專利名稱：溶血磷脂酰乙醇胺的制備方法
背景技術(shù)：
溶血磷脂酰乙醇胺已知對(duì)于果實(shí)成熟和衰老具有重要的作用。已熟知，用溶血磷脂酰乙醇胺處理番茄植物將抑制其葉子和果實(shí)的衰老，用溶血磷脂酰乙醇胺處理收獲的番茄將延長(zhǎng)其保存期(美國(guó)專利5110341，美國(guó)專利5126155)。已知用溶血磷脂酰乙醇胺處理蘋果將促進(jìn)蘋果皮中花色素苷的形成，抑制保存期間堅(jiān)硬度的損失。此外，已知上述效果與溶血磷脂酰乙醇胺功能有關(guān)，例如其降低果實(shí)(例如，蘋果、越橘、番茄等)的呼吸率，以及促進(jìn)或抑制生成乙烯氣體(Farag，K.M.和J.P.Palta，″Stimulation of Ethylene Production by Erea，Thidiazoron，and Lysophosphatidylethanolamine and Possible sites of thisstimulation″，美國(guó)植物生理學(xué)家協(xié)會(huì)年會(huì)，1989年4月)。
采用被控具有適宜濃度的溶血磷脂酰乙醇胺溶液進(jìn)行處理的方法被用于延長(zhǎng)切花壽命(Hort Science 32(5)888-890，1997)。最近，通過用一般含糖的硫代硫酸銀溶液處理采獲的(切)花20小時(shí)或更長(zhǎng)，將所述溶液用于抑制花衰老。但是，上述溶液具有以下缺點(diǎn)，即其中所含銀離子造成環(huán)境污染。與硫代硫酸銀溶液類似，從自然界純化出的溶血磷脂酰乙醇胺能延長(zhǎng)瓶中切花的保存期，因此溶血磷脂酰乙醇胺成為該領(lǐng)域中廣泛研究的目標(biāo)。
迄今為止，還沒有開發(fā)出工業(yè)生產(chǎn)高純度溶血磷脂酰乙醇胺的方法。只在實(shí)驗(yàn)室中利用硅膠柱層析對(duì)溶血磷脂酰乙醇胺進(jìn)行了小規(guī)模的分離和純化。小量溶血磷脂酰乙醇胺象試劑那樣由Avanti PolarLipids，Inc.或Sigma Chemical Co.以高價(jià)售賣。此外，當(dāng)經(jīng)柱層析制備溶血磷脂酰乙醇胺時(shí)，由于溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺具有相似的遷移模式，因此很難從二者中分離出溶血磷脂酰乙醇胺。當(dāng)使用低毒性有機(jī)溶劑如己烷或乙醇作為單一溶劑進(jìn)行柱層析時(shí)，由于溶血磷脂酰乙醇胺在溶劑中溶解度極低，因此很難純化溶血磷脂酰乙醇胺。同時(shí)，當(dāng)使用已知具有高毒性溶劑(例如，氯仿、苯或甲醇)進(jìn)行柱層析時(shí)，純化結(jié)果良好，但產(chǎn)率低且純化費(fèi)用高。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種制備溶血磷脂酰乙醇胺的方法，包括以下步驟用磷脂酶處理含磷脂酰乙醇胺的磷脂混合物，以將所述磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰乙醇胺；用特定溶劑混合物處理上面獲得的含溶血磷脂酰乙醇胺的溶血磷脂混合物，以選擇性地提取出溶血磷脂酰乙醇胺并使之結(jié)晶；以及回收溶血磷脂酰乙醇胺。
本發(fā)明還提供了一種方法，其進(jìn)一步包括用一種磷脂水解酶——磷脂酶D處理磷脂中富含的磷脂酰膽堿的步驟，從而增大磷脂混合物中磷脂酰乙醇胺的含量。
基于下面的詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易理解本發(fā)明的這些特征和其他特征。發(fā)明詳述下面對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
本發(fā)明方法中使用的起始原料是磷脂混合物，其含10-99重量％的磷脂酰乙醇胺，優(yōu)選30-99重量％的磷脂酰乙醇胺。所述混合物的例子是大豆卵磷脂、粗制大豆卵磷脂、卵黃卵磷脂等。
但是，自然界中存在的磷脂混合物中磷脂酰乙醇胺含量低于磷脂酰膽堿的含量。為更有效地加工，必須增加磷脂中磷脂酰乙醇胺的含量。
例如，大豆油制備過程中的一種副產(chǎn)物——粗制大豆卵磷脂(“粗制卵磷脂”)由60-70％極性類脂(磷脂/糖脂)、27-39％大豆油、1-3％水、0.5-3％其他成分組成。極性類脂通過去除粗制卵磷脂中所含的大豆油(一種中性油)得以純化。純化狀態(tài)下極性類脂的組成如下22-30％磷脂酰膽堿(“PC”)；2-5％溶血磷脂酰膽堿(“LPC”)；16-22％磷脂酰乙醇胺(“PE”)；0.5-2％溶血磷脂酰乙醇胺(“LPE”)；0.5-8％磷脂酸(“PA”)；0.1-3％磷脂酰絲氨酸；6-15％磷脂酰肌醇等。蛋黃卵磷脂由73-83％PC、2-5％LPC、13-17％PE、0.1-3％LPE和其他其余物組成。由于磷脂含很小量的溶血磷脂酰乙醇胺，因此幾乎不可能通過由上述卵磷脂中直接純化出溶血磷脂酰乙醇胺而在商業(yè)上使用溶血磷脂酰乙醇胺。
因此，希望如下制備起始原料將磷脂混合物中富含的PC轉(zhuǎn)化成PE，然后由磷脂混合物中純化PE或在需要時(shí)通過濃縮之類的方法來(lái)增加PE含量。增加PE含量的方法包括利用磷脂在不同溶劑中的不同溶解度進(jìn)行溶劑分級(jí)分離，經(jīng)柱層析分級(jí)分離，利用磷脂轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行磷脂酰乙醇胺的濃集等。
作為經(jīng)柱層析濃集磷脂酰乙醇胺的方法，使用吸附劑如硅膠或Florisil或者離子交換樹脂如DEAE纖維素或TEAE纖維素進(jìn)行的分級(jí)分離和濃集方法是熟知的[G.Rouser，G.Krichevsky，A.Yamanoto，“脂質(zhì)色譜分析”(Lipid Chromatographic Analysis)，G.V.Marinetti編輯，Vol1，第99頁(yè)，Dekker，New York(1967)，D.J.Hanahan，J.C.Dittmer，E.Warashina，J.Biol.Chem.228.695(1957)]。作為利用溶解度進(jìn)行差異分級(jí)分離的方法，使用醇進(jìn)行的分級(jí)分離[V.H.Pardon，F(xiàn)ette SeifenAnstrichmittel 86，55(1984)，J.Holzl和H.Wangner，Z.Naturforsch.，26b，1151(1971)]和離心分配色譜[Bio Industry 2(8)40(1985)]是已知的。
作為增加磷脂中磷脂酰乙醇胺含量的另一方法，可使用酶(具體而言，磷脂酶D或磷脂酰膽堿磷脂?；饷?phosphatidohydrolase)E.C.3.1.1.4.)。磷脂由sn-甘油-3-磷酸骨架和碳1和2位羥基上的脂肪?；湗?gòu)成。磷脂酶A1和A2分別催化sn-1和sn-2?；乃狻Ａ字窩水解甘油骨架上的磷酸二酯鍵。根據(jù)磷酸酯基上的頭基取代基對(duì)磷脂分類，所述頭基如膽堿或乙醇胺可被磷脂酶D水解。因具有水解活性和磷酸根轉(zhuǎn)移活性，磷脂酶D可用于產(chǎn)生多種磷脂酸衍生物。當(dāng)磷脂轉(zhuǎn)化酶(即磷脂酶D)和適量乙醇胺加入大豆或蛋黃磷脂中時(shí)，經(jīng)磷酸根轉(zhuǎn)移反應(yīng)獲得了含大量磷脂酰乙醇胺的磷脂[S.F.Yang等，J.Biol.Chem.，242(3)，477-484(1967)，R.M.C.Dawson，Biochem.J.，102 205-210(1967)]。
因此，經(jīng)上述已知方法制備的含高濃度磷脂酰乙醇胺的這類磷脂混合物可用作本發(fā)明的起始原料。
在本發(fā)明的例子中，為了增加磷脂中磷脂酰乙醇胺的含量，使用磷脂酶D(一種磷脂轉(zhuǎn)化酶)，這種酶可由微生物或植物制備得到。由甘藍(lán)獲得磷脂酶D的通用方法已由Yang等公開[S.F.Yang等，J.Biol.Chem.，242(3)，477-484(1967)]。從花生籽、棉籽、大豆提取的磷脂酶D可以部分或完全純化的狀態(tài)用于本發(fā)明。作為由微生物產(chǎn)生的磷脂酶D，可使用例如經(jīng)發(fā)酵反應(yīng)生產(chǎn)的來(lái)自鏈霉菌屬的酶。通常，在轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，與植物中提取的磷脂酶D相比，由微生物產(chǎn)生的磷脂酶D更為優(yōu)選，因?yàn)樗鼈冊(cè)谵D(zhuǎn)化磷脂的反應(yīng)中更有效。
該酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)可在一般條件下進(jìn)行。由上述反應(yīng)獲得的混合物可用在下面的水解反應(yīng)中，或經(jīng)純化后用于進(jìn)一步的用途。
根據(jù)本發(fā)明，通過用磷脂酶A2等磷脂水解酶處理磷脂混合物，混合物中的磷脂酰乙醇胺被轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰乙醇胺，無(wú)論所述磷脂混合物是否曾用磷脂酶D初步處理過。結(jié)果有可能獲得大量的溶血磷脂酰乙醇胺。
可用于本發(fā)明的磷脂水解酶包括從?；蜇i胰腺中提取的磷脂酶A2，具有磷脂酶A2活性的脂酶，以及具有滅活蛋白酶和脂酶的?；蜇i胰腺的胰酶制劑。其還包括由微生物發(fā)酵生產(chǎn)的磷脂酶A2。磷脂酶A2是水解甘油與磷脂sn-2位脂肪酸之間酯鍵的酶，其在蛇毒液或動(dòng)物胰腺中普遍存在。對(duì)于工業(yè)目的，由豬胰腺中提取然后濃集的磷脂酶A2有出售。用于本發(fā)明的實(shí)施例中的磷脂酶A2提取并純化自豬胰腺，是Novo Nordisk A/S開發(fā)用于商業(yè)用途的產(chǎn)品。
通常，磷脂的酶促水解反應(yīng)包括如下步驟將磷脂或磷脂混合物溶于體積大5-100倍的水或有機(jī)溶劑中，向其中加入酶，在恒溫下劇烈攪拌。酶促反應(yīng)溫度被控制在適中的范圍內(nèi)，即，室溫至70℃，優(yōu)先25-50℃。
當(dāng)在酶促反應(yīng)中使用有機(jī)溶劑時(shí)，針對(duì)所述過程和操作的穩(wěn)定性，優(yōu)先考慮溶劑的沸點(diǎn)和閃點(diǎn)。根據(jù)材料種類、純度、狀態(tài)、價(jià)格以及底物中磷脂含量等來(lái)確定所加酶量。通常，對(duì)每1kg磷脂使用的酶量為10000-50000單位(Lecitase，Novo Nordisk A/S推薦量)。水解反應(yīng)時(shí)間取決于所加酶量、反應(yīng)溫度、磷脂含量和攪拌速率等。除了針對(duì)恒定水解反應(yīng)控制酶含量和反應(yīng)溫度和為溶解磷脂而加入有機(jī)溶劑外，本發(fā)明的酶促反應(yīng)按照提供該酶的公司推薦的反應(yīng)方法進(jìn)行。
用于酶促反應(yīng)的有機(jī)溶劑包括乙醚、異丙醚、丁醚、正己烷、環(huán)己烷、正庚烷、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯等。
需要時(shí)，酶促反應(yīng)后剩余的水和有機(jī)溶劑可用于后面的有機(jī)溶劑分級(jí)分離過程，而不用除去。特別是，在后面的有機(jī)溶劑分級(jí)分離過程中需要水。因此，在下述有機(jī)溶劑分級(jí)分離過程中，使用酶促水解反應(yīng)中剩余的水，或加入額外的水。
同時(shí)，盡管進(jìn)行酶促磷脂轉(zhuǎn)化反應(yīng)，但仍很難指望有100％的轉(zhuǎn)化率，不可能避免生成副產(chǎn)物如磷脂酸(PA)、溶血磷脂酸等。由酶促反應(yīng)制備的溶血磷脂在其界面上高度親水，因此難以完全回收溶血磷脂。當(dāng)經(jīng)溶劑提取回收溶血磷脂時(shí)，因存在高百分比的水，其在蒸發(fā)步驟中產(chǎn)生氣泡，因此難以進(jìn)行濃集過程。因此，在生成溶血磷脂后，不易從溶血磷脂中選擇性地分離出溶血磷脂酰乙醇胺。由于溶血磷脂酰乙醇胺與溶血磷脂中的主要成分——溶血磷脂酰膽堿在有機(jī)溶劑中的溶解度相似，因而難以進(jìn)行分離。
為解決這些問題和獲得高純度溶血磷脂酰乙醇胺，本發(fā)明提供了一種方法，包括用水和一種或多種有機(jī)溶劑的混合物處理上述含LPE的溶血磷脂混合物，所述一種或多種有機(jī)溶劑選自低級(jí)醇、烴和烷基酯等，然后使所得混合物結(jié)晶。結(jié)果，本發(fā)明提供了可去除除溶血磷脂酰乙醇胺以外的雜質(zhì)[即，磷脂(例如PC、LPC、PE、PA等)、中性脂質(zhì)、脂肪酸、膽固醇等，它們?nèi)坑煞磻?yīng)產(chǎn)生]的方法，由此可產(chǎn)生高純度的溶血磷脂酰乙醇胺。
為從反應(yīng)混合物中去除除溶血磷脂酰乙醇胺以外的雜質(zhì)，用于本發(fā)明分級(jí)分離過程中的溶劑是水和一種或多種有機(jī)溶劑的混合物，所述一種或多種有機(jī)溶劑選自具有1-4個(gè)碳的低級(jí)醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇等)；一種或多種烴(具有6-12個(gè)碳的脂族烴，例如，戊烷、己烷、環(huán)己烷、庚烷、辛烷、環(huán)辛烷、甲基環(huán)己烷等)和羧酸烷基酯(例如，乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、丁酸甲酯、己酸甲酯等，其具有2-6個(gè)碳)。
在溶劑分級(jí)分離步驟中，使用的溶劑總量為磷脂重量的0.5-20倍，優(yōu)選為磷脂重量的5-10倍。
本發(fā)明中優(yōu)選使用的有機(jī)溶劑是例如作為低級(jí)醇的甲醇或乙醇，作為烴的己烷、環(huán)己烷或庚烷，以及作為烷基酯的乙酸乙酯。
希望的水和有機(jī)溶劑混合物的體積比是0.5-80∶20-99.5。如上所述，當(dāng)保留水解反應(yīng)中使用的水和有機(jī)溶劑時(shí)，在溶劑分級(jí)分離步驟中，通過加入額外的適量水或有機(jī)溶劑，或者不加，可達(dá)到上述優(yōu)選范圍。當(dāng)使用兩種或更多種有機(jī)溶劑時(shí)，所述比例并沒有具體限制。當(dāng)使用含低級(jí)醇的有機(jī)溶劑混合物時(shí)，可含10-99體積％的低級(jí)醇。
用有機(jī)溶劑和水的混合物處理磷脂水解反應(yīng)所得混合物后，由如下步驟得到高純度的溶血磷脂酰乙醇胺在-10℃至50℃的低溫下使混合物結(jié)晶，經(jīng)離心去除雜質(zhì)，并過濾或傾析上清液。結(jié)晶步驟可如下進(jìn)行在溶劑分級(jí)分離步驟之后單獨(dú)地控制溫度，或者與溶劑分級(jí)分離步驟同時(shí)進(jìn)行。
在本發(fā)明中，磷脂的溶劑分級(jí)分離的反應(yīng)溫度是最重要的因素之一。溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰膽堿在有機(jī)溶劑中的溶解度都很依賴于溫度。較高選擇性溶血磷脂分級(jí)分離的溫度應(yīng)控制在-10℃至50℃的中等條件下，優(yōu)選-10℃至30℃，更優(yōu)選-5℃至6℃。
在本發(fā)明中，為了更有效地分級(jí)分離而控制反應(yīng)的pH值是非常重要的。在本發(fā)明中，優(yōu)選的反應(yīng)pH值是pH3-9，更優(yōu)選pH4-8。
由有機(jī)溶劑分級(jí)分離步驟和結(jié)晶步驟產(chǎn)生的LPE晶體可用常規(guī)方法回收，例如用過濾、離心、上清液傾析等。
包括有機(jī)溶劑分級(jí)分離、結(jié)晶和晶體回收步驟的程序可進(jìn)行一次。為提高LPE純度，所述程序可進(jìn)行兩次或更多次，其中每個(gè)程序中使用的有機(jī)溶劑的種類和混合比例可相同或不同。
根據(jù)本發(fā)明制備溶血磷脂酰乙醇胺的方法可用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蚬I(yè)規(guī)模，并可有效制備溶血磷脂酰乙醇胺而無(wú)任何其他困難。這樣的以低成本制備的高純度溶血磷脂酰乙醇胺可廣泛用于制藥和農(nóng)業(yè)上。
發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明將借助如下實(shí)施例來(lái)具體化。但是，提供這些實(shí)施例只是為了解釋，而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求來(lái)恰當(dāng)?shù)孛枋觥?br> 將15g上面得到的磷脂酰乙醇胺(含11％磷脂酰膽堿)溶于150ml乙醚中，然后向其中加入含100mM CaCl2的20ml乙酸鈉緩沖液(pH5.6，100mM)。向溶液中加入5ml的Lecitase(10000 IU/ml，由NovoNordisk A/S制造)，然后溶液在30℃劇烈攪拌13小時(shí)。靜置溶液，然后經(jīng)傾析上清液來(lái)去除溶劑和生成的脂肪酸。沉淀用200ml己烷∶乙醇∶水(1∶1∶0.3，v/v/v)溶液在室溫提取。去除溶液的下部水層，之后將50ml乙醇加入剩余物中，在室溫過濾所得產(chǎn)物。濾餅再次用100ml己烷∶乙醇(1∶1，v/v)溶液處理，過濾，然后干燥。通過用液相色譜分析所得的干燥物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)得到了4.5g溶血磷脂酰乙醇胺，純度為98％。
將100g純化的蛋黃磷脂(Doosan Serdary Research Labs.制造，磷脂酰膽堿75％，磷脂酰乙醇胺14％，其他11％)溶于500ml乙酸乙酯中。將經(jīng)由Yang的方法[S.F.Yang等，J.Biol.Chem.，242(3)，477-484(1967)]制備的8000單位的甘藍(lán)磷脂酶D與含80mM CaCl2的500ml乙酸鈉緩沖液(100mM，pH5.6)和25g乙醇胺混合，然后，混合物與上面溶解的磷脂溶液混合，然后在以300rpm攪拌的同時(shí)使之在室溫反應(yīng)13小時(shí)。經(jīng)HPLC分析所得混合物，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)溶液中磷脂酰乙醇胺的含量為62％，磷脂酰膽堿的含量為22％。取出500ml反應(yīng)溶液，用作實(shí)施例4的起始原料。
向500ml反應(yīng)溶液中加入10ml的Lecitase(10000 IU/ml，NovoNordisk A/S)，然后溶液在30℃劇烈攪拌6小時(shí)。靜置溶液5小時(shí)，然后經(jīng)傾析上清液來(lái)去除溶劑和生成的脂肪酸。剩余的反應(yīng)溶液用1000ml己烷∶乙醇(1∶1，v/v)混合物在室溫提取。去除上清液，之后將200ml乙醇加入剩余溶液中，所得產(chǎn)物在4℃保存12小時(shí)。然后經(jīng)過濾所得溶液回收濾餅?；厥盏臑V餅用200ml己烷∶乙醇∶水(1∶1∶0.3，v/v/v)溶液處理，過濾，然后靜置1小時(shí)。去除下部水層后，將100ml乙醇加入剩余物中，然后過濾。濾餅用200ml己烷∶乙醇(1∶1，v/v)溶液處理，在4℃保存8小時(shí)。接著過濾并干燥。經(jīng)分析所得的干燥物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)得到了10.7g溶血磷脂酰乙醇胺，純度為99％。
向反應(yīng)溶液中加入2ml的Lecitase(10000 IU/ml，Novo NordiskA/S)，然后溶液在30℃劇烈攪拌5小時(shí)。用300ml氯仿∶甲醇(2∶1，v/v)混合物提取所述溶液后，下部氯仿層在50℃用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀濃縮，結(jié)果得到4.5g產(chǎn)物。所述產(chǎn)物用80ml冷丙酮沉淀兩次，然后得到不溶于丙酮的物質(zhì)。將所得物質(zhì)在加熱下溶于50ml己烷∶乙醇(9∶1，v/v)混合物中，然后向其中加入15ml水。靜置2小時(shí)后，去除下部水層后，將50ml乙醇加入其中。所得混合物在-8℃保存4小時(shí)，然后在-8℃過濾。濾餅再次用100ml己烷∶乙醇(1∶1，v/v)溶液處理，然后過濾產(chǎn)物并干燥。上述過程重復(fù)兩次。經(jīng)液相色譜分析所得的干燥物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)得到了0.9g溶血磷脂酰乙醇胺，純度為86％。
10ml由實(shí)施例7制備的反應(yīng)溶液用30ml乙酸乙酯(或己烷)處理以進(jìn)行提取。在2000rpm離心5分鐘。經(jīng)用薄層層析(TLC)分析上層，發(fā)現(xiàn)根本沒有產(chǎn)生結(jié)晶溶血磷脂酰乙醇胺，只在下層存在溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰膽堿、脂肪酸、磷脂酰膽堿、鞘磷脂、磷脂酰乙醇胺形成的混合物作為反應(yīng)產(chǎn)物。
根據(jù)如上述本發(fā)明方法制備的高純度溶血磷脂酰乙醇胺以低成本生產(chǎn)，可用于食品、醫(yī)藥、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中。
權(quán)利要求
1.制備高純度溶血磷脂酰乙醇胺的方法，包括以下步驟(1)經(jīng)如下過程得到溶血磷脂用磷脂水解酶處理含磷脂酰乙醇胺的磷脂混合物，以將所述磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)化成溶血磷脂酰乙醇胺；(2)用溶劑混合物處理所述溶血磷脂，所述溶劑混合物包含水和一種或多種選自低級(jí)醇、烴和烷基酯的有機(jī)溶劑；(3)在-10℃至50℃下靜置由步驟(2)得到的反應(yīng)混合物，從而使結(jié)晶的溶血磷脂酰乙醇胺沉淀；以及(4)回收由步驟(3)得到的沉淀。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(1)中的磷脂混合物包含以重量計(jì)為10-99％量的磷脂酰乙醇胺。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述磷脂混合物包含以重量計(jì)為30-99％量的磷脂酰乙醇胺。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(1)中的磷脂混合物是大豆磷脂或蛋黃磷脂。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(1)中的磷脂混合物在加入乙醇胺的條件下用磷脂轉(zhuǎn)化酶處理，然后所述混合物中的磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化成磷脂酰乙醇胺。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(1)中的磷脂水解酶是磷脂酶A2。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(2)中的有機(jī)溶劑是選自下組的兩種或更多種溶劑的混合物具有1-4個(gè)碳的低級(jí)醇；具有6-12個(gè)碳的直鏈或支鏈脂族烴或芳族烴；以及由具有2-6個(gè)碳的直鏈或支鏈脂肪酸與直鏈或支鏈烷基構(gòu)成的酯。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述醇是甲醇或乙醇，所述烴是己烷、環(huán)己烷或庚烷，所述烷基酯是乙酯。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(2)和步驟(3)同時(shí)進(jìn)行。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(3)中的結(jié)晶過程在-10℃至30℃下進(jìn)行。
11.權(quán)利要求1、7或8的方法，其中所述步驟(2)中的溶液混合物包含以體積百分比計(jì)為0.5-80∶20-99.5的水和有機(jī)溶劑。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(2)中的溶劑混合物是水和醇的混合物。
全文摘要
本文公開了經(jīng)酶處理磷脂混合物，然后在不經(jīng)柱純化情況下進(jìn)行溶劑分級(jí)分離，從而以高純度純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法。本發(fā)明方法包括用磷脂酶A2水解含10－99重量％磷脂酰乙醇胺的磷脂混合物，生成溶血磷脂；和用溶劑混合物處理溶血磷脂，所述溶劑混合物包含水和一種或多種選自低級(jí)醇、烴和烷基酯的有機(jī)溶劑，以去除除溶血磷脂酰乙醇胺之外的雜質(zhì)。
文檔編號(hào)C12P13/04GK1402794SQ00816445
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月30日
發(fā)明者鄭國(guó)薰, 梁永來(lái) 申請(qǐng)人:株式會(huì)社斗山