本發(fā)明屬于微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種淡水中毒力基因為Stx1的大腸桿菌的快速篩選方法。
背景技術(shù)：
大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱為大腸桿菌，為埃希氏菌屬的代表菌種，廣泛存在于自然界中，其中致病性大腸桿菌(比如腸出血性大腸桿菌EHEC)能釋放強烈的毒素，并可能導(dǎo)致人和動物出現(xiàn)嚴重癥狀，如帶血腹瀉。世界各國及國際組織都將大腸桿菌作為重要衛(wèi)生與環(huán)境安全指標(biāo)：世界衛(wèi)生組織《飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(第二版)中規(guī)定,所有用于飲用的水中大腸桿菌不得檢出；美國飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，一級水質(zhì)中大腸桿菌不得檢出；中國國家標(biāo)準(zhǔn)《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》也規(guī)定,總大腸菌群及糞大腸菌群不得檢出。
目前,國際上公認的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)檢測方法以多管發(fā)酵法和濾膜法為主，即先根據(jù)其培養(yǎng)特性生物學(xué)特性進行初步鑒定，然后根據(jù)生化試驗進行最終的確診。上述方法檢測周期長,操作繁瑣,難以適應(yīng)污染源快速診斷的需要。近年來,基于核酸技術(shù)的分子生物學(xué)方法得到了快速發(fā)展。由于研究結(jié)果表明，腸出血性大腸桿菌攜帶的主要毒力基因為Stx1和Stx2(Ojo,O.E.,Ajuwape,A.T.P.,Otesile,E.B.,Owoade,A.A.,Oyekunle,M.A.,Adetosoye,A.I.Potentially zoonotic shiga toxin-producing escherichia coli serogroups in the faeces and meat of food-producing animals in ibadan,nigeria.International Journal of Food Microbiology，2010，142，214-221)，許多以其為識別位點的PCR方法(Khatami,F.,Heidari,M.,Khatami,M.Rapid detection of Escherichia coli O157∶H7 by fluorescent amplification-based specific hybridization(FLASH)PCR.Iranian Red CrescentMedical Journal,2012,14,594-598；Son,I.,Binet,R.,Maounounen,L.A.Detection of five Shiga toxinproducingEscherichia coli genes with multiplex PCR.FoodMicrobiology,2014,40,31-40)和環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增方法(Wang,F.,Yang,Q.,Qu,Y.,Meng,J,Ge B.Evaluation of a loop-mediatedisothermal amplification suite for the rapid,reliable,androbust detection of Shiga toxin-producing Escherichia coliinproduce.Applied and Environmental Microbiology,2014,80,2516-2525；Wu,L.,Song,Y.,Luan,T.,Ma,L.,Su,L.,Wang,S.,Yan,X.Specific detection of liveEscherichia coliO157:H7using tetracysteinetagged PP01 bacteriophage.Biosensors and Bioelectronics,2016,86,102-108)已經(jīng)建立和應(yīng)用。較之于傳統(tǒng)方法，基于核酸擴增的分子生物學(xué)方法檢測更為快速、靈敏、簡單。然而，目前基于核酸擴增的分子生物學(xué)方法全部基于目標(biāo)細菌的DNA提取，必需離心機等貴重輔助儀器，因而無法實施野外現(xiàn)場測定。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種淡水中毒力基因為Stx1的大腸桿菌的快速篩選方法，所述方法工作原理為：調(diào)節(jié)水樣酸度，使游離DNA吸附富集在功能膜上，然后采用環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增技術(shù)鑒定Stx1基因的定性信息，從而實現(xiàn)快速篩選出陽性淡水樣品。
本發(fā)明是通過以下步驟來實現(xiàn)：
一種淡水中毒力基因為Stx1的大腸桿菌的快速篩選方法，步驟包括樣品收集、預(yù)過濾、富集游離DNA、清洗和環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增鑒定五個步驟。
進一步，所述的樣品收集步驟，指原位收集不少于1.0L的待測定淡水；
進一步，所述的預(yù)過濾步驟，采用水系微孔濾膜過濾所收集的淡水樣品，除去不溶性物質(zhì)；
進一步，所述的水系微孔濾膜孔徑為0.45μm；
進一步，所述的富集游離DNA步驟，首先向過濾后的樣品中加入HCl或H2SO4，調(diào)節(jié)pH至4.9～5.8，再采用硅膠膜過濾，富集游離DNA到膜上。
進一步，所述的清洗步驟是在樣品完全過濾后，再加上純水，洗去干擾小分子和離子。
進一步，所述的環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增步驟，首先將硅膠膜平均分成4份，每份裝入一個反應(yīng)管，然后加入包括引物、酶在內(nèi)的擴增反應(yīng)試劑和指示劑，封閉反應(yīng)管，放入61-65°放溫度下反應(yīng)；同時做陽性和陰性對照，指示劑顏色變化指示環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增結(jié)果，陽性結(jié)果說明所測定淡水樣品中有目標(biāo)基因，即表明毒力基因為Stx1的大腸桿菌具有存在可能性。
進一步，所述的反應(yīng)管是透明的玻璃管、有機玻璃管或塑料管；
進一步，所述的指示劑為鈣黃綠素或羥基萘酚藍；
進一步，所述的各步驟，均采用無菌、無DNA污染的潔凈器具。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對比的有益效果：
(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)淡水樣品里游離DNA中Stx1基因與腸出血性大腸桿菌存在對應(yīng)關(guān)系。本篩選方法直接采集樣品中游離DNA，無需增菌及DNA提取步驟，因而高效、快捷。
(2)無需貴重設(shè)備，操作簡易，成本低，且可以實施現(xiàn)場測定。
具體實施方式
下面通過實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的解釋。但本發(fā)明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。
實施例1篩查自來水中是否含有毒力基因為Stx1的大腸桿菌
步驟一、滅菌、清洗所有需要的器具，使用前密封保存。
步驟二、用量筒接取自來水1.0L，采用注射器和針筒式濾膜過濾器(天津津騰，0.45μm水系微孔濾膜)濾除不溶物，收集濾液到潔凈燒杯中。
步驟三、向燒杯中滴入1滴0.1mol/L的HCl，微晃動混勻，調(diào)節(jié)pH至4.9～5.8。
步驟四、將核酸吸附硅膠膜(Lifefeng，杭州萊楓生物科技有限公司)放在過濾器(T-50，天津津騰)的砂心過濾頭上，固定好濾杯。
步驟五、將上述酸化的濾液倒入濾杯，重力作用下過濾，然后加入上0.2L純水，直至濾杯內(nèi)溶液全部消失。
步驟六、取出硅膠膜，剪成均分4份，分別塞入一個1.5ml PCR管。
步驟七、向PCR管中加入環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴增試劑，250μL的反應(yīng)體系包括各1.6μmol/L的引物FIP和BIP，各0.8μmol/L的引物L(fēng)F和LB，各0.2μmol/L的引物F3和B3，1.4mmol/L的dNTPs，6.0mmol/L的MgSO4，0.12μmol/L的羥基萘酚藍，1×緩沖液，8U/L的Bst大片段DNA聚合酶(美國NEB公司)。其中引物序列分別為(5’-3’)
F3：TGTTGGAAGAATTTCTTTTGGA；
B3：GCTAATAGCCCTGCGTATC；
FIP：CGCGATGCATGATGATGACAATAGTGTTAATGCAATTCTGGGT；
BIP：GAGCTTCCTTCTATGTGCCCGCAGAGTGGATGAGTCCCA；
LF：TCGCACCGTAATTATGACT；
LB：AGATGGAAGAGTGCGTGGG。
同時做陽性對照和陰性對照各1個。陽性對照實驗以腸出血性大腸桿菌基因組DNA為模板；陰性對照以純水為模板。
步驟八、將上述6個反應(yīng)管置于65℃水浴中反應(yīng)60min。
步驟九、結(jié)果判斷：檢測管中紫色混合液變?yōu)樘焖{色，表明待測自來水可能被毒力基因為Stx1的大腸桿菌污染；未變色，表明陰性。如對照管出現(xiàn)不符合情況，查找原因，消除影響因素，重做實驗。