本發(fā)明涉及的是基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種鑒定大豆雄性不育系的引物及其方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)雜交是大豆育種中最常用的方法，但是這種方法主張優(yōu)中選優(yōu)，親本之一常為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)良品種，長(zhǎng)期以往，生產(chǎn)上使用的品種的親緣就會(huì)十分接近，必然導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)趨于單一化，因此對(duì)實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、多抗并且遺傳基礎(chǔ)廣泛的高標(biāo)準(zhǔn)育種目標(biāo)已顯得力所不及。于是人們逐步重視利用輪回選擇進(jìn)行群體改良，以解決常規(guī)雜交存在的遺傳基礎(chǔ)狹窄的問(wèn)題。
大豆作為自花授粉作物，其花器小、雜交困難且成活率太低，導(dǎo)致利用輪回選擇法改良大豆品種的難度較大。自20世紀(jì)至今，在大豆上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些雄性不育材料，利用其作為母本進(jìn)行雜交，既省去了人工去雄，降低了生產(chǎn)成本，還能得到大量純凈優(yōu)質(zhì)的雜交種，為輪回選擇在大豆群體改良中的應(yīng)用開(kāi)辟了廣闊前景。
大豆核雄性不育分為三種類(lèi)型：第一類(lèi)為雄性不育但是雌性可育，這類(lèi)突變無(wú)雄性生殖功能而雌性生殖功能不受影響或影響很小。大豆雄性不育研究最多且被廣泛利用的是隱性單基因控制的雄性不育雌性可育系列。第二類(lèi)為雄性不育且雌性也不育，此類(lèi)不育很難在遺傳育種中應(yīng)用，沒(méi)有實(shí)際意義。第三類(lèi)為大豆質(zhì)核互作雄性不育，最早是Davis通過(guò)栽培大豆間雜交獲得了首例大豆質(zhì)核互作的雄性不育系，20世紀(jì)90年代孫寰等報(bào)道了中國(guó)創(chuàng)造的第一個(gè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)已經(jīng)相繼成功選育了十多個(gè)質(zhì)核互作雄性不育系并實(shí)現(xiàn)了三系配套。
目前常利用的大豆雄性不育雌性可育材料，用昆蟲(chóng)傳粉代替了復(fù)雜的人工授粉，使得輪回選擇在大豆中得以利用。我國(guó)大豆輪回選擇起步較晚，所見(jiàn)報(bào)的極少。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)宋啟建等利用大豆雄性不育基因材料與40個(gè)親本合成了我國(guó)第一個(gè)高產(chǎn)、高蛋白含量基礎(chǔ)輪回群體。
大豆雄性不育的鑒定方法目前主要依賴(lài)于表型鑒定，在大豆生長(zhǎng)早期很難進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。而如果在分子水平可以鑒定出來(lái)，無(wú)疑是最高效準(zhǔn)確的方法，但是目前針對(duì)大豆雄性不育的分子標(biāo)記技術(shù)的有效專(zhuān)利很少，本發(fā)明正是針對(duì)這個(gè)方面的研究成果。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種鑒定大豆雄性不育系的引物及其方法，以提供一種新的針對(duì)大豆雄性不育的分子標(biāo)記及大豆雄性不育系的分子鑒定方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)大豆雄性不育系的引物，所述引物序列為：
SEQ ID NO.1：上游引物：ATCATCTCACTCTGCGTGTA
SEQ ID NO.2：下游引物：CCATCCTTTCCCTACCTT
本發(fā)明還提供了一種鑒定大豆雄性不育系的方法，包括以下步驟：
(1)提取大豆植株組織DNA；
(2)以大豆植株組織DNA為模板，利用如權(quán)利要求1所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BstXI進(jìn)行酶切，若酶切產(chǎn)物僅含一條472bp的條帶，則對(duì)應(yīng)的大豆植株為雄性不育植株，若酶切產(chǎn)物包含266bp和202bp，則對(duì)應(yīng)的大豆植株為雄性可育植株。
進(jìn)一步地，所述步驟(3)中，若酶切產(chǎn)物僅包含266bp和202bp的條帶，則為純合雄性可育植株，若酶切產(chǎn)物包含472bp、266bp和202bp三條帶，則為雜合雄性可育植株，若酶切產(chǎn)物僅有472bp，則為純合不育植株。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明在發(fā)現(xiàn)大豆雄性不育性狀受到一對(duì)隱形單基因控制的基礎(chǔ)上，提供了一種鑒定大豆雄性不育系的引物及其方法，該引物和方法可以在大豆育種過(guò)程中的任何時(shí)期對(duì)大豆育性及其基因型(純和、雜合)進(jìn)行高效準(zhǔn)確的鑒定，為大豆雄性不育系的分子鑒定提供了一種新的方法。
附圖說(shuō)明
圖1為酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，其中，條帶1-13為不育材料育性基因酶切結(jié)果，條帶A-C為純合基因型可育材料酶切結(jié)果，條帶D、E為雜合基因型可育材料酶切結(jié)果，條帶S為不育對(duì)照酶切結(jié)果，條帶F為可育對(duì)照酶切結(jié)果，Marker為5K。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
1、材料
本實(shí)施例所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知曉的常規(guī)方法，所用的試劑等材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售購(gòu)買(mǎi)產(chǎn)品。
2、方法
2.1提取大豆DNA
以田間雜交得到的雜合可育大豆種植來(lái)的發(fā)生性狀分離的F2代材料作為待測(cè)樣品，以雄性不育系大豆植株的不育肉莢作為不育對(duì)照，取雄性可育系大豆植株的可育豆粒作為可育對(duì)照，利用CTAB法或SDS法提取待測(cè)樣品、不育對(duì)照和可育對(duì)照的DNA。
2.2 PCR擴(kuò)增
設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述特異性擴(kuò)增引物如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2所示：
SEQ ID NO.1：上游引物：ATCATCTCACTCTGCGTGTA
SEQ ID NO.2：下游引物：CCATCCTTTCCCTACCTT
利用TOYOBO公司的KOD FX Neo酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25ul，具/體為：
ddH2O：3.3ul
2×PCR Buffer for KOD FX Neo：13ul
2mM dNTPs:5ul
上游引物F:0.6ul
下游引物R:0.6ul
KOD FX Neo酶:0.5ul
GENE DNA：2ul
PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2min，98℃變性10s，59℃退火30s，68℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，置于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
PCR產(chǎn)物經(jīng)1％質(zhì)量比的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有長(zhǎng)度約為500bp左右的條帶，與預(yù)測(cè)的472bp大小一致，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，送去上海生工測(cè)序，結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。
2.3酶切驗(yàn)證
將PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶BstXI進(jìn)行酶切，酶切體系為20ul，具體為：
PCR產(chǎn)物：17ul
NEB Buffer：2ul
BstXI內(nèi)切酶：1ul
獲得的酶切產(chǎn)物用1％質(zhì)量比的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。
2.4結(jié)果
結(jié)果如圖1所示，圖中，不育對(duì)照(泳道S)的酶切產(chǎn)物僅有一條500bp左右的條帶，而可育對(duì)照(泳道F)的酶切產(chǎn)物包含兩條250bp左右的條帶，泳道1-13為純合不育系植株，泳道A-C為純合可育系植株，泳道D-E為雜合可育植株，與實(shí)際結(jié)果一致。
以上為本發(fā)明一種詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，是以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于上述的實(shí)施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> 一種鑒定大豆雄性不育系的引物及其方法
<130> /
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcatctcac tctgcgtgta 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccatcctttc cctacctt 18