一種陽(yáng)離子，所述陽(yáng)離子適合于由所述酶活性釋放的標(biāo)記部分。
9.如權(quán)利要求7或8所述的用途，其特征在于能夠用來(lái)形成不溶性螯合絡(luò)合物的一種陽(yáng)離子包括Fe2+，Al3+，Mn2+，Sn2+或Cu2+。
10.如權(quán)利要求1至6中的任一權(quán)利要求所述的至少兩種底物用于檢測(cè)至少兩種不同酶活性存在的用途，其特征在于其包括-將至少兩種底物與懷疑含有至少一種微生物的樣品接觸，加入至少一種陽(yáng)離子，所述底物的靶部分與需要進(jìn)行分析的兩種(至少)酶活性相匹配，所述微生物表達(dá)需要測(cè)定的酶活性，和-監(jiān)測(cè)至少兩種不同顏色或第三種顏色的形成。
11.如權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于所述底物被引進(jìn)至少一種陽(yáng)離子，優(yōu)選地一種單一類型的陽(yáng)離子，所述陽(yáng)離子適于由酶活性釋放的所有標(biāo)記部分。
12.如權(quán)利要求1至6中的任一權(quán)利要求所述的至少一種底物用于檢測(cè)一種酶活性的存在的用途，或與權(quán)利要求7至11中的任一權(quán)利要求所述用途結(jié)合，其特征在于其包括-將至少一種底物與懷疑含有至少一種微生物的樣品在具有合適pH的反應(yīng)介質(zhì)中接觸，所述底物的靶部分與需要進(jìn)行分析的酶活性相匹配，所述微生物表達(dá)需要測(cè)定的酶活性，和-監(jiān)測(cè)至少一種顏色的形成。
13.如權(quán)利要求7至12中的任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于至少兩種底物的使用包括只使用一種類型的陽(yáng)離子，該陽(yáng)離子適合于由酶活性釋放的所有標(biāo)記部分。
14.如權(quán)利要求7至10中的任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于它包括進(jìn)行一種涉及所述微生物在添加了所述底物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的中間步驟。
15.如權(quán)利要求7至10中的任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于利用下列物質(zhì)中的一種(在其它可能性之中)作為靶部分來(lái)檢測(cè)糖苷酶活性·葡萄糖，·半乳糖，·甘露糖，·木糖，·葡糖醛酸，或·N-乙酰氨基葡萄糖。
16.如權(quán)利要求7至14中的任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于利用磷酸或其一種衍生物作為靶部分(在其它的可能性之中)來(lái)檢測(cè)磷酸酯酶活性。
17.如權(quán)利要求7至14中的任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于利用硫酸或其一種衍生物作為靶部分(在其它的可能性之中)檢測(cè)硫酸酯酶活性。
18.如權(quán)利要求7至14中的任一權(quán)利要求所述的用途，其特征在于利用下列物質(zhì)中的一種作為靶部分(在其它的可能性之中)檢測(cè)脂酶、磷脂酶或酯酶活性·一種脂肪酸(飽和的或不飽和的)，或其一種取代的衍生物，·醋酸，或其一種取代的衍生物，·丁酸，或其一種取代的衍生物，·辛酸，或其一種取代的衍生物，或·一種酯化的磷酸基團(tuán)如肌醇-1-磷酸。
19.一種檢測(cè)至少一種微生物菌株和/或微生物菌種的制劑，該制劑包括至少一種權(quán)利要求1至6中任一權(quán)利要求所述的底物和一種培養(yǎng)基。
20.如權(quán)利要求19所述的制劑，其特征在于其含有至少兩種底物，該底物產(chǎn)生具有不同的顏色的反應(yīng)產(chǎn)物以便鑒別由至少一種微生物菌株和/或微生物菌種表達(dá)的不同酶活性。
21.如權(quán)利要求19或20所述的制劑，其特征在于其由液體、半固體或固體培養(yǎng)基組成。
22.如權(quán)利要求19或20所述的制劑，其特征在于所述底物的濃度在10至500mg/l之間，優(yōu)選地在30至150mg/l之間，以及更優(yōu)選地是50mg/l。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于茜素的新型顯色底物。本發(fā)明還涉及這些底物的用途，以及含有這種底物的制劑。它由一種具有下列通式I的檢測(cè)酶活性存在的底物構(gòu)成其中中心環(huán)的兩個(gè)酮基可被一個(gè)R
文檔編號(hào)C12Q1/34GK1408027SQ0081685
公開日2003年4月2日 申請(qǐng)日期2000年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月9日
發(fā)明者L·阿穆斯特朗, A·詹姆斯 申請(qǐng)人:拜奧默里克斯股份有限公司