本發(fā)明屬于疾病療效評(píng)價(jià)領(lǐng)域，特別涉及一種基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

肺結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性肺部感染性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康，在中國(guó)的流行形勢(shì)十分嚴(yán)峻。目前我國(guó)尚無明確的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，導(dǎo)致14％的出院患者尚未完全治愈；也導(dǎo)致另一部分患者過度治療，造成藥物毒副反應(yīng)增加，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)加重，醫(yī)藥資源浪費(fèi)等。

目前，對(duì)肺結(jié)核病的療效評(píng)價(jià)主要通過臨床醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)判斷和痰培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。然而通過胸部X片/CT影像學(xué)改變等經(jīng)驗(yàn)判斷主觀性太強(qiáng)，容易誤診；痰培養(yǎng)檢查又耗時(shí)太長(zhǎng)，需要4-8周，分辨功效差，特異性僅為57.8％。因此，亟需建立一種敏感、高效、準(zhǔn)確的肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)新判定方法。miRNAs不易在血液中被酶降解，且具有組織和細(xì)胞特異性，能夠用于疾病分子診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)，適合作為疾病的候選檢測(cè)標(biāo)志物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒及其用途，該試劑盒可以高效、準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)肺結(jié)核病患者的治療效果，特異性強(qiáng)、敏感性高。

基于上述目的，本發(fā)明提供的一種基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒，包括RNA提取緩沖液，加Poly(A)反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，血清miRNA上游引物組合、內(nèi)參上游引物、通用下游引物以及熒光定量RT-PCR反應(yīng)液；

其中，所述血清miRNA組合物由4個(gè)差異表達(dá)的血清miRNAs組成，這4個(gè)血清miRNAs的名稱和序列分別如下所示：

hsa-miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，其為SEQ ID NO:1序列；

hsa-miR-92a-3p：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU，其為SEQ ID NO:2序列；

hsa-miR-125a-5p：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA，其為SEQ ID NO:3序列；

hsa-miR-148b-3p：UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU，其為SEQ ID NO:4序列；

所述內(nèi)參為hsa-miR-16，序列為：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG，其為SEQ ID NO:5序列。

本發(fā)明篩選出4個(gè)血清miRNAs作為肺結(jié)核治療效果判定的生物標(biāo)志物，該4個(gè)血清miRNAs在未用藥、治療2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清均有顯著性差異表達(dá)，可以作為肺結(jié)核治療效果判定的分子標(biāo)志物；同時(shí)為了避免由于不同患者的個(gè)體差異，僅用1-2個(gè)miRNAs去判定肺結(jié)核治療效果顯得極為不可靠的問題，本發(fā)明篩選出一組miRNAs，建立miRNAs表達(dá)譜模型可使結(jié)果更加可靠。本發(fā)明應(yīng)用Solexa測(cè)序技術(shù)篩選血清中差異表達(dá)的特異miRNAs，作為肺結(jié)核治療效果判定的生物標(biāo)志物，是一種特異性強(qiáng)、敏感性高的肺結(jié)核治療效果評(píng)價(jià)方法，對(duì)肺結(jié)核治療效果的評(píng)價(jià)具有重要的意義。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述RNA提取緩沖液包括：BIOZOL、氯仿、無水乙醇、濃度為75％的乙醇溶液和RNAase-free水；

所述加Poly(A)反應(yīng)液包括：總RNA、5U/μL的大腸桿菌Poly(A)聚合酶、10×Poly(A)聚合酶緩沖液、5×rATP溶液和RNase-Free水；

所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：Poly(A)反應(yīng)液、10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物、10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物緩沖液、2.5mM的dNTPs、40U/μL的RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶和RNase-Free水；

所述血清miRNA上游引物組合由hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物和hsa-miR-148b-3p的上游引物組成；

所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)液包括：2×miRcute miRNA預(yù)混物、目的上游引物、通用下游引物、50×ROX染液、cDNA模板和RNase-Free水；其中所述目的上游引物為hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。

在本發(fā)明中，所述目的上游引物均購(gòu)自購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(hsa-miR-21-5p引物目錄號(hào)CD201-0092，hsa-miR-92a-3p引物目錄號(hào)CD201-0040，hsa-miR-125a-5p引物目錄號(hào)CD201-0008，hsa-miR-148b-3p引物目錄號(hào)CD201-0220)。

在本發(fā)明中，所述內(nèi)參上游引物購(gòu)自購(gòu)自購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(hsa-miR-16引物目錄號(hào)CD201-0235)。所述通用下游引物為hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p和hsa-miR-16的通用下游引物，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(目錄號(hào)：FP401)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，加Poly(A)反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為：

總RNA：0.1～13.6μL；

5U/μL的大腸桿菌Poly(A)聚合酶：0.4μL；

10×Poly(A)聚合酶緩沖液：2.0μL；

5×rATP溶液：4.0μL；

RNase-Free水：補(bǔ)足至20.0μL；

其中，總RNA在該反應(yīng)體系中濃度為2.0μg。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為：

Poly(A)反應(yīng)液：2.0μL；

10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物：2.0μL；

10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物緩沖液：2.0μL；

2.5mM的dNTPs：1.0μL；

40U/μL的RNase抑制劑：1.0μL；

反轉(zhuǎn)錄酶：0.5μL；

RNase-Free水：11.5μL。

在本發(fā)明中，10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(目錄號(hào)：KR201)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，熒光定量RT-PCR反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為：

2×miRcute miRNA預(yù)混物：10.0μL；

10μM的目的上游引物：0.4μL；

10μM的通用下游引物：0.4μL；

50×ROX染液：1.6μL；

cDNA模板：2.0μL；

RNase-Free水：5.6μL；

其中所述目的上游引物為hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，還包括核酸純化柱、1.5mL無RNA酶EP管、96孔板及封口膜。

基于相同的發(fā)明構(gòu)思，，本發(fā)明還提供了所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)采集外周血、離心、吸上清；

(2)將步驟(1)所得上清用RNA提取緩沖液提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，計(jì)算總RNA濃度；

(3)將2.0μg總RNA加入20.0μL加Poly(A)反應(yīng)液體系，混勻離心后，37℃反應(yīng)60min，得到Poly(A)反應(yīng)液；其中，根據(jù)總RNA濃度換算2.0μg總RNA所對(duì)應(yīng)的總RNA體積；

(4)吸取2.0μL步驟(3)所得的Poly(A)反應(yīng)液，加入20.0μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系，混勻離心后，37℃反應(yīng)60min，得到cDNA模板反應(yīng)液；

(5)冰上操作，吸取2.0μL步驟(4)所得的cDNA模板反應(yīng)液，分別加入20.0μL含hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物的熒光定量RT-PCR反應(yīng)液中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94～95℃預(yù)變性2分鐘；94～95℃變性20秒，60℃退火延伸34秒，40-45個(gè)循環(huán)；

(6)計(jì)算4個(gè)樣本miRNA濃度，帶入Logistic逐步模型的回歸方程，經(jīng)計(jì)算后評(píng)價(jià)肺結(jié)核病治療效果。

在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述Logistic逐步模型的回歸方程為：

Logit(p)＝-1.5666+0.3711(has-miR-21-5p相對(duì)表達(dá)量)+0.04398(has-miR-92a-3p相對(duì)表達(dá)量)-0.03621(has-miR-125a-5p相對(duì)表達(dá)量)+1.3785(has-miR-148b-3p相對(duì)表達(dá)量)

獲得Logit(p)值，通過P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])換算得到P值，以0.5為界，判定肺結(jié)核病治療效果。

在本發(fā)明中，P值以0.5為界，P值接近于0的，判定為已治愈肺結(jié)核病，P值接近于1的，判定為未治愈肺結(jié)核病。

基于相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒在制備肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑中的用途。

本發(fā)明基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)的試劑盒的原理為：

采用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p和hsa-miR-148b-3p四種miRNAs表達(dá)水平：其中，

hsa-miR-21-5p(miRBase：MIMAT0000076，成熟序列：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA)可通過靶向抑制IL-12產(chǎn)物，下調(diào)T細(xì)胞的抗菌反應(yīng)；

hsa-miR-92a-3p(miRBase：MIMAT0000092，成熟序列：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU)通過調(diào)價(jià)靶基因MYCBP2，介導(dǎo)c-myc功能，調(diào)控細(xì)胞凋亡；

hsa-miR-125a-5p(miRBase：MIMAT0000443，成熟序列：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA)可抑制KLF13、UVRAG等的表達(dá)，從而促進(jìn)機(jī)體發(fā)揮抗炎、抗菌的作用，其在部分炎癥疾病中高表達(dá)；

hsa-miR-148b-3p(miRBase：MIMAT0000759，成熟序列：UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU)可通過PIK3CA、CSF1等靶基因調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)整合素家族，并可通過調(diào)控ROCK1抑制細(xì)胞增殖遷移。

根據(jù)物種miRNAs的特性，將四個(gè)miRNAs表達(dá)量帶入Logistic逐步回歸模型，經(jīng)計(jì)算后，即可判定是否治愈肺結(jié)核病。

本發(fā)明運(yùn)用MedCalc軟件計(jì)算單個(gè)血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p鑒別治愈肺結(jié)核病的ROC曲線，包括靈敏度、特異性和曲線下面積(AUC)，結(jié)果顯示血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p分別是0.648、0.627、0.571、0.686；敏感性分別是58.8％、55.8％、82.7％、48.1％；特異性分別是58.3％、80.8％、42.3％、94.2％。結(jié)果說明單個(gè)血清蛋白鑒別治愈肺結(jié)核病的敏感性和特異性都不高。

采用Logistic逐步回歸模型計(jì)算血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p組合物鑒別治愈肺結(jié)核病的ROC曲線，通過數(shù)據(jù)計(jì)算和分析，構(gòu)建治愈肺結(jié)核病組合物的二分類Logistic逐步模型的回歸方程：

Logit(p)＝-1.5666+0.3711(has-miR-21-5p相對(duì)表達(dá)量)+0.04398(has-miR-92a-3p相對(duì)表達(dá)量)-0.03621(has-miR-125a-5p相對(duì)表達(dá)量)+1.3785(has-miR-148b-3p相對(duì)表達(dá)量)，其ROC曲線靈敏度65.38％，特異性80.77％，曲線下面積(AUC)為0.787(95％Confidence Interval＝0.695～0.861)，具有較高的準(zhǔn)確性，同時(shí)敏感性高、特異性強(qiáng)。說明血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p組合物可用于制備肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)的試劑盒。

從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒采用血清miRNAs組合物的方式評(píng)價(jià)肺結(jié)核病患者的治療效果，具有較高的敏感性和特異性，且操作簡(jiǎn)便，效率高，樣本狀態(tài)受限小，優(yōu)于目前臨床所采用的痰培養(yǎng)，為肺結(jié)核病的療效評(píng)價(jià)提供了一種新的評(píng)估方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例未用藥、治療2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清中hsa-miR-21-5p的表達(dá)水平比較示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例未用藥、治療2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清中hsa-miR-92a-3p的表達(dá)水平比較示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例未用藥、治療2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清中hsa-miR-125a-5p的表達(dá)水平比較示意圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例未用藥、治療2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清中hsa-miR-148b-3p的表達(dá)水平比較示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p和組合物的ROC曲線示意圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，并參照附圖，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒的組成

在本實(shí)施例中，肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒包括RNA提取緩沖液，加Poly(A)反應(yīng)液，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，血清miRNA上游引物組合、內(nèi)參上游引物、通用下游引物以及熒光定量RT-PCR反應(yīng)液；其中，所述血清miRNA組合物由4個(gè)差異表達(dá)的血清miRNAs組成，這4個(gè)血清miRNAs的名稱和序列分別如下所示：

hsa-miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，其為SEQ ID NO:1序列；

hsa-miR-92a-3p：UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU，其為SEQ ID NO:2序列；

hsa-miR-125a-5p：UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA，其為SEQ ID NO:3序列；

hsa-miR-148b-3p：UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU，其為SEQ ID NO:,4序列；

所述內(nèi)參為hsa-miR-16，序列為：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG，其為SEQ ID NO:5序列。

在本實(shí)施例中，所述RNA提取緩沖液包括：BIOZOL、氯仿、無水乙醇、濃度為75％的乙醇溶液和RNAase-free水；BIOZOL購(gòu)自杭州博日科技有限公司、無水乙醇購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，RNAase-free水購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

在本實(shí)施例中，所述加Poly(A)反應(yīng)液包括：總RNA、5U/μL的大腸桿菌Poly(A)聚合酶、10×Poly(A)聚合酶緩沖液、5×rATP溶液和RNase-Free水；以上加Poly(A)反應(yīng)液試劑屬于miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(目錄號(hào)：KR201)。

所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：Poly(A)反應(yīng)液、10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物、10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物緩沖液、2.5mM的dNTPs、40U/μL的RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶和RNase-Free水；以上逆轉(zhuǎn)錄試劑屬于miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(目錄號(hào)：KR201)。

miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(目錄號(hào)：KR201)采用在miRNA 3’末端加多聚A尾Poly(A)，再使用oligo(dT)-universal tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈。

miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒包含miRNA 3’末端Poly(A)修飾過程和逆轉(zhuǎn)錄過程的所有試劑，該試劑盒具有高效的Poly(A)修飾和逆轉(zhuǎn)錄效率，可從20pg-2μg的total RNA中有效制備miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈。

在本實(shí)施例中，所述血清miRNA上游引物組合由hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物和hsa-miR-148b-3p的上游引物組成；以上miRNAs上游引物購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(hsa-miR-21-5p引物目錄號(hào)CD201-0092，hsa-miR-92a-3p引物目錄號(hào)CD201-0040，hsa-miR-125a-5p引物目錄號(hào)CD201-0008，hsa-miR-148b-3p引物目錄號(hào)CD201-0220)。

在本實(shí)施例中，內(nèi)參上游引物為hsa-miR-16引物，目錄號(hào)CD201-0235。

在本實(shí)施例中，所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)液包括：2×miRcute miRNA預(yù)混物、目的上游引物、通用下游引物、50×ROX染液、cDNA模板和RNase-Free水；其中所述目的上游引物為hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。以上熒光定量RT-PCR試劑屬于miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司(目錄號(hào)：FP401)

miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)中包含miRNA熒光定量檢測(cè)的所有試劑，包括2×miRcute miRNA Premix和Reverse primer。2×miRcute miRNA Premix是專門為miRNA檢測(cè)而研發(fā)的新一代熒光定量檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑采用Premix預(yù)混系統(tǒng)，包含了優(yōu)化配比的dNTP、增強(qiáng)劑、穩(wěn)定劑等，且其中的DNA Polymerase采用的是新一代抗體修飾的熱啟動(dòng)技術(shù)，保證高特異性和高靈敏度。同時(shí)，還加入了ROX作為內(nèi)參染料，以使實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果準(zhǔn)確可靠。該試劑盒通量高，可用于從一個(gè)合成反應(yīng)的cDNA中檢測(cè)多種miRNAs。

在本實(shí)施例中，所述肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒還包括：核酸純化柱、1.5mL無RNA酶EP管、96孔板及貼膜。核酸純化柱購(gòu)自杭州博日科技有限公司，1.5mL無RNA酶EP管、96孔板及封口膜購(gòu)自美國(guó)Axygen公司。

實(shí)施例2：肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒Logistic逐步回歸模型建立

采用肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒分別檢測(cè)未用藥、用藥2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清中hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p的表達(dá)水平。

(1)樣本收集：

依據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的肺結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，收集未用藥、治療2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者各53例。同期收集健康對(duì)照者53例，HIV檢測(cè)均為陰性，無乙肝，無糖尿病，無哮喘，無結(jié)核病史，肝腎功能正常，無其他先天性疾病，并排除慢性炎癥、自身免疫病等其他疾病，不存在其他手術(shù)史，年齡、性別無顯著差異。

所有參加者血樣均為晨起空腹抽取，采用一次性真空不抗凝采血管，采集外周血3.0mL，4小時(shí)內(nèi)離心(3000r/min，10min，4℃)，吸上清后分裝成各50μL，保存于-80℃冰箱。

(2)血清樣本總RNA提?。?/p>

①將未用藥、用藥2個(gè)月、治愈肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照者血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解；

②取600μL BIOZOL加入到1.5mL無RNA酶的EP管中，加入200μL血清樣本，置于渦旋儀劇烈渦旋混勻至充分裂解，于室溫靜置5min；再加140μL氯仿，劇烈振蕩混合均勻后，12000rpm離心15min；

③吸取上清液體，轉(zhuǎn)移到新的1.5mL收集管中，加入一定體積的無水乙醇，使上清液體積占30％，混合均勻，得到混合液體；

作為一個(gè)較佳的實(shí)施例，所述上清液體吸取量為450μL，無水乙醇添加量為1050μL；

④吸取750μL以上混合液體至核酸純化柱中，6000rpm離心1min，棄去接液管中的液體，重復(fù)本次操作，直到將所有混合液體離心；

⑤核酸純化柱中加入500μL濃度為75％的乙醇溶液，12000rpm離心1min，棄去接液管中的液體，重復(fù)本次操作；核酸純化柱空轉(zhuǎn)12000rpm離心2min；

⑥把核酸純化柱放入新的1.5mL無RNA酶的EP管中，加入30μL RNase-Free水。室溫孵育1min后，12000rpm離心1min，收集流出的RNA溶液，Nanodrop-2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值，計(jì)算總RNA濃度，保存于-80℃冰箱備用。

(3)加Poly(A)處理：

根據(jù)miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟，先對(duì)miRNA 3'末端進(jìn)行加Poly(A)處理。在冰上預(yù)冷1.5mL無RNA酶EP管，根據(jù)總RNA濃度換算加入的總RNA體積，使2.0μg總RNA加入20.0μL加Poly(A)反應(yīng)液體系(最后加入大腸桿菌Poly(A)聚合酶)。加Poly(A)反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為：

總RNA：0.1～13.6μL(濃度為2.0μg)；

5U/μL的大腸桿菌Poly(A)聚合酶：0.4μL；

10×Poly(A)聚合酶緩沖液：2.0μL；

5×rATP溶液：4.0μL；

RNase-Free水：補(bǔ)足至20.0μL。

移液器輕輕混勻上述配制的加Poly(A)反應(yīng)液體系，短暫離心后在37℃反應(yīng)60min，得到Poly(A)反應(yīng)液。

(4)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：

吸取2.0μL加Poly(A)處理所得的Poly(A)反應(yīng)液，加入20.0μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為：

Poly(A)反應(yīng)液：2.0μL；

10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物：2.0μL；

10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物緩沖液：2.0μL；

2.5mM的dNTPs：1.0μL；

40U/μL的RNase抑制劑：1.0μL；

反轉(zhuǎn)錄酶：0.5μL；

RNase-Free水：11.5μL。

以上逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，目錄號(hào)：KR201。

移液器輕輕混勻上述配制的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系，短暫離心后在37℃反應(yīng)60min，得到cDNA模板反應(yīng)液。合成的cDNA模板反應(yīng)液放置于-20℃保存。

(5)qRT-PCR定量檢測(cè)：

根據(jù)miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)步驟，取出所有試劑、目的miRNA上游引物以及96孔板，室溫平衡30min后置于冰上。將miRcute miRNA預(yù)混物(2×)上下顛倒輕輕混勻，短暫離心備用。

吸取2.0μL cDNA模板反應(yīng)液，加入20.0μL熒光定量RT-PCR反應(yīng)液體系，每個(gè)樣本制備3個(gè)重復(fù)。熒光定量RT-PCR反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為：

2×miRcute miRNA預(yù)混物：10.0μL；

10μM的目的上游引物：0.4μL；

10μM的通用下游引物：0.4μL；

50×ROX染液：1.6μL；

cDNA模板：2.0μL；

RNase-Free水：5.6μL；

目的上游引物為hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，hsa-miR-21-5p引物目錄號(hào)CD201-0092，hsa-miR-92a-3p引物目錄號(hào)CD201-0040，hsa-miR-125a-5p引物目錄號(hào)CD201-0008，hsa-miR-148b-3p引物目錄號(hào)CD201-0220。同時(shí)設(shè)有內(nèi)參hsa-miR-16，其余成分相同。通用下游引物為血清miRNAs和內(nèi)參的通用下游引物，購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，目錄號(hào)：FP401。

將上述反應(yīng)液充分混勻，貼上封口膜，8000rpm離心5s后，在Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94～95℃預(yù)變性2分鐘；94～95℃變性20秒，60℃退火延伸34秒，40-45個(gè)循環(huán)。

作為一個(gè)較佳的實(shí)施例，所述反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性20秒，60℃退火延伸34秒，45個(gè)循環(huán)。

在Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System中，記錄目的miRNAs及內(nèi)參的CT值。

(6)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析：

根據(jù)樣本miRNAs CT值，取平均值換算各樣本miRNAs相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量為2^-ΔCT，-ΔCT＝CT miRNA-CT miR-16

采用SPSS 16.0軟件中Nonparametric Mann-Whitney U test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(P<0.05時(shí)，具有顯著性差異；P<0.01時(shí)，具有極顯著性差異)，并應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件繪制含誤差線的柱狀圖，參見圖1-圖4。

運(yùn)用MedCalc軟件計(jì)算單個(gè)血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p鑒別治愈肺結(jié)核病的ROC曲線，包括靈敏度、特異性和曲線下面積(AUC)，結(jié)果顯示血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p分別是0.648、0.627、0.571、0.686；敏感性分別是58.8％、55.8％、82.7％、48.1％；特異性分別是58.3％、80.8％、42.3％、94.2％。結(jié)果說明單個(gè)血清蛋白鑒別治愈肺結(jié)核病的敏感性和特異性都不高。

采用Logistic逐步回歸模型計(jì)算血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p組合物鑒別治愈肺結(jié)核病的ROC曲線，通過數(shù)據(jù)計(jì)算和分析，構(gòu)建治愈肺結(jié)核病組合物的二分類Logistic逐步模型的回歸方程：

Logit(p)＝-1.5666+0.3711(has-miR-21-5p相對(duì)表達(dá)量)+0.04398(has-miR-92a-3p相對(duì)表達(dá)量)-0.03621(has-miR-125a-5p相對(duì)表達(dá)量)+1.3785(has-miR-148b-3p相對(duì)表達(dá)量)。

其ROC曲線靈敏度65.38％，特異性80.77％，曲線下面積(AUC)為0.787(95％Confidence Interval＝0.695～0.861)，參見圖5。具有較高的準(zhǔn)確性，同時(shí)敏感性高、特異性強(qiáng)。說明血清hsa-miR-21-5p、hsa-miR-92a-3p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-148b-3p組合物可用于制備治愈肺結(jié)核病的療效評(píng)價(jià)試劑盒。

實(shí)施例3：肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒檢測(cè)效果的驗(yàn)證及應(yīng)用

留一法交叉驗(yàn)證：取治愈、用藥2個(gè)月、未用藥肺結(jié)核病患者、健康對(duì)照的血清樣本，樣本收集及檢測(cè)方法同實(shí)施例2所述。

檢測(cè)后，將各miRNAs相對(duì)表達(dá)量值代入公式，得到Logit(p)值，通過P＝exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])換算得到P值。P值以0.5為界，P值接近于0的判定為已治愈肺結(jié)核病，P值接近于1的判定為未治愈肺結(jié)核病。

留一法交叉驗(yàn)證獲得模型的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(Positive Predictive Value，PPV)為80.77％、陰性預(yù)測(cè)值(Negative predictive value，NPV)為65.38％，模型正確率為73.08％。

可見，本發(fā)明基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核療效評(píng)價(jià)試劑盒具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)采用檢測(cè)肺結(jié)核病的特異血清miRNAs組合物，對(duì)肺結(jié)核病是否治愈進(jìn)行鑒別，該檢測(cè)技術(shù)對(duì)樣本狀態(tài)要求低，適用性廣，組合物的構(gòu)建方法設(shè)計(jì)精確、合理可行。

(2)傳統(tǒng)的痰培養(yǎng)方法檢測(cè)需要4-8周，分辨功效差，特異性低，安全性差，需在特定實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，對(duì)檢測(cè)單位設(shè)備要求高。而本試劑盒操作簡(jiǎn)便、快捷，僅需3-4小時(shí)，且該試劑盒是一種基于血清miRNAs水平的檢測(cè)，安全有效，易于檢測(cè)。

(3)本發(fā)明對(duì)治愈肺結(jié)核病檢測(cè)的靈敏度65.38％，特異性80.77％，具有較高的準(zhǔn)確性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)治愈肺結(jié)核病的評(píng)估，為肺結(jié)核病的療效評(píng)價(jià)提供了一項(xiàng)客觀的新方法。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 浙江大學(xué)

<120> 一種基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒及其用途

<130> FI170068

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> hsa-miR-21-5p

<400> 1

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> hsa-miR-92a-3p

<400> 2

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210> 3

<211> 24

<212> RNA

<213> hsa-miR-125a-5p

<400> 3

ucccugagac ccuuuaaccu guga 24

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> hsa-miR-148b-3p

<400> 4

ucagugcauc acagaacuuu gu 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> hsa-miR-16

<400> 5

uagcagcacg uaaauauugg cg 22