本發(fā)明涉及一種鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR標(biāo)記引物組及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

SSR簡(jiǎn)稱重復(fù)序列標(biāo)記(Simple sequence repeats，SSR)，是基于PCR(基因擴(kuò)增)技術(shù)的分子標(biāo)記，具有高多態(tài)性、重復(fù)性、共顯性、豐富性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于分析品種親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究具有重要意義，通過(guò)確定遺傳距離，來(lái)分析其親緣關(guān)系，遺傳距離為零時(shí)，表明植株出自同一無(wú)性系。

中國(guó)專利文獻(xiàn)CN102286613A(申請(qǐng)?zhí)?01110127982.7)公開了防天麻退化的選育方法，它是采用AFLP或ISSR和SSR及天麻素含量標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)天麻，經(jīng)軟件繪制聚類圖并繪制天麻遺傳多態(tài)性與天麻素含量關(guān)系圖，從而快速分析天麻種質(zhì)資源親緣關(guān)系，鑒別天麻自交與雜交體，快速選擇確定天麻親本，快速鑒定天麻雜種純度等，能使中藥天麻優(yōu)質(zhì)可持續(xù)發(fā)展的育種選擇方法。

目前，現(xiàn)有技術(shù)多采用挖根的方法來(lái)調(diào)查刺槐是否出于同一無(wú)性系，然而由于刺槐連續(xù)多代萌生林無(wú)性系小株之間的連接根系可能已經(jīng)死亡，挖根的方法并不能準(zhǔn)確判斷它們的萌蘗擴(kuò)散范圍和擴(kuò)散規(guī)律。而且挖根的方法耗時(shí)費(fèi)力，在判斷刺槐的萌生植株是否來(lái)自于同一個(gè)基株時(shí)存在一定的主觀性。如何準(zhǔn)確鑒別刺槐的萌生植株是否來(lái)自于同一個(gè)基株成為研究刺槐擴(kuò)散格局與過(guò)程的關(guān)鍵問(wèn)題，也是判斷是否是同一無(wú)性系的主要環(huán)節(jié)。但由于目前未有采用SSR標(biāo)記鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的相關(guān)報(bào)道，如何利用相關(guān)SSR標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，從而提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性成為解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR標(biāo)記引物組及其應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

一種鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR標(biāo)記引物組，SSR標(biāo)記引物組共四組，每組包括4對(duì)引物；第一組的四對(duì)SSR標(biāo)記引物分別為，標(biāo)記Rops04的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；標(biāo)記RP106的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；標(biāo)記Rops09的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；標(biāo)記RP150的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

第二組的四對(duì)SSR標(biāo)記引物分別為，標(biāo)記RP035的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；標(biāo)記RP109的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；標(biāo)記RP200的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；標(biāo)記RP032的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

第三組的四對(duì)SSR標(biāo)記引物分別為，標(biāo)記Rops02的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；標(biāo)記Rops06的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；標(biāo)記Rops08的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；標(biāo)記RP206的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

第四組的四對(duì)SSR標(biāo)記引物分別為，標(biāo)記Rops05的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；標(biāo)記Rops10的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；標(biāo)記RP165的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.30所示；標(biāo)記RP01B的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述標(biāo)記Rops04的上游引物、標(biāo)記RP150的上游引物、標(biāo)記RP200的上游引物、標(biāo)記RP032的上游引物、標(biāo)記Rops06的上游引物、標(biāo)記RP206的上游引物、標(biāo)記Rops05的上游引物、標(biāo)記Rops10的上游引物的5’端連接有熒光標(biāo)簽FAM；

所述標(biāo)記RP106的上游引物、標(biāo)記RP109的上游引物、標(biāo)記Rops08的上游引物、標(biāo)記RP01B的上游引物的上游引物的5’端連接有熒光標(biāo)簽HEX；

所述標(biāo)記Rops09的上游引物、標(biāo)記RP035的上游引物、標(biāo)記Rops02的上游引物、標(biāo)記RP165的上游引物的5’端連接有熒光標(biāo)簽TAM。

一種利用上述SSR標(biāo)記引物組鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的方法，包括如下步驟：

(1)取待鑒別樣品，提取總DNA；

(2)以步驟(1)制得的總DNA為模板，分別用上述鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的四組SSR標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)對(duì)步驟(2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，當(dāng)擴(kuò)增出SSR標(biāo)記時(shí)，用1表示，當(dāng)未擴(kuò)增出SSR標(biāo)記時(shí)，用0表示，將每對(duì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增后的結(jié)果轉(zhuǎn)換為矩陣，用非加權(quán)算術(shù)平均聚類方法(UPGMA)分析計(jì)算遺傳距離，得出刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，樣品為葉片或枝條。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中，總DNA的提取方法采用改良的CTAB法。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增體系如下，總體積為10μL：

4μL Takara Multi-plex PCR Master Mix，濃度為10μM的4條上游引物每條各0.2μL，濃度為10μM的4條下游引物每條各0.2μL，10～30ng/μL模板1μL，加3.4μL ddH₂O補(bǔ)足至反應(yīng)總體積；

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增程序如下：

94℃預(yù)變性15min；94℃變性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，共28個(gè)循環(huán)；60℃終延伸30min，4℃終止反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的分析為：將步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后進(jìn)行測(cè)序；然后用軟件GeneMarker ver.2.4.0統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體16對(duì)SSR標(biāo)記所有等位基因的長(zhǎng)度，并與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)照，當(dāng)長(zhǎng)度在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)時(shí)，為有效擴(kuò)增出SSR標(biāo)記，當(dāng)長(zhǎng)度在標(biāo)準(zhǔn)范圍外時(shí)，為未擴(kuò)增出SSR標(biāo)記；所述的標(biāo)準(zhǔn)范圍如下：

標(biāo)記Rops04的標(biāo)準(zhǔn)范圍為105～110bp；

標(biāo)記RP106的標(biāo)準(zhǔn)范圍為143～154bp；

標(biāo)記Rops09的標(biāo)準(zhǔn)范圍為89～150bp；

標(biāo)記RP150的標(biāo)準(zhǔn)范圍為199～217bp；

標(biāo)記RP035的標(biāo)準(zhǔn)范圍為89～112bp；

標(biāo)記RP109的標(biāo)準(zhǔn)范圍為136～160bp；

標(biāo)記RP200的標(biāo)準(zhǔn)范圍為160～198bp；

標(biāo)記RP032的標(biāo)準(zhǔn)范圍為109～135bp；

標(biāo)記Rops02的標(biāo)準(zhǔn)范圍為107～138bp；

標(biāo)記Rops06的標(biāo)準(zhǔn)范圍為117～144bp；

標(biāo)記Rops08的標(biāo)準(zhǔn)范圍為191～205bp；

標(biāo)記RP206的標(biāo)準(zhǔn)范圍為222～246bp；

標(biāo)記Rops05的標(biāo)準(zhǔn)范圍為120～138bp；

標(biāo)記Rops10的標(biāo)準(zhǔn)范圍為182～187bp；

標(biāo)記RP165的標(biāo)準(zhǔn)范圍為146～159bp；

標(biāo)記RP01B的標(biāo)準(zhǔn)范圍為172～192bp。

根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的，所述電泳為采用ABI 3730xl測(cè)序儀進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中用非加權(quán)算術(shù)平均聚類方法計(jì)算遺傳距離采用NTSYSpc-2.11F軟件。

有益效果

1、本發(fā)明首次采用SSR標(biāo)記引物組鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系，通過(guò)篩選16個(gè)SSR標(biāo)記并設(shè)計(jì)特異引物，從而確保了鑒定的準(zhǔn)確性，較現(xiàn)有鑒別方法可以顯著縮短鑒別時(shí)間；

2、本發(fā)明通過(guò)在上游引物的5’端連接熒光標(biāo)簽，使每一PCR反應(yīng)體系中包含4對(duì)引物，降低了試驗(yàn)成本及時(shí)間；

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例2所述刺槐萌蘗的29個(gè)個(gè)體的空間分布圖；

圖中：圓圈表示刺槐個(gè)體，圓越大樹齡越大，同一顏色為同一基因型。

圖2是實(shí)施例2的W1刺槐個(gè)體的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度結(jié)果圖；

其中：圖2A、帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(Rops04和RP150)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖2B、帶有HEX熒光標(biāo)簽引物(RP106)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖2C、帶有TAM熒光標(biāo)簽引物(Rops09)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；

圖3是實(shí)施例2的W1刺槐個(gè)體的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度結(jié)果圖；

其中：圖3A、帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(RP200和RP032)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖3B、帶有HEX熒光標(biāo)簽引物(RP109)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖3C、帶有TAM熒光標(biāo)簽引物(RP035)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；

圖4是實(shí)施例2的W1刺槐個(gè)體的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度結(jié)果圖；

其中：圖4A、帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(Rops06和RP206)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖4B、帶有HEX熒光標(biāo)簽引物(Rops08)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖4C、帶有TAM熒光標(biāo)簽引物(Rops02)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；

圖5是實(shí)施例2的W1刺槐個(gè)體的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度結(jié)果圖；

其中：圖5A、帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(Rops04和RP150)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖5B、帶有HEX熒光標(biāo)簽引物(RP106)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；圖5C、帶有TAM熒光標(biāo)簽引物(Rops09)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度峰圖；

圖6是實(shí)施例2所述29株刺槐SSR標(biāo)記的UPGMA聚類分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實(shí)施例1

參照Lian C et al.(2002，2004)和Mishima K et al.(2009)開發(fā)的刺槐的21對(duì)SSR引物，選取了16對(duì)多態(tài)性高且通用性好的引物。

用的16對(duì)引物如表1所示：

表1用于刺槐基株、無(wú)性系小株鑒定和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析的SSR引物

實(shí)施例2

樣品來(lái)源

以泰山景區(qū)花園小水壩西坡的刺槐純林為研究對(duì)象(東經(jīng)：117°3′35.96″；北緯：36°16′56.26″；海拔：654.9m)。1958年造林，1976年間伐，1980年皆伐，1984年定株并梯田整地栽植華山松，1986年華山松移走后發(fā)展為萌生林。

取樣過(guò)程

在樣地內(nèi)選取20m×15m范圍，將其內(nèi)的29株個(gè)刺槐個(gè)體進(jìn)行SSR標(biāo)記分析；

選擇刺槐純林內(nèi)20m×15m的樣地，以樣地內(nèi)29株刺槐個(gè)體為研究對(duì)象，采取29株刺槐個(gè)體的葉片或枝條，分別放入乘有硅膠的牛皮紙袋中，并標(biāo)上樣品號(hào)。

一種利用SSR標(biāo)記引物組鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的方法，包括如下步驟：

(1)取待鑒別樣品的葉片或枝條，采用改良的CTAB法提取總DNA；

(2)以步驟(1)制得的總DNA為模板，分別用上述鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR標(biāo)記引物組中的特異引物組Multiplex 1、Multiplex 2、Multiplex 3和Multiplex 4(表1所示)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

PCR擴(kuò)增體系如下，總體積為10μL：

4μL Takara Multi-plex PCR Master Mix，濃度為10μM的4條上游引物每條各0.2μL，濃度為10μM的4條下游引物每條各0.2μL，10-30ng/μL模板1μL，加3.4μL ddH₂O補(bǔ)足至反應(yīng)總體積；

所述步驟(2)中，PCR擴(kuò)增程序如下：

94℃預(yù)變性15min；94℃變性30s，55℃退火90s，72℃延伸60s，共28個(gè)循環(huán)；60℃終延伸30min，4℃終止反應(yīng)。

(3)將步驟(2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)ABI 3730xl測(cè)序儀上跑膠(上海生工)，條帶長(zhǎng)度結(jié)果以峰圖的形式表示；以W1刺槐個(gè)體DNA為模板，以Multiplex 1(表1)為引物的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度示范圖如圖2所示，其中A、B和C圖分別表示帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(Rops04和RP150)、HEX熒光標(biāo)簽引物(RP106)和TAM熒光標(biāo)簽引物(Rops09)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度。

以Multiplex 2(表1)為引物的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度示范圖如圖3所示，其中A、B和C圖分別表示帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(RP200和RP032)、HEX熒光標(biāo)簽引物(RP109)和TAM熒光標(biāo)簽引物(RP035)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度。

以Multiplex 3(表1)為引物的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度示范圖如圖4所示，其中A、B和C圖分別表示帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(Rops06和RP206)、HEX熒光標(biāo)簽引物(Rops08)和TAM熒光標(biāo)簽引物(Rops02)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度。

以Multiplex 4(表1)為引物的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度示范圖如圖5所示，其中A、B和C圖分別表示帶有FAM熒光標(biāo)簽引物(Rops04和RP150)、HEX熒光標(biāo)簽引物(RP106)和TAM熒光標(biāo)簽引物(Rops09)的PCR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度。

然后用軟件GeneMarker ver.2.4.0統(tǒng)計(jì)，每個(gè)個(gè)體16對(duì)SSR標(biāo)記所有等位基因的長(zhǎng)度和有效性與標(biāo)準(zhǔn)范圍進(jìn)行比較，當(dāng)擴(kuò)增出SSR標(biāo)記時(shí)，用1表示，當(dāng)未擴(kuò)增出SSR標(biāo)記時(shí)，用0表示，將每對(duì)SSR標(biāo)記擴(kuò)增后的結(jié)果轉(zhuǎn)換為矩陣，采用Popgene version 1.31軟件計(jì)算Shannon指數(shù)(I，Shannon’s information index)、基因多樣性指數(shù)(H，gene diversity)、有效等位基因數(shù)(Ne，effective number of alleles)，用NTSYSpc-2.11F軟件計(jì)算遺傳距離和非加權(quán)算術(shù)平均聚類方法分析(UPGMA)，得出刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系。

為檢查本申請(qǐng)的微衛(wèi)星分析的可重復(fù)性，選擇9株刺槐個(gè)體進(jìn)行重復(fù)微衛(wèi)星分析。結(jié)果表明，100％的結(jié)果相匹配，這表明本申請(qǐng)所述的微衛(wèi)星分析具有高度可重復(fù)性。

將遺傳距離為0的株系均定為同一無(wú)性系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一基因型個(gè)體數(shù)超過(guò)2個(gè)的有四組，即W15，W2，W12，W22號(hào)刺槐是同一無(wú)性系；W16，W19，W11，W17號(hào)是同一無(wú)性系；W25，W3，W26，W14號(hào)是同一無(wú)性系；W9和W13號(hào)刺槐是同一無(wú)性系，如圖1所示，以不同顏色表示。

進(jìn)一步計(jì)算它們的空間距離即可得其擴(kuò)散的范圍。對(duì)這4組個(gè)體分別掘根觀察，證實(shí)每組個(gè)體均為同一無(wú)性系。余下15個(gè)個(gè)體基因型各不相同，可能與樣地內(nèi)未檢測(cè)的個(gè)體以及樣地外的其他個(gè)體存在相同基因型，也可能是來(lái)自種子萌發(fā)。該結(jié)果證明利用SSR標(biāo)記技術(shù)分析刺槐連續(xù)多代萌生林無(wú)性系小株的來(lái)源，進(jìn)一步判斷刺槐萌蘗擴(kuò)散規(guī)律是可行的。這一嘗試的成功，為本研究探索刺槐多代萌生林的株間親緣關(guān)系，揭示刺槐萌蘗擴(kuò)散范圍和擴(kuò)散規(guī)律奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種鑒別刺槐種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR標(biāo)記引物組及其應(yīng)用

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtctaatttc acttttctca cgag 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggacaccacc raaattctac c 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

aaactgaatt atatcccttt acggc 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gcatatatcc accagatacc cg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctccaggtca ctcgattgag g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tttctcattt gatacgaccc c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcgttggatc aacatgcatg g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

acagaaccct aaccctagca 20

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggagtggaat gcatgctctc atg 23

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tccaaatgga aactcccttg aaacac 26

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gaggaatcac aaaaccgttt gg 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

tgggatttga gagagtggtg gtg 23

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

ggtttctttg ttcacctgct ctgg 24

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

acctacgtgt ccacggctct 20

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

gcatattgca tatgcgcttg tg 22

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

tccctgaagc tcataactgt catgtg 26

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

cagaactgtg gagaataatt ctgaac 26

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

cgccatctgt tagtttgttg c 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ctaaggaggt gctgaccctc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

ttaatctgtg atgggacact g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ttctgaggaa gggttccgtg g 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

gttaaagcaa caggcacatg g 21

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

gccaaatccc attagatcac agttga 26

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

agaagttaga cttacgtgct gc 22

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

tggtgattaa gtcgcaaggt g 21

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gttgtgactt gtacgtaagt c 21

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

aactttttcc gtataggggt c 21

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gagttttaca cttggtcaaa cc 22

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

ttagatgttg caagtgctga gg 22

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

acaatgcctc aatgcagc 18

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

accaattagg taacgtcagc 20

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

tgttcactga caaagctg 18