專利名稱：宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是以慢性高血糖為特征的代謝紊亂，血糖增高的原因有胰島素分泌或作用的缺陷，或者兩者同時存在。臨床上將其分為1型、2型、其他特殊類型和妊娠期糖尿病等。 1型糖尿病是一種胰島素依賴性糖尿病，主要由于胰島素的細(xì)胞特征性被破壞造成自身免疫疾病。發(fā)病階段，胰島中β胰島素分泌細(xì)胞被自身免疫攻擊選擇性毀壞，不能產(chǎn)生足夠的胰島素，血糖濃度調(diào)節(jié)失衡，從而導(dǎo)致高血糖發(fā)生。2006年第19界國際糖尿病大會調(diào)查結(jié)果表明，全球糖尿病的平均發(fā)病率大約為5. 7%或更多，全球約有2. 3億糖尿病患者，并且以每年700萬人的速度增加。目前糖尿病在臨床上的常規(guī)治療是應(yīng)用胰島素注射，而這種方法并不能有效的控制血糖水平，也不能預(yù)防糖尿病腎病、冠心病、糖尿病眼病等并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。對于喪失胰島細(xì)胞功能的糖尿病患者來說，移植胰島β細(xì)胞或其替代物是一個很具吸引力的方法。近年來，移植胰島細(xì)胞治療糖尿病取得了一些進(jìn)展，病人在接受人胰島細(xì)胞移植后，能脫離胰島素治療，血糖得到控制。利用干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為類胰島細(xì)胞并植入糖尿病患者對其進(jìn)行治療是一種糖尿病治療的新方法。干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細(xì)胞。利用干細(xì)胞誘導(dǎo)胰島細(xì)胞然后移植糖尿病病人的治療方法是一種極具吸引力的新的治療手段。干細(xì)胞可以來自胚胎、胎兒或者成體，根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段不同，將其分為胚胎干細(xì)胞(ESC)和成體干細(xì)胞(ASC)。根據(jù)它們的功能可以分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和專能干細(xì)胞。目前研究的干細(xì)胞主要有以下幾種1.胚胎干細(xì)胞(ES)胚胎干細(xì)胞是全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)，可以分化為任何類型細(xì)胞和組織，其在糖尿病等多種疾病治療中極具應(yīng)用價值。來源于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團和受精卵發(fā)育至桑椹胚之前的胚胎細(xì)胞，Lumelsky等用五步法將小鼠的胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出分泌胰島素的類胰島β細(xì)胞，還能受血糖的影響控制分泌的多少，但是其分泌量較少，是正常胰島素分泌細(xì)胞分泌量的1/50。移植到糖尿病小鼠的皮下時，能在12d內(nèi)分泌胰島素，維持小鼠的體重不下降，存活時間延長，但是不能糾正高血糖。Assady等用人的胚胎干細(xì)胞(hEQ在體外貼壁和懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hES可以自主分化，其中也包括一群產(chǎn)生胰島素的類β細(xì)胞。免疫組化染色顯示有相當(dāng)高比例的細(xì)胞分泌胰島素。分化后的這些細(xì)胞還能表達(dá)很多胰島β細(xì)胞的表面標(biāo)志(如Glut2)。Soria等從小鼠胚胎干細(xì)胞中成功分離到一株可分泌胰島素的細(xì)胞克隆，體外給予不同濃度的促分泌素可以調(diào)節(jié)胰島素基因表達(dá)，而將該細(xì)胞克隆植入脾臟1周即可糾正鏈脲佐霉素所致糖尿病小鼠的高血糖癥，4周后其體重恢復(fù)正常，糖耐量試驗也逐漸恢復(fù)。Fujikawa等按照Lumelsky等的方法分化細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞移植后出現(xiàn)了畸胎瘤。且由于來源于胚胎，倫理、道德約束甚至法律方面的限制是胚胎干細(xì)胞研究和應(yīng)用的最
4大障礙。2.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞被證明具有向多種世系細(xì)胞分化的能力，成為干細(xì)胞研究的一個熱點。Oh SH等研究表明骨髓細(xì)胞體外培養(yǎng)可以誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞，經(jīng)擴增后移植可以糾正糖尿病鼠的高血糖，效果可以持續(xù)90天。Kojima等研究表明糖尿病鼠胰腺外許多組織含有胰島素表達(dá)陽性細(xì)胞，包括胸腺、骨髓、脂肪組織、脾臟、肝臟，這些胰島素表達(dá)陽性細(xì)胞來源于骨髓。Mathews等研究則表明骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞可遷移至小鼠受損傷的胰島處，這些細(xì)胞具有促血管形成作用，參與胰島B細(xì)胞的再生。國內(nèi)也有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細(xì)胞的報道。Lu等將人的胰島素基因轉(zhuǎn)入人的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞，該細(xì)胞可以穩(wěn)定的分泌胰島素。李艷華和裴雪濤等利用人骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，通過體外擴增和定向誘導(dǎo)分化研究發(fā)現(xiàn)，MSC經(jīng)第一個階段的誘導(dǎo)后可分化成nestin陽性的祖細(xì)胞，繼續(xù)誘導(dǎo)6天后變圓的細(xì)胞逐漸增多，并聚集成團， 雙硫腙染色陽性；經(jīng)兩個階段誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)胰島素、胰高血糖素、生長抑素等內(nèi)分泌激素，放射免疫分析表明誘導(dǎo)的胰島樣細(xì)胞團可分泌胰島素，糖反應(yīng)性較弱。3.骨髓造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞是最先被發(fā)現(xiàn)和研究而得以應(yīng)用于臨床治療的干細(xì)胞。Ianus等研究表明，移植的骨髓造血干細(xì)胞可以參與小鼠完好胰島的自我更新，并增殖、轉(zhuǎn)分化為有功能的胰島β細(xì)胞，而且排除了發(fā)生細(xì)胞融合的可能。St印toe等研究結(jié)果顯示造血干細(xì)胞移植給NOD小鼠后，NOD小鼠的糖尿病發(fā)病率明顯下降，造血干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)自身抗原胰島素原的合成，用于自身免疫性小鼠糖尿病的預(yù)防有明顯的效果。Rachdi 等研究表明小鼠胰島中有10-20%的胰島素陽性細(xì)胞可以檢測出造血干細(xì)胞的KIT標(biāo)志物，說明造血干細(xì)胞參與胰島素分泌細(xì)胞的再生。所以利用骨髓干細(xì)胞動員劑進(jìn)行自體骨髓干細(xì)胞動員，在體內(nèi)原位移植治療糖尿病也值得引起重視。2007年，巴西研究人員對14 名I型糖尿病患者進(jìn)行了自體非清髓性造血干細(xì)胞移植，結(jié)果顯示除了一名患者外，其余病患的胰島素分泌細(xì)胞功能都得到了相應(yīng)的恢復(fù)，胰島素水平有所上升，大部分患者脫離胰島素依賴。4.臍血干細(xì)胞2007年以前，有人用臍血細(xì)胞直接經(jīng)靜脈注入1型、2型糖尿病小鼠體內(nèi)治療糖尿病。Ende等用人的臍血細(xì)胞經(jīng)靜脈注入2型糖尿病小鼠體內(nèi)后，能緩解糖尿病癥狀，改善腎臟的癥狀，延長存活時間。而將人臍血細(xì)胞經(jīng)靜脈注入1型糖尿病小鼠體內(nèi)后，血糖顯著降低，并且移植的細(xì)胞越多，血糖下降幅度也越大，能減少胰腺炎的發(fā)生，延長存活時間。5.胰腺干細(xì)胞Peek等成功地從人和小鼠的胰腺導(dǎo)管上皮分離了干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下能快速增殖，并失去導(dǎo)管上皮細(xì)胞特異性的表型，該細(xì)胞在合適的條件下可分化形成胰島的各種分泌細(xì)胞，具有多向分化潛能，被稱為胰腺干細(xì)胞。它們是一種嗜堿性的單核細(xì)胞，直徑約8 μ m，呈圓形，細(xì)胞核呈圓形或腎形，較大，含2個核仁，染色質(zhì)細(xì)膩而分散，胞質(zhì)中不含顆粒，在形態(tài)上與小淋巴細(xì)胞極為相似。Ramiya等將成體NOD小鼠胰腺富含導(dǎo)管部分離體培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的細(xì)胞可以在體外增殖達(dá)兩年之久，并能被誘導(dǎo)分化形成“胰島祖細(xì)胞” (islet progenitor ceils，IPCs)。W^eir等對分離于人胰腺組織的胰管細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，成功誘導(dǎo)胰腺干細(xì)胞分化為既含胰管細(xì)胞又含胰島素分泌細(xì)胞的細(xì)胞群。很顯然，擴增及誘導(dǎo)胰腺干細(xì)胞分化是獲得B細(xì)胞替代物更直接的途徑。但若將胰腺干細(xì)胞應(yīng)用于臨床， 還需要做很多工作，如如何尋找最佳的擴增及誘導(dǎo)方案、最佳的移植部位等。現(xiàn)已從胰管中分離獲得胰腺干細(xì)胞，但由于量少、取材困難，用于臨床的難度較大。6.肝臟干細(xì)胞已有實驗證明，一些多能成體干細(xì)胞有跨世系分化一即轉(zhuǎn)分化的能力。例如，神經(jīng)干細(xì)胞可以形成血細(xì)胞，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生骨骼肌，心肌和肝卵圓細(xì)胞等。在發(fā)生上，胰腺與肝臟同源，因而，也有很多學(xué)者提出用肝臟干細(xì)胞誘導(dǎo)分化出胰腺的細(xì)胞來治療糖尿病。實驗證明肝干細(xì)胞也具有向胰腺細(xì)胞世系轉(zhuǎn)分化的能力，成體肝臟中的肝干細(xì)胞樣細(xì)胞在離體條件下具有向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的潛能。Yang等用肝臟的卵圓細(xì)胞在高糖環(huán)境，尼克酰胺作用下，分化為胰島樣細(xì)胞團。這些細(xì)胞可表達(dá)胰島素、胰高血糖素等胰島相關(guān)基因的mRNA，移植到糖尿病小鼠的腎被膜下，可以控制血糖。7.宮內(nèi)膜(經(jīng)血)干細(xì)胞06年日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)來自經(jīng)血中的類干細(xì)胞，它們具有干細(xì)胞特性，例如自我更新和多分化潛能性的特點。不久后研究人員發(fā)現(xiàn)用于再生醫(yī)學(xué)的最新的、更豐富的干細(xì)胞來源經(jīng)血，確定經(jīng)血干細(xì)胞具有潛在的、無限的應(yīng)用價值，同時其來源不受道德倫理約束， 容易收集、儲存時間長和價格低廉等優(yōu)點而受到科學(xué)家的重視。目前僅有一篇研究文獻(xiàn)報道過宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)胰腺分泌細(xì)胞的研究，但是這篇文獻(xiàn)中所用的細(xì)胞來自于子宮纖維瘤的病人的子宮切除樣本，這樣獲取的干細(xì)胞是否具有轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的可能不能忽視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法，所得的胰島素分泌細(xì)胞用于治療糖尿病，從而為干細(xì)胞治療提供新的種子資源。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴增將經(jīng)血經(jīng)含抗生素的殺菌液的殺菌處理后，離心，去上清液；然后加入Chang氏通用培養(yǎng)基置于4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后換液去除未貼壁細(xì)胞；一旦細(xì)胞生長至75 85%匯合度時，即采用胰酶消化傳代；一般，可每隔2 4換液一次，每3 4天傳代細(xì)胞一次；2)、體外誘導(dǎo)分化將上述步驟1)所得的第4 6代生長狀況良好的細(xì)胞以胰酶消化，當(dāng)顯微鏡下見細(xì)胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含體積濃度為13 17%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心， 所得的細(xì)胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每5X IO5個的細(xì)胞中加入0. 8 1. 2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為低糖DMEM培養(yǎng)基，0.9 1. 非必需氨基酸，0.09 0. llmmol/L β-巰基乙醇
6(β -ME)，0. 9 1. lmmol/L谷氨酰胺，4 6 μ g/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)；每2 3天半量換液，培養(yǎng)13 15天，得胰島素分泌細(xì)胞。上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備方法為在每L低糖DMEM培養(yǎng)基中，加入9 Ilg的非必需氨基酸，0. 09 0. Ilmmol的β -ΜΕ,Ο. 9 1. Immol的谷氨酰胺，4 6 μ g的bFGF。該非必需氨基酸購自GIB⑶公司。作為本發(fā)明的宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法的改進(jìn)步驟1)依次為①、經(jīng)血收集在采集管內(nèi)設(shè)置20ml的Hank' s平衡鹽溶液(HBSS)，并添加以下成分至以下濃度萬古霉素(Vancomycin) 60 100 μ g/mL、頭孢氨芐(Claforan) 150 350 μ g/mL、卡那霉素(Amikacin) 50 150 μ g/mL、慶大霉素(Gentamycin) 80 160 μ g/mL、兩性霉素 B (Amphotericin B) 2 3 μ g/mL及300 500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液； 將15 20ml的經(jīng)血放入上述采集管內(nèi)，于0 4°C的低溫下保存M 48小時；然后離心， 去上清液；②、原代培養(yǎng)A)、取6 IOml的Chang氏通用培養(yǎng)基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養(yǎng)瓶中置于4 6% C02、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后全量換液；再將上述培養(yǎng)瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細(xì)胞滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；C)、在步驟B)所得的培養(yǎng)瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養(yǎng)基進(jìn)行潤洗(潤洗細(xì)胞層)，然后用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；D)、在步驟C)所得的培養(yǎng)瓶中加入6 IOmL的Chang氏通用培養(yǎng)基，置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下在無菌條件下，在無菌容器中加入650mL MEM-alpha(MEM alpha, Invitrogen ^w] ) >160 ~ 200mL Chang B (Irvine Scientific 公司)、10 30mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、5 15mL 青霉素/鏈霉素雙抗(10，00(^/11^芐青霉素鈉，10，00(^8/1^鏈霉素)，5 15mL的濃度為 200mM 的 L-谷氨酰胺(L-glutamine Jnvitrogen 公司)、130 170mL 的胎牛血清(ES-FBS， Invitrogen公司)；充分混勻，高壓蒸汽滅菌后放入0 4°C冰箱保存待用；③、細(xì)胞傳代培養(yǎng)一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長至75 85%匯合度時，即采用胰酶消化傳代； (一般每3 4天傳代細(xì)胞一次)；具體如下A)、一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長至75 85%匯合度時，去除培養(yǎng)液，然后用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進(jìn)行洗滌；B)、加入2 4ml胰酶，置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中孵育4 6分鐘；C)、加入4 6ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞狀態(tài)；E)、按l 8的比率傳代；
F)、在每Iml的細(xì)胞懸液中加入5 7ml的Chang氏通用培養(yǎng)基；然后置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在本發(fā)明中，孵育和培養(yǎng)均是在4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行的。在本發(fā)明中，用于消化的胰酶是指常規(guī)的0.25%或者0.2% (質(zhì)量體積比)的胰酶(胰蛋白酶)。宮內(nèi)膜干細(xì)胞是最近發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞的一種，屬于間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。子宮內(nèi)膜組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在豐富的間充質(zhì)干細(xì)胞，在月經(jīng)期間隨經(jīng)血排出體外，是一種無創(chuàng)、安全的干細(xì)胞來源方式。在細(xì)胞標(biāo)記分子表達(dá)和細(xì)胞增殖、分化能力上，經(jīng)血干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞更相似。經(jīng)血干細(xì)胞(MenSCs)是一類存在于經(jīng)血中具有自我更新與多分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞；女性每個月經(jīng)周期其子宮內(nèi)膜組織和血管都會大量增長，然后子宮內(nèi)膜脫落隨經(jīng)血一起排出體外，這些組織中含有具有可再生能力的細(xì)胞就是經(jīng)血干細(xì)胞，也叫宮內(nèi)膜干細(xì)胞(EMCs)。宮內(nèi)膜干細(xì)胞增值速度快，能夠表達(dá)Oct-4和SSEA-4人體胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志物，可分化為心肌、成骨、軟骨、脂肪和神經(jīng)細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明宮內(nèi)膜干細(xì)胞可以分化成多層胚層的多種細(xì)胞類型的能力。利用干細(xì)胞治療對于I型糖尿病患者來說，是一種可行的比較好的治療方法，但各種干細(xì)胞在臨床上的運用都有一些限制，例如胚胎干細(xì)胞要受到倫理、道德約束甚至法律方面的限制；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取材時，病人需遭受身體上的痛苦；造血干細(xì)胞要考慮到配型的問題，胰腺、臍血、肝臟造血干細(xì)胞往往是一位病人至少需要2份捐獻(xiàn)者的量，這受到來源不足的限制；而宮內(nèi)膜干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，克服了以上種種不足，它沒有倫理道德的問題，來源豐富、安全，并且容易在體外擴增與儲存。宮內(nèi)膜干細(xì)胞這一些優(yōu)點使得無論是用于干細(xì)胞基礎(chǔ)研究還是用于臨床治療上都是非常方便的。本發(fā)明將通過體內(nèi)、體外實驗，運用免疫組化染色、RT_PCR、ELISA等技術(shù)驗證宮內(nèi)膜干細(xì)胞治療糖尿病的可行性，從而為干細(xì)胞治療提供新的種子資源。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1、宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞能夠分泌胰島素，并且具有胰島β細(xì)胞的功能。2、宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞相對其他干細(xì)胞誘導(dǎo)效率較高。3、誘導(dǎo)的胰島素分泌細(xì)胞能夠改善I型糖尿病小鼠的高血糖癥狀并能延長生命。綜上所述，本發(fā)明采用分離培養(yǎng)的宮內(nèi)膜(經(jīng)血)干細(xì)胞，利用體外干細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，研究宮內(nèi)膜干細(xì)胞的多能性和向胰島素分泌細(xì)胞分化，并通過ICR小鼠模型(注小鼠模型是ICR)，進(jìn)行干細(xì)胞體內(nèi)移植，證實其治療I型糖尿病的可行性，為I型糖尿病的干細(xì)胞治療提供一種新的途徑。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明的宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法的流程圖；圖2是宮內(nèi)膜干細(xì)胞誘導(dǎo)前后形態(tài)8
左圖代表誘導(dǎo)前，右圖代表誘導(dǎo)14天后；圖3為免疫細(xì)胞化學(xué)染色實驗。左圖為對照，右圖為誘導(dǎo)第14天的疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果；圖4為RT-PCR檢測胰島β細(xì)胞相關(guān)基因的電泳圖；上圖分別代表insulin, PDX4, Glut2, NEUR0D1, Nkx2. 2，PDXl 基因的 RT-PCR 產(chǎn)物， 下圖代表β -actin基因的RT-PCR產(chǎn)物；圖5為誘導(dǎo)的干細(xì)胞小鼠體內(nèi)移植免疫組化圖；左上代表陽性對照，左下代表陰性對照，右上代表實驗組。圖6為干細(xì)胞小鼠體內(nèi)移植前后胰島素分泌分布圖；編號1代表第一組，編號2代表第二組，編號3代表對照組。
具體實施例方式—、宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴增招募10位不同年齡段的經(jīng)期婦女，在完全自愿的前提下捐獻(xiàn)月經(jīng)血樣品。具體操作規(guī)程如下1、經(jīng)血樣品收集將經(jīng)血采集管，月事杯放入經(jīng)血采集盒，送至經(jīng)血供者手中。采集管事先裝有 20mlHBSS(Hank' s平衡鹽溶液)采集液，其中含有Vancomycin (萬古霉素)80 μ g/mL、 Claforan (頭孢氨芐)250 μ g/mL、Amikacin (卡那霉素)100 μ g/mL、Gentamycin (慶大霉素)120 μ g/mL、Amphotericin B (兩性霉素B) 2. 7 μ g/mL及400單位肝素鈉。以此作為含抗生素的殺菌液。即上述HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)采集液的制備方法如下在20ml的Hank ‘ s平衡鹽溶液中添加以下成分至以下濃度萬古霉素 (Vancomycin) 80 μ g/mL、頭孢氨芐(Claforan) 250 μ g/mL、卡那霉素(Amikacin) 100 μ g/ mL、慶大霉素(Gentamycin) 120 μ g/mL、兩性霉素 B (Amphotericin B) 2. 7 μ g/mL及 400 單位肝素鈉；然后再按照常規(guī)程序于高溫高壓下進(jìn)行滅菌。供者在月經(jīng)開始的前幾天(第1至3天)，利用月事杯獲取經(jīng)血樣品。將每15 20ml的經(jīng)血放入上述1個采集管內(nèi)。在得到細(xì)胞捐贈者知會同意的情況下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng) (此知會同意必需獲得制定評審委員會的批準(zhǔn))。在獲取樣品后送往處理實驗室之前必須將它們在低溫(0 4°C )條件下進(jìn)行保存(保存期一般為M到48小時)。1)保存M小時后，觀察經(jīng)血收集管中的樣品，如有沉淀，可將樣品經(jīng)由IOOmicron 過濾網(wǎng)過濾；2)準(zhǔn)備離心前，仔細(xì)將樣品收集管的外周擦拭干凈；確保離心機上離心管的平3)在840g、4. 0°C的條件下離心樣品7分鐘；4)小心取出樣品收集管，勿擾亂細(xì)胞分層；5)將樣品收集管外周用酒精棉擦拭消毒后，移入生物安全柜進(jìn)行下一步操作；6)去除上清液；小心吸液，不要擾亂細(xì)胞層，造成額外的細(xì)胞丟失。上述上清液可用于進(jìn)行細(xì)菌檢測，即將該上清液按照常規(guī)的血培養(yǎng)法進(jìn)行厭氧菌菌的檢測，并按照常規(guī)方法進(jìn)行鑒定。若為陽性結(jié)果，則結(jié)束整個宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴增。將上述HBSS (Hank' s平衡鹽溶液)采集液中被處理了 M小時后的經(jīng)血，按照常規(guī)方式進(jìn)行微生物檢測及傳染病病原體安全檢測，一般對常見病毒如HIV、HBV, HCV, CMV和梅毒進(jìn)行檢測。若為陽性結(jié)果，則結(jié)束整個宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴增。上述2種檢測目的是為了保證最終所得的胰島素分泌細(xì)胞的使用安全性。2、原代培養(yǎng)培養(yǎng)基配制——Chang氏通用培養(yǎng)基的成分如下l)650mL MEM alpha 培養(yǎng)基2) 180mL Chang 氏 B 液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)(18% ν/ν)3) 20mL Chang 氏 C 液(2% ν/ν)4) IOmL青霉素/鏈霉素雙抗(10，000U/mL芐青霉素鈉，10, 000 μ g/mL鏈霉素；即每ml青霉素/鏈霉素雙抗溶液中含有10，000U的芐青霉素鈉和10，000 μ g的鏈霉素)5) IOmL 的 L-谷氨酰胺 200mM (IOOx)6) 150mL 的胎牛血清(15% ν/ν)Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下在無菌條件下，在無菌容器中加入 650mLMEM-alpha # S (MEM alpha, Invitrogen ^w] ) U80mL Chang BS^ (Irvine Scientific 公司)、20mL Chang C 基液(Irvine Scientific 公司)、IOmL 青霉素 / 鏈霉素雙抗(10，000U/mL芐青霉素鈉，10, 000 μ g/mL鏈霉素)，IOmL的濃度為200mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine，Invitrogen 公司)、150mL 的胎牛血清(ES-FBS，Invitrogen 公司)；充分混勻，按照常規(guī)方式高壓蒸汽滅菌后放入0 4°C冰箱保存待用。1)取7mLChang氏通用培養(yǎng)基，加入到已去除上清的經(jīng)血樣品(即步驟1的所得物)中，輕柔吹打混勻；得細(xì)胞懸液；2)取一個T-25培養(yǎng)瓶，將步驟1)所得的全部細(xì)胞懸液移取到該培養(yǎng)瓶中；3)放入36. 0-38. 0°C的孵箱內(nèi)(5% C02，95%飽和濕度)培養(yǎng)；4)培養(yǎng)5-7天，全量換液(即換7mLChang氏通用培養(yǎng)基)。在生物安全柜中，先將培養(yǎng)瓶直立5分鐘，待未貼壁的細(xì)胞大部分隨培養(yǎng)基滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管將培養(yǎng)基去除。5)取3mLChang氏通用培養(yǎng)基，慢慢在培養(yǎng)瓶側(cè)壁滴入。慢慢將培養(yǎng)瓶放平，輕柔地?fù)u晃，潤洗細(xì)胞層，然后將培養(yǎng)瓶直立5分鐘，用移液管將培養(yǎng)基去除。6)取7mLChang氏通用培養(yǎng)基，慢慢在培養(yǎng)瓶側(cè)壁滴入。7)鏡下觀察，有散落的貼壁細(xì)胞。8)放入36. 0-38. 0°C CO2孵箱(5% C02，95%飽和濕度)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，等干細(xì)胞細(xì)胞貼壁后，去除未貼壁的細(xì)胞，一般每隔2 4天換液一次繼續(xù)培養(yǎng)?！芎笥^察，細(xì)胞生長，有成團細(xì)胞增殖，此時細(xì)胞生長至80%匯合度。3、細(xì)胞傳代培養(yǎng)1)去除上述原代培養(yǎng)步驟的8)所得物中的培養(yǎng)液；2)用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進(jìn)行洗滌；上述無鈣鎂離子的PBS洗滌液的配制如下
NaCl8.OOg
KCl0. 2g
Na2HPO4H2O1. 56g
KH2PO40. 2
雙蒸水定容至1 L;于高壓蒸汽滅菌(常規(guī)程序)后放入4°C冰箱保存待用。3)加入3ml胰酶，36_38°C孵育(5% CO2,95%飽和濕度)5分鐘；4)加入5ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；5)輕柔吹打，使貼壁細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞狀態(tài)；6)按1 8的比率傳代在8ml的細(xì)胞懸液中取Iml至一新的T_25培養(yǎng)瓶中，再加入6ml的Chang氏通用培養(yǎng)基，混勻；7)放入 36. 0-38. 0°C CO2 孵箱(5% CO2,95% 飽和濕度)內(nèi)培養(yǎng)；8)每3-4天傳代細(xì)胞一次(即從步驟1)開始至步驟7)為止，每3_4天傳代一次)，過度生長的細(xì)胞會降低細(xì)胞的自然分化率。4、經(jīng)血間充質(zhì)干細(xì)胞的分子表型鑒定流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原1)細(xì)胞傳至第2-4代時收集細(xì)胞，0. 25%胰酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞量為 IXlO6 ；2)分別取所需數(shù)據(jù)的0. 5ml EP管，分別加入小鼠抗人單克隆抗體(⑶34，⑶44， CD45, CD73, CD90, CD105, CD29, SSEA-4，0CT-4，及同型對照)20 μ 1 ；3)、管內(nèi)分別加入細(xì)胞樣本(步驟1)所得)50μ1，避光4° C孵育30min ；4)、300g 離心 5 分鐘；5)、棄上清，加入(質(zhì)量濃度)人血清的PBS 1ml，充分混勻，300g離心5分鐘；6)、棄上清，加入PBS調(diào)整樣本量至100 μ 1，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析；所得結(jié)果為CD44，CD73,CD90, CD105, CD29, SSEA-4, 0CT-4 為陽性，CD34, CD45 為陰性；從而確定所得確為宮內(nèi)膜干細(xì)胞。二、體外誘導(dǎo)分化1.經(jīng)血干細(xì)胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞方法取第4-6代生長狀況良好的細(xì)胞，表現(xiàn)為生長旺盛、胞體大、胞核清晰、胞漿豐富、 顯微鏡下折光性強的細(xì)胞，以胰酶(例如為0.2%胰蛋白酶)消化，顯微鏡下見細(xì)胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含15%胎牛血清的DMEM終止消化，輕柔吹打后離心，獲得細(xì)胞沉淀，PBS洗 2遍(目的是為了洗去胰蛋白酶、胎牛血清等物質(zhì))。誘導(dǎo)培養(yǎng)基將細(xì)胞沉淀吹散，然后接種于6孔板中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種細(xì)胞密度為5 X IO5/孔，每孔加Iml誘導(dǎo)培養(yǎng)基(定容至 lml)。置于5% CO2, 95%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天半量換液，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)2周(14天)，誘導(dǎo)獲得所需的胰島素分泌細(xì)胞。上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為低糖DMEM，1%非必需氨基酸(購自GIBCO公司)，0. Immol/ L β -ME，lmmol/L 谷氨酰胺，5 μ g/L bFGF。
上述誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制備方法如下在每L低糖DMEM培養(yǎng)基中，加入IOg的非必需氨基酸，0. Immol的β-ME，Immol的谷氨酰胺，5 μ g的bFGF，于高壓蒸汽滅菌后放入4°C冰箱保存待用。2.檢測并確認(rèn)誘導(dǎo)生成的胰島素分泌細(xì)胞的方法(1)雙硫腙(dithizone，DTZ)染色將50mgDTZ溶于5ml 二甲基亞砜(DMSO)中，混勻，過濾除菌，備用。在誘導(dǎo)14天后進(jìn)行DTZ染色。染色時，向每Iml分化誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中加入lOulDTZ染色液，于37°C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)20分鐘，吸取染色孔內(nèi)的細(xì)胞少許，用PBS洗滌2次，顯微鏡下觀察、拍照。 如圖2所示。根據(jù)圖2可得知本發(fā)明誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠正常分泌胰島素。O)ELI5A試劑盒檢測誘導(dǎo)的細(xì)胞是否具有β胰島細(xì)胞功能這一檢測過程直接按照Mercodia公司所提供的“C-p印tide ELISA assays”標(biāo)準(zhǔn)操作過程做。最終結(jié)果檢測出C-肽，說明誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠分泌胰島素。(3)免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠分泌胰島素取誘導(dǎo)第14天的細(xì)胞涂片，40g/L甲醛常規(guī)固定后行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，一抗使用鼠抗人胰島素抗體，操作步驟具體如下PBS沖洗玻片3次，每次10分鐘。3%過氧化氫孵育10分鐘，蒸餾水沖洗3次，每次不少于5分鐘。滴加山羊血清封閉，室溫孵育30分鐘， 傾掉后吹干。滴加特異性酶標(biāo)抗體，稀釋抗體為1 50，37°C孵育30分鐘，PBS充分沖洗3 次，每次5分鐘。滴加顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，室溫下20分鐘后顯微鏡下觀察、拍照。如圖3所述。左圖為對照，右圖為誘導(dǎo)第14天的疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。根據(jù)圖3，可得知本發(fā)明所誘導(dǎo)的細(xì)胞能夠產(chǎn)生胰島素。(4) RT-PCR檢測誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞取誘導(dǎo)第14天的培養(yǎng)細(xì)胞，棄除上述各培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入 0.2%胰蛋白酶溶液，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入無菌離心管中，1000轉(zhuǎn)，離心5分鐘，棄去上清液，PBS洗2遍，重新用PBS懸浮細(xì)胞并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入經(jīng)高壓處理的無菌管中，2000轉(zhuǎn)，離心5分鐘，用濾紙吸干液體，用試劑盒提取總RNA，RT-PCR檢測胰島β細(xì)胞相關(guān)基因insulin、PDX-l、Glut2、 PAX4、NEUR0D1、Nkx2. 2 禾口 β -actin 的 mRNA 的表達(dá)。PAX4 上游引物5-GGCGTCGGCAAGAGAAGCTCAA-3下游引物5-TGGGCTGAGCTGTTTTCTACTTTT-3擴增片段長度為300bp ；PDX-I 上游引物5-GCCCCGCGGGTAGATGCCGGCA-3下游引物5-ATTTCTAAACTTAAAGGGGTCG-3擴增片段長度為300bp ；hsulin 上游引物5-CCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTC-3下游引物5-CAGTAGTTCTCCAGCTGGTAGA-3擴增片段長度為300bp ；NEUROD1 上游引物5-TTACAAAAGGCAGCCCTTTGGG-3下游引物5-GCCCATTACTAGTTTAAAAATT-3
擴增片段長度為300bp ；Nkx2. 2 上游引物5-TCACGCGCTCAAAGCCCAGGAC-3下游引物5-TCGACTCCATAATAATAATTAT-3擴增片段長度為300bp ；Glut2 上游引物5-CCCCTGGTTCATGGTGGCTGAG-3下游引物5-TTTGGTTTCTGGAACTTTAAAA-3擴增片段長度為300bp ；β -actin 上游引物5-CCTTAATACTTTTTTATTTTGT-3下游引物5-CGCGAAGCCGGCCTTGCACATGG-3擴增片段長度為300bp擴增條件預(yù)變性940C 5min，94°C 30s，63°C 40s，72°C lmin，30 個循環(huán)，最后 72°C 延伸-in。取5ul擴增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)照相并作吸光度掃描分析。
權(quán)利要求
1.宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征是包括以下步驟1)、宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴增將經(jīng)血經(jīng)含抗生素的殺菌液的殺菌處理后，離心，去上清液；然后加入Chang氏通用培養(yǎng)基置于4 6% CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后換液去除未貼壁細(xì)胞；一旦細(xì)胞生長至75 85%匯合度時，即采用胰酶消化傳代；2)、體外誘導(dǎo)分化將上述步驟1)所得的第4 6代生長狀況良好的細(xì)胞以胰酶消化，當(dāng)顯微鏡下見細(xì)胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含體積濃度為13 17%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細(xì)胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的 36 38°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每5X IO5個的細(xì)胞中加入0. 8 1. 2ml誘導(dǎo)培養(yǎng)基，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為低糖DMEM培養(yǎng)基，0.9 1. 非必需氨基酸，0.09 0. llmmol/L β-巰基乙醇， 0. 9 1. lmmol/L谷氨酰胺，4 6 μ g/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子；每2 3天半量換液，培養(yǎng)13 15天，得胰島素分泌細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法，其特征是所述步驟1)依次為①、經(jīng)血收集在采集管內(nèi)設(shè)置20ml的Hank' s平衡鹽溶液，并添加以下成分至以下濃度萬古霉素 60 100μ g/mL、頭孢氨芐150 350 μ g/mL、卡那霉素50 150 μ g/mL、慶大霉素80 160 μ g/mL、兩性霉素B 2 3 μ g/mL及300 500單位肝素鈉；以此作為含抗生素的殺菌液；將15 20ml的經(jīng)血放入上述采集管內(nèi)，于0 4°C的低溫下保存M 48小時；然后離心，去上清液；②、原代培養(yǎng)A)、取6 IOml的Chang氏通用培養(yǎng)基加入到步驟①所得物中；B)、將步驟A)的所得物放入培養(yǎng)瓶中置于4 6%CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；培養(yǎng)5 7天后全量換液；再將上述培養(yǎng)瓶直立3 8分鐘，從而使未貼壁的細(xì)胞滑落至培養(yǎng)瓶底部，用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；C)、在步驟B)所得的培養(yǎng)瓶中加入2 4mL的Chang氏通用培養(yǎng)基進(jìn)行潤洗，然后用移液管去除培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基；D)、在步驟C)所得的培養(yǎng)瓶中加入6 IOmL的Chang氏通用培養(yǎng)基，置于4 6%CO2, 94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；所述Chang氏通用培養(yǎng)基的配制方法如下在無菌條件下，在無菌容器中加入 650mLMEM-alpha 培養(yǎng)基、160 200mL 的 Chang B 基液、10 30mL 的 Chang C 基液、5 15mL青霉素/鏈霉素雙抗(10，00(^/11^芐青霉素鈉，10，00(^8/1^鏈霉素)，5 151^的濃度為200mM的L-谷氨酰胺、130 170mL的胎牛血清；充分混勻，高壓蒸汽滅菌后放入0 4°C冰箱保存待用；③、細(xì)胞傳代培養(yǎng)一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長至75 85%匯合度時，即采用胰酶消化傳代；具體如下A)、一旦步驟②原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長至75 85%匯合度時，去除培養(yǎng)液，然后用無鈣鎂離子的PBS洗滌液進(jìn)行洗滌；B)、加入2 胰酶，置于4 6%CO2,94 96%飽和濕度的36 38°C培養(yǎng)箱中孵育4 6分鐘；C)、加入4 6ml的Chang氏通用培養(yǎng)基使胰酶失活；D)、輕柔吹打，使貼壁細(xì)胞脫落并成單細(xì)胞狀態(tài)； 幻、按1 8的比率傳代；F)、在每Iml的細(xì)胞懸液中加入5 7ml的Chang氏通用培養(yǎng)基；然后置于4 6% CO2、94 96%飽和濕度的36 38 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種宮內(nèi)膜干細(xì)胞定向誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的方法，包括以下步驟1)宮內(nèi)膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和擴增；2)體外誘導(dǎo)分化將上述步驟1)所得的第4～6代生長狀況良好的細(xì)胞以胰酶消化，當(dāng)顯微鏡下見細(xì)胞變?yōu)閱蝹€圓形時即以含體積濃度為13～17％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心，所得的細(xì)胞沉淀用PBS清洗；在上述PBS清洗后的細(xì)胞中加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于4～6％CO2、94～96％飽和濕度的36～38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)13～15天，得胰島素分泌細(xì)胞。所得的胰島素分泌細(xì)胞用于治療糖尿病，從而為干細(xì)胞治療提供新的種子資源。
文檔編號C12N5/0775GK102154203SQ20111009320
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月13日
發(fā)明者項春生 申請人:杭州易文賽生物技術(shù)有限公司