本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
：JAG2基因是NOTCH信號(hào)通路的配體之一，它的主要作用是參與了次級(jí)腭的形成和發(fā)育過程，被認(rèn)為是唇腭裂的候選基因之一。JAG2基因rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)位于該基因的5’端附近，在研究中該位點(diǎn)AG、GG基因型表現(xiàn)出與非綜合征性唇腭裂有顯著性相關(guān)性。作為常見的出生缺陷和顱面發(fā)育缺陷，唇腭裂是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，國際上將其分為綜合征性(syndromiccleftliporpalate，SCLP)和非綜合征性唇腭裂(non-syndromiccleftliporpalate，NSCLP)。全球唇腭裂的發(fā)生率為3-22/10000，而我國的發(fā)生率約為1.82/1000。NSCLP的發(fā)病原因有很多，其中遺傳和環(huán)境的影響占據(jù)了主要作用。研究發(fā)現(xiàn)許多信號(hào)通路參與了唇腭的發(fā)育，不同染色體區(qū)間在唇腭裂發(fā)病中具有一定作用。目前已知的NSCLP易感區(qū)有Iq32，2p，2q，3q27-28，4q，6p23-p25，8q24，9q21，12p11，14q21-24,16q24和19q13，可能的易感基因有IRF6、SATB2、TP63、FQXE1、PVRL1、MSX1、GABRB3，CRISPLD2，MAFB和ABCA4等。高分辨率熔解曲線(highresolutionmelting,HRM)的分析原理是在常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)過程中飽和熒光染枓與雙鏈DNA結(jié)合，當(dāng)通過加熱升溫使DNA雙鏈解離時(shí)，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，由于突變、SNP位點(diǎn)雙鏈堿基間不匹配會(huì)使雙鏈DNA在此位點(diǎn)首先解開，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中的熒光強(qiáng)度，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間軸曲線上便可判斷是否存在突變或SNP，而且不同位點(diǎn)、雜合子與否、GC含量、擴(kuò)增子長度等都會(huì)影響熔解曲線的峰形。所以，HRM分析能夠有效區(qū)分不同突變位點(diǎn)、SNP位點(diǎn)和擁有不同GC含量的擴(kuò)增片段。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種檢測JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒。本發(fā)明的第二個(gè)目的是為了提供一種上述試劑盒的制備方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種檢測JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒，包括：標(biāo)準(zhǔn)品、引物、含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為包含JAG2rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)的野生型DNA序列和包含JAG2rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)的純合突變型DNA序列；所述引物用于擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測樣品。優(yōu)選地，所述野生型DNA序列為序列W；所述純合突變型DNA序列為序列M。優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)品為連接有序列W的質(zhì)粒和連接有序列M的質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述引物為JAG2-F和JAG2-R。優(yōu)選地，所述含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司所產(chǎn)的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix試劑盒。本發(fā)明還提供所述的檢測JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒的制備方法，包括如下步驟：1)引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)JAG2rs741859基因序列，應(yīng)用Primerexpress3軟件、PrimerPremier5軟件以及Oligo7軟件，設(shè)計(jì)一組引物；2)制備標(biāo)準(zhǔn)品A、合成含有JAG2rs741859(c*1053G>A)位點(diǎn)的野生型DNA序列和純合突變型DNA序列；B、將野生型DNA序列和純合突變型DNA序列分別與質(zhì)粒連接；將連接后的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌中；培養(yǎng)細(xì)菌并且獲得陽性克??；C、擴(kuò)大培養(yǎng)步驟B所獲得的陽性克隆，提取質(zhì)粒得到標(biāo)準(zhǔn)品；3)選購或配制含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑。優(yōu)選地，步驟B中所述的質(zhì)粒為pMD18-T質(zhì)粒。優(yōu)選地，所述野生型DNA序列為序列W；所述純合突變型DNA序列為序列M。優(yōu)選地，步驟B中將序列W或序列M分別與pMD18-T質(zhì)粒連接，所采用的連接體系為：SolutionI為來自TaKaRa公司，編號(hào)D6020A的產(chǎn)品。連接的反應(yīng)時(shí)間為10-16小時(shí)，反應(yīng)溫度為16℃。優(yōu)選地，步驟C的具體操作為將陽性克隆接種于含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)14-16h；再從菌體中提取質(zhì)粒獲得標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明所述序列W為：TATATTTGATTGAATAATGCCACCATTCCGGCCTCCCTTGTTCTTTCGGTGCTGTCCCTTTTGTATTGAGAGTGAGGTTGGGGGAGAGCCACGCCGGCAGAGAGGCTTGGGGCAGTGGGGCGCGTGCTGGGTATTGGCCCACGTGGCTGTGGTGGCTGTAGAGGGCGAGACGGTTCTGTTGAGTCGGGGCCTGCCAGGGCCTCGAATGCGTTGGCATGCCAAGGTGGTGG；其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)；本發(fā)明所述序列M為：TATATTTGATTGAATAATGCCACCATTCCGGCCTCCCTTGTTCTTTCGGTGCTGTCCCTTTTGTATTGAGAGTGAGGTTGGGGGAGAGCCACGCCGGCAGAGAGGCTTGGGGCAGTGGGGCACGTGCTGGGTATTGGCCCACGTGGCTGTGGTGGCTGTAGAGGGCGAGACGGTTCTGTTGAGTCGGGGCCTGCCAGGGCCTCGAATGCGTTGGCATGCCAAGGTGGTGG；其中標(biāo)有下劃線的堿基為基因突變位點(diǎn)。本發(fā)明所述的JAG2-F和JAG2-R的序列具體為：JAG2-F：5'-CAGAGAGGCTTGGGGCAGT-3'JAG2-R：5'-AACAGAACCGTCTCGCCCTC-3'相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明制備了一種試劑盒，使HRM方法用于鑒定JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型，該試劑盒具有靈敏度高、成本低、操作簡單、鑒定速度快的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還提供該試劑盒的制備方法，通過控制制備過程的參數(shù)使本發(fā)明的試劑盒靈敏度更高。附圖說明圖1、本發(fā)明試劑盒的靈敏度測試結(jié)果圖圖2、本發(fā)明對(duì)基因型的檢測結(jié)果圖圖3、Sanger測序結(jié)果圖具體實(shí)施方式下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：實(shí)施例1：一種檢測JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859基因型的試劑盒，包括：標(biāo)準(zhǔn)品、引物、含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為連接有序列W的pMD18-T質(zhì)粒和連接有序列M的pMD18-T質(zhì)粒。所述引物為JAG2-F和JAG2-R。所述含有熒光染料的qPCR擴(kuò)增試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司所產(chǎn)的含EvaGreen的Green-2-GoqPCRMastermix試劑盒。實(shí)施例2重組野生型和純合突變型質(zhì)粒pMD18-T-rs741859的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化1、合成序列W和序列M。2、連接反應(yīng)：將上述合成的序列W和序列M分別與pMD18-T進(jìn)行連接，采用如下連接體系進(jìn)行配制：配制完成后置于16℃進(jìn)行過夜連接反應(yīng)，獲的連接有序列W的質(zhì)粒和連接有序列M的質(zhì)粒。3、pMD18-T-rs741859質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化以及PCR鑒定(1)從-80℃的超低溫冰箱中取出凍存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰盒上使其解凍。(2)取連接產(chǎn)物(連接有序列W的質(zhì)粒和連接有序列M的質(zhì)粒)10μL加入50μL的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕搖勻后置冰浴30分鐘。(3)42℃水浴熱激90秒，熱激后立即置冰上冷卻2min。(4)于1.5mlEP管中加入預(yù)冷的1ml的不含抗性的LB液體培養(yǎng)基吹打混勻后，37℃120轉(zhuǎn)輕搖培養(yǎng)90min。(5)將上述培養(yǎng)液短暫離心吸去900ul后取剩余的100ul涂布于含Amp抗生素的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。(6)從平板上挑取單克隆菌落于500μLAmp抗性LB液體培養(yǎng)基的1.5mlEP管中，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)5-6小時(shí)。(7)取1μL作為模板進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌液加入到20ml的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)搖獲的陽性克隆。(8)用引物JAG2-F和JAG2-R擴(kuò)增上述稀釋菌液，PCR產(chǎn)物采用2％瓊脂糖凝膠電泳，通過檢測PCR產(chǎn)物鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。引物序列為HRM分析所用引物，序列如下：JAG2-F：5'-CAGAGAGGCTTGGGGCAGT-3'JAG2-R：5'-AACAGAACCGTCTCGCCCTC-3'PCR體系如下：PCRbuffer為來自北京百泰克生物技術(shù)有限公司的PowerTaqDNA聚合酶，貨號(hào)PR1001。擴(kuò)增程序/反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃30s、60℃30s、72℃30sec，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。4、重組陰性和陽性質(zhì)粒提?。翰捎帽本┌偬┛斯旧a(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒，測定濃度和純度，同時(shí)吸取一部分純化質(zhì)粒送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，確定插入片段的基因序列與目的序列一致。實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)品的獲取和定量(1)取實(shí)施例2得到的凍存的含有重組質(zhì)粒的陽性克隆100ul接種于15ml氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)14-16h；(2)獲的菌體，采用北京百泰克生物科技有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒制備試劑盒提取重組質(zhì)粒；(3)利用北京百泰克生物科技有限公司的超微量紫外可見分光光度計(jì)(ND5000)對(duì)提取的質(zhì)粒測定濃度，根據(jù)A260/A280判斷質(zhì)粒的純度。實(shí)施例4HRM-PCR檢測JAG2rs741859方法的建立和靈敏度檢測一、待測樣本的制備提取30例樣本的血液基因組DNA，用作JAG2基因PCR擴(kuò)增的模板。血液基因組DNA的提取步驟如下：(1)取1ml全血，加入3mlTE，顛倒混勻后靜置10min，8000rpm離心5分鐘，棄上清液；(2)重復(fù)上述步驟2-3次至沉淀為白色；(3)加入900ul10％SDS和10ul10mg/ml蛋白酶K，55℃水浴1h；(4)將離心管冷卻至室溫，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心10min；(5)小心吸取上清后再加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心10min；(6)取上清，加入兩倍體積的無水乙醇，上下顛倒混勻，12000rpm離心10min，棄上清；(7)加500ul70％的乙醇洗滌沉淀，短暫離心后棄上清，開蓋干燥至乙醇完全揮發(fā)；(8)加50ul雙蒸水或TE溶解DNA，-20℃保存。二、特異性引物的設(shè)計(jì)與合成本發(fā)明通過對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中JAG2rs741859基因序列進(jìn)行檢索，選取適合設(shè)計(jì)引物的片段序列為靶目標(biāo)，應(yīng)用Primerexpress3軟件、PrimerPremier5軟件以及Oligo7軟件，設(shè)計(jì)了一組HRM-PCR引物。該引物序列如下：JAG2-F：5'-CAGAGAGGCTTGGGGCAGT-3'JAG2-R：5'-AACAGAACCGTCTCGCCCTC-3'三、HRM-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件以DNA為模板，以上述引物JAG2-F和JAG2-R為擴(kuò)增引物，采用如下述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系：其中引物采用JAG2-F和JAG2-R，HRM-PCR采用生工生物(上海)Green-2-GoqPCRMastermix試劑盒。HRM分析儀為百源基因ASA-9600實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20s。HRM分析：94℃90s60℃30sec83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。四、HRM靈敏度實(shí)驗(yàn)將重組陽性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒均稀釋至50ng/μl，然后二者混合以重組陽性質(zhì)粒占比例依次為50％、25％、12.5％、5％、2％和1％進(jìn)行梯度稀釋，按照上述HRM-PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增，分析突變檢出范圍，即靈敏度。反應(yīng)體系如下：PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性10s；60℃退火/延伸20sHRM分析：94℃90s60℃30sec83-94℃收集數(shù)據(jù)，溫度上升速率為0.06℃/s。結(jié)果參照?qǐng)D1，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)陽性質(zhì)粒與陰性質(zhì)粒體積比分別為1:1、1:3、1:7、1:19、1:49和1:99時(shí)，能檢測出陽性質(zhì)粒，所以本專利所用HRM檢測方法的靈敏度為1％。實(shí)施例5應(yīng)用本發(fā)明的檢測方法檢測樣本JAG2rs741859基因型用步驟2中的檢測條件，對(duì)30例樣本進(jìn)行HRM分析，與重組陽性質(zhì)粒和重組陰性質(zhì)粒的熔解曲線對(duì)照比較，依此確定樣本中的突變類型，并根據(jù)HRM分析結(jié)果針對(duì)每種基因型隨機(jī)挑選1個(gè)樣本在生工生物(上海)進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證。HRM分析結(jié)果參見表1和圖2，數(shù)據(jù)顯示30例樣本中JAG2基因SNP位點(diǎn)rs741859野生型有17例，G>A雜合突變型有8例，G>A純合突變型5例。Sanger測序結(jié)果參見圖3：其中a為樣本編號(hào)7的測序結(jié)果，b為樣本編號(hào)14的測序結(jié)果，c為樣本編號(hào)28的測序結(jié)果；與本發(fā)明方法檢測的結(jié)果完全一致。表1應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)樣本的分析結(jié)果樣本編號(hào)基因型樣本編號(hào)基因型1純合突變型16野生型2野生型17雜合突變型3野生型18野生型4野生型19純合突變型5雜合突變型20野生型6雜合突變型21純合突變型7野生型22野生型8野生型23雜合突變型9雜合突變型24野生型10純合突變型25雜合突變型11野生型26野生型12野生型27野生型13野生型28純合突變型14雜合突變型29雜合突變型15野生型30野生型對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3