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一種基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒及其用途的制作方法

文檔序號(hào):12697704閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒,其特征在于,包括RNA提取緩沖液,加Poly(A)反應(yīng)液,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,血清miRNA上游引物組合、內(nèi)參上游引物、通用下游引物以及熒光定量RT-PCR反應(yīng)液;

其中,所述血清miRNA組合物由4個(gè)差異表達(dá)的血清miRNAs組成,這4個(gè)血清miRNAs的名稱和序列分別如下所示:

hsa-miR-21-5p:UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA,其為SEQ ID NO:1序列;

hsa-miR-92a-3p:UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU,其為SEQ ID NO:2序列;

hsa-miR-125a-5p:UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA,其為SEQ ID NO:3序列;

hsa-miR-148b-3p:UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU,其為SEQ ID NO:4序列;

所述內(nèi)參為hsa-miR-16,序列為:UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG,其為SEQ ID NO:5序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒,其特征在于,所述RNA提取緩沖液包括:BIOZOL、氯仿、無水乙醇、濃度為75%的乙醇溶液和RNAase-free水;

所述加Poly(A)反應(yīng)液包括:總RNA、5U/μL的大腸桿菌Poly(A)聚合酶、10×Poly(A)聚合酶緩沖液、5×rATP溶液和RNase-Free水;

所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括:Poly(A)反應(yīng)液、10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物、10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物緩沖液、2.5mM的dNTPs、40U/μL的RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶和RNase-Free水;

所述血清miRNA上游引物組合由hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物和hsa-miR-148b-3p的上游引物組成;

所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)液包括:2×miRcute miRNA預(yù)混物、目的上游引物、通用下游引物、50×ROX染液、cDNA模板和RNase-Free水;其中所述目的上游引物為hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒,其特征在于,加Poly(A)反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為:

總RNA:0.1~13.6μL;

5U/μL的大腸桿菌Poly(A)聚合酶:0.4μL;

10×Poly(A)聚合酶緩沖液:2.0μL;

5×rATP溶液:4.0μL;

RNase-Free水:補(bǔ)足至20.0μL;

其中,總RNA在該反應(yīng)體系中濃度為2.0μg。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒,其特征在于,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為:

Poly(A)反應(yīng)液:2.0μL;

10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物:2.0μL;

10×通用逆轉(zhuǎn)錄引物緩沖液:2.0μL;

2.5mM的dNTPs:1.0μL;

40U/μL的RNase抑制劑:1.0μL;

反轉(zhuǎn)錄酶:0.5μL;

RNase-Free水:11.5μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒,其特征在于,熒光定量RT-PCR反應(yīng)液體系以20.0μL計(jì)為:

2×miRcute miRNA預(yù)混物:10.0μL;

10μM的目的上游引物:0.4μL;

10μM的通用下游引物:0.4μL;

50×ROX染液:1.6μL;

cDNA模板:2.0μL;

RNase-Free水:5.6μL;

其中所述目的上游引物為hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒,其特征在于,還包括核酸純化柱、1.5mL無RNA酶EP管、96孔板及封口膜。

7.一種如權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒的使用方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)采集外周血、離心、吸上清;

(2)將步驟(1)所得上清用RNA提取緩沖液提取總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測OD值,計(jì)算總RNA濃度;

(3)根據(jù)總RNA濃度換算加入的總RNA體積,使2.0μg總RNA加入20.0μL加Poly(A)反應(yīng)液體系,混勻離心后,37℃反應(yīng)60min,得到Poly(A)反應(yīng)液;

(4)吸取2.0μL步驟(3)所得的Poly(A)反應(yīng)液,加入20.0μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液體系,混勻離心后,37℃反應(yīng)60min,得到cDNA模板反應(yīng)液;

(5)冰上操作,吸取2.0μL步驟(4)所得的cDNA模板反應(yīng)液,分別加入20.0μL含hsa-miR-21-5p的上游引物、hsa-miR-92a-3p的上游引物、hsa-miR-125a-5p的上游引物或hsa-miR-148b-3p的上游引物的熒光定量RT-PCR反應(yīng)液中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)條件:94~95℃預(yù)變性2分鐘;94~95℃變性20秒,60℃退火延伸34秒,40-45個(gè)循環(huán);

(6)計(jì)算4個(gè)樣本miRNA濃度,帶入Logistic逐步模型的回歸方程,經(jīng)計(jì)算后評(píng)價(jià)肺結(jié)核病治療效果。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒的使用方法,其特征在于,所述Logistic逐步模型的回歸方程為:

Logit(p)=-1.5666+0.3711(has-miR-21-5p相對(duì)表達(dá)量)+0.04398(has-miR-92a-3p相對(duì)表達(dá)量)-0.03621(has-miR-125a-5p相對(duì)表達(dá)量)+1.3785(has-miR-148b-3p相對(duì)表達(dá)量)

獲得Logit(p)值,通過P=exp[Logit(p)]/(1+exp[Logit(p)])換算得到P值,以0.5為界,判定肺結(jié)核病治療效果。

9.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的基于血清miRNA組合物的肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑盒在制備肺結(jié)核病療效評(píng)價(jià)試劑中的用途。

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