本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法，屬于轉(zhuǎn)基因水稻的定量檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

最新數(shù)據(jù)表明，2015年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.81億公頃，比1996年的170萬公頃增長了100倍以上(James,Clive."20th Anniversary(1996 to 2015)of the global commercialization of biotech crops and biotech crop highlights in 2015."ISAAA Brief 51(2015).)。以基因工程為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)已廣泛滲入到農(nóng)業(yè)的各個(gè)領(lǐng)域，逐步改變了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)的研究和生產(chǎn)模式。轉(zhuǎn)基因作物已被快速、持續(xù)地用于商業(yè)化生產(chǎn)。無論在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，轉(zhuǎn)基因作物都對環(huán)境、經(jīng)濟(jì)、能源、衛(wèi)生及社會產(chǎn)生了巨大影響。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及到社會公共安全、安全管理和社會倫理等重要方面，因此轉(zhuǎn)基因作物不僅是各國政府、科研人員和種植農(nóng)民關(guān)注的焦點(diǎn)，也引起了全世界各行各業(yè)的廣泛關(guān)注。為此，各國家和地區(qū)紛紛建立起轉(zhuǎn)基因成分的標(biāo)識制度，在全球各國家和地區(qū)制定的轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識制度中，定量標(biāo)識制度占據(jù)較大比重，其中以歐盟和日韓最具代表性，如歐盟的定量閾值為0.9％(EURL-GMFF.Definition of Minimum Performance Requirements for Analytical Methods of GMO Testing European Network of GMO Laboratories(ENGL),European Commission,(2003a)Commission Regulation(EC)No.1829/2003 of September 22,2003,Concerning on genetically modified food and feed.Off.J.Eur.Commun L268:1–23；European Commission,(2003b)Commission Regulation(EC)No.1830/2003 of September 22,2003,Concerning the traceability and labelling of genetically modified organisms and the traceability of food and feed products produced from genetically modified organisms and amending Directive 2001/18/EC.Off.J.Eur.Commun L268:24–28.)；日本和韓國分別為：5％和3％(Matsuoka T(2001)GMO labeling and detection methods in Japan.APEC-JIRCAS Joint Symposium and Workshop on Agricultural Biotechnology；Ministry of Agriculture and Forestry(2000)Guidelines for Labeling of Genetically Modified Agricultural Products.MAF Notification No.31.)。中國在轉(zhuǎn)基因成分標(biāo)識方面主要采取定性標(biāo)識制度，由于定性標(biāo)識制度與定量標(biāo)識制度在檢測技術(shù)等方面存在不同，使中國在作物進(jìn)出口方面容易受到國際標(biāo)準(zhǔn)的制約，因此需要大力發(fā)展轉(zhuǎn)基因成分定量檢測技術(shù)并建立相關(guān)的定量標(biāo)識制度。

數(shù)字PCR(Digital PCR)的概念于1992年提出(Sykes,P.J.,et al."Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution."BioTechniques13.3(1992):444-9.)，其基本原理是通過將微量樣品進(jìn)行大倍的稀釋和分液，直至每個(gè)擴(kuò)增區(qū)域含有目標(biāo)擴(kuò)增分子為0、1或1個(gè)以上，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增信號的有無，利用泊松分布(Poisson distribution)(Pinheiro,Leonardo B.,et al."Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification."Analytical chemistry 84.2(2011):1003-1011.)計(jì)算出樣本的最初拷貝數(shù)或濃度。數(shù)字PCR不依賴擴(kuò)增效率以及基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量，而且對一些PCR抑制因子的耐受性更高。該技術(shù)在基因拷貝數(shù)分析、基因表達(dá)分析、基因分型等方面都取得了突破性的發(fā)展。在轉(zhuǎn)基因檢測方面，也有相應(yīng)的研究報(bào)道(Demeke,Tigst,et al."Assessment of droplet digital PCR for absolute quantification of genetically engineered OXY235 canola and DP305423 soybean samples."Food Control 46(2014):470-474；Morisset,Dany,et al."Quantitative analysis of food and feed samples with droplet digital PCR."PLoS One 8.5(2013):e62583.)，表明數(shù)字PCR在轉(zhuǎn)基因檢測方面的可行性與可靠性。然而目前這些研究多基于2重?cái)?shù)字PCR檢測，一次只能對一個(gè)轉(zhuǎn)基因作物的一個(gè)轉(zhuǎn)化事件進(jìn)行定量分析，而目前定量標(biāo)識的要求是針對單一成分而不是單一轉(zhuǎn)化事件的定量，如歐盟對定量標(biāo)識的定義為：食品中含有轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的材料，其比例不得高于單一成分的食品成分的0.9％。因此，目前的數(shù)字PCR檢測方法不適合對樣品中單一成分的多種轉(zhuǎn)化事件的同時(shí)定量檢測。目前，中國研發(fā)的轉(zhuǎn)基因水稻主要有KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1、G6H1這7個(gè)品系，因此開發(fā)一種同時(shí)檢測這7種轉(zhuǎn)基因水稻含量多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法，對于水稻轉(zhuǎn)基因成分的定量檢測將具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供用于檢測7種轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是建立一種轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開了用于檢測轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針，其中包括：

由核苷酸序列為SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF2轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻KF2轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.3所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.4所示上游引物和SEQ ID No.5所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF6轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻KF6轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.6所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF8轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻KF8轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.9所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.10所示上游引物和SEQ ID No.11所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KMD1轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻KMD1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.12所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻M12轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻M12轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.15所示；

由核苷酸序列為SEQ ID No.16所示上游引物和SEQ ID No.17所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.18所示；以及，

由核苷酸序列為SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻G6H1轉(zhuǎn)化體特異性引物對；轉(zhuǎn)基因水稻G6H1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.21所示。

本發(fā)明所述的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針能夠應(yīng)用于檢測轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1中的任意一種或多種。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待檢測水稻樣品的DNA；(2)以提取的DNA為模板，以本發(fā)明所述的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針，以及水稻內(nèi)參基因檢測引物對和探針建立數(shù)字PCR體系并進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)之比，獲得轉(zhuǎn)基因成分的定量值；即，利用QuantaSoft分析各反應(yīng)孔中外源基因和內(nèi)參基因的熒光信號值，通過泊松分布公式計(jì)算出各反應(yīng)中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)，外源基因拷貝數(shù)記為：Ne，內(nèi)參基因拷貝數(shù)記為：Ni，通過兩者的拷貝數(shù)之比得到轉(zhuǎn)基因成分的定量值，即：轉(zhuǎn)基因成分含量＝Ne/Ni×100％。

本發(fā)明多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法中，所述數(shù)字PCR體系為：反應(yīng)體系的總體積為20μL，其中，2xddPCR Supermix for probe 10μL，7種轉(zhuǎn)基因水稻的特異性檢測引物對和探針以及水稻內(nèi)參基因檢測引物對和探針組成的引物與探針的混合物6μL，DNA模板4μL。其中，所述引物與探針的混合物中，水稻內(nèi)參基因檢測引物對的上、下游引物濃度分別為3000nmol/L，水稻內(nèi)參基因探針的濃度為600nmol/L；7種轉(zhuǎn)基因水稻的特異性檢測引物對的各上、下游引物濃度分別為1500nmol/L；7種轉(zhuǎn)基因水稻的特異性探針的濃度分別為300nmol/L。所述PCR擴(kuò)增的程序包括：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，60℃退火及延伸60sec，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃保存。

本發(fā)明多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法，選用水稻蔗糖磷酸酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)基因作為水稻內(nèi)參基因，所述水稻內(nèi)參基因檢測引物對由核苷酸序列為SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物組成；所述水稻內(nèi)參基因探針的核苷酸序列為SEQ ID No.24所示，探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。本發(fā)明7種轉(zhuǎn)基因水稻的特異性探針的5’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’端分別標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。

本發(fā)明方法可以根據(jù)實(shí)際需要增減相應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻事件，靈活性強(qiáng)，同時(shí)操作簡便，是一種轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的有效方法。

本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測試劑盒，包括：2xddPCR Supermix for probe、水稻內(nèi)參基因檢測引物對和探針、轉(zhuǎn)基因水稻的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針；其中，所述轉(zhuǎn)基因水稻的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針為本發(fā)明所述的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測引物對和探針，所述探針的5’端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’端分別標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1；所述水稻內(nèi)參基因檢測引物對由核苷酸序列為SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物組成；所述水稻內(nèi)參基因探針的核苷酸序列為SEQ ID No.24所示，探針的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。

本發(fā)明分別利用其它轉(zhuǎn)基因作物及非轉(zhuǎn)基因作物驗(yàn)證所建立的多重?cái)?shù)字PCR方法的特異性，結(jié)果表明所有其它轉(zhuǎn)基因作物及非轉(zhuǎn)基因作物的假陽性率都低于5％，表明本發(fā)明建立的多重?cái)?shù)字PCR方法的特異性較好，滿足對轉(zhuǎn)基因水稻的定量檢測需要。

定量限和檢測限的確定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻含量在5％-0.05％之間時(shí)，多重?cái)?shù)字PCR定量的值與理論值之間的RSD都小于25％，滿足定量檢測的要求(EURL-GMFF)，同時(shí)也表明本發(fā)明建立的多重?cái)?shù)字PCR的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量為0.01％時(shí)，多重?cái)?shù)字PCR定量的值與理論值之間的RSD為39.25％。因此，根據(jù)以上數(shù)據(jù)確定本發(fā)明方法的定量限為0.05％，檢測限為0.01％，滿足轉(zhuǎn)基因成分實(shí)際檢測的需要。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明建立了一種針對7種轉(zhuǎn)基因水稻(KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1、G6H1)的多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法，實(shí)現(xiàn)對同時(shí)含有以上7種或其中幾種轉(zhuǎn)基因水稻的樣品進(jìn)行定量檢測，省去了對單一轉(zhuǎn)基因水稻成分的分別定量檢測，同時(shí)也省去了常規(guī)PCR方法定量檢測中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制等步驟。另外，轉(zhuǎn)基因成分是通過外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)的比例計(jì)算而得到的，在本發(fā)明方法中7個(gè)外源基因與1個(gè)內(nèi)參基因擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)體系中，從而提高了對轉(zhuǎn)基因成分定量檢測的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1轉(zhuǎn)基因水稻多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法的建立

1、材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)基因材料分別為：KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1、G6H1(轉(zhuǎn)基因水稻)；GTS40-3-2(轉(zhuǎn)基因大豆)；MON15985(轉(zhuǎn)基因棉花)；Oxy235(轉(zhuǎn)基因油菜)；MON863、MON89034(轉(zhuǎn)基因玉米)。非轉(zhuǎn)基因水稻、大豆、玉米、棉花、油菜DNA作為陰性質(zhì)控。

1.2 DNA提取

稱取200mg粉狀樣品按照試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit,Qiagen,Hilden,Germany)說明提取DNA。在分光光度計(jì)260-280nm處測定所獲DNA質(zhì)量和純度，并用瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性。將提取的7種轉(zhuǎn)基因水稻DNA等體積混合，再用非轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA將其稀釋到以下相應(yīng)的濃度：5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％。

1.3引物與探針及其配制

選用水稻蔗糖磷酸酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)基因作為水稻內(nèi)參基因，其探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)HEX，3’端標(biāo)記BHQ1，7種轉(zhuǎn)基因水稻的轉(zhuǎn)化事件的特異性序列的探針5’端都標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記BHQ1，將8組引物探針混合在一起，相應(yīng)的引物名稱序列及各引物探針在混合物中的濃度見表1。

表1多重?cái)?shù)字PCR引物與探針信息

1.4數(shù)字PCR擴(kuò)增與數(shù)據(jù)分析

數(shù)字PCR體系：10μL 2xddPCR Supermix for probe，6μL引物與探針的混合物，4μL DNA模板或ddH₂O，總體積為20μL。

將樣品(20μL)反應(yīng)體系用實(shí)驗(yàn)室通用移液器加入到DG8 cartridge中間一排的8個(gè)孔，在DG8 cartridge最底一排8個(gè)孔中各加入70μL微滴發(fā)生油，儀器自動(dòng)完成微滴生成。將生成的微滴轉(zhuǎn)移到96孔板中，封上熱封膜，放置常規(guī)PCR儀中進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec，60℃退火及延伸60sec，共40個(gè)循環(huán)；98℃10min，4℃保存。將完成PCR的96孔板放入微滴讀取儀中，儀器自動(dòng)完成每一個(gè)樣本的微滴讀取，要求每孔微滴生成數(shù)大于8000個(gè)才納入統(tǒng)計(jì)分析，含有擴(kuò)增信號的陽性微滴與未擴(kuò)增的陰性微滴用熒光閾值來區(qū)分，利用QuantaSoft分析各反應(yīng)孔中外源基因和內(nèi)參基因的熒光信號值，通過泊松分布公式計(jì)算出各反應(yīng)中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)(見圖1)，外源基因拷貝數(shù)記為：Ne，內(nèi)參基因拷貝數(shù)記為：Ni，通過兩者的拷貝數(shù)之比得到轉(zhuǎn)基因成分的定量值，即：轉(zhuǎn)基因成分含量＝Ne/Ni×100％。

2、結(jié)果與分析

2.1特異性驗(yàn)證

數(shù)字PCR的特異性一般用假陽性率(false positive rate)來評價(jià)，目前認(rèn)為假陽性率低于5％則表明建立的數(shù)字PCR的特異性較好，滿足檢測的需要(Holst-Jensen,A.；Crespo,T.；Simplicio,A.；Richl,P.；Welsche,M.；Dobnik,D.；Dreo,T.Deliverable 6.1 MPP Decathlon,http://www.decathlon-project.eu/sites/default/files/Deliverable6.1_MPP_Decathlon.pdf.)。在本發(fā)明方法中，分別利用其它轉(zhuǎn)基因作物及非轉(zhuǎn)基因作物驗(yàn)證建立的多重?cái)?shù)字PCR的特異性，驗(yàn)證結(jié)果見表2。結(jié)果表明，所有其它轉(zhuǎn)基因作物及非轉(zhuǎn)基因作物的假陽性率都低于5％，表明本發(fā)明建立的多重?cái)?shù)字PCR方法的特異性較好，滿足對轉(zhuǎn)基因水稻的定量檢測需要。

表2多重?cái)?shù)字PCR假陽性率檢測

2.2多重?cái)?shù)字PCR的定量限和檢測限的確定

為了確定建立的多重?cái)?shù)字PCR的定量限和檢測限，分別測定轉(zhuǎn)基因含量為5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％樣本的含量，分析定量結(jié)果與理論值之間的差異，每個(gè)樣品重復(fù)4次，每次設(shè)置4個(gè)平行，共16個(gè)反應(yīng)。

結(jié)果見表3，轉(zhuǎn)基因水稻含量在5％-0.05％之間時(shí)，多重?cái)?shù)字PCR定量的值與理論值之間的RSD都小于25％，滿足定量檢測的要求(EURL-GMFF)，同時(shí)也表明建立的多重?cái)?shù)字PCR的重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。當(dāng)轉(zhuǎn)基因含量為0.01％時(shí)，多重?cái)?shù)字PCR定量的值與理論值之間的RSD為39.25％。因此根據(jù)以上數(shù)據(jù)，將本發(fā)明方法的定量限定為0.05％，檢測限為0.01％。

表3多重?cái)?shù)字PCR檢測限與定量限確定

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 轉(zhuǎn)基因水稻多重?cái)?shù)字PCR定量檢測方法

<130> ZJ-2001-170102A

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

gctcgtctgg ctaagatcg 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

gcacggacta tacaagttgt gat 23

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

cagcgatcgc atccttaggt caaagcggtt 30

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

gcttggatca gattgtcgtt t 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 5

gtcagataaa ctgattggtc tgat 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 6

cgacaaaaga tcaggatttg gg 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 7

agtttcttaa gattgaatgg ttgcc 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 8

cgaccatgat gctgttctgc 20

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 9

cgttatttat gagatgggtg atctcaccca tgcttg 36

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 10

tggtgagcgt tttgcagtct 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 11

ctgatccact agcaggaggt cc 22

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 12

tgttgtgctg ccaatgtggc ctg 23

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 13

caagtccttc cagtattttg ca 22

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 14

taccgcatca ggcgct 16

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 15

ctgatctcta gtgctccagc gagtc 25

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 16

agagactggt gatttcagcg gg 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 17

gcgtccagaa ggaaaaggaa ta 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 18

atctgcccca gcactcgtcc g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 19

aagcgtcaat ttgtttacac c 21

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 20

tcgatctgct gcagcttg 18

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 21

atggatgtat cgccaccagc acc 23

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 22

ttgcgcctga acggatat 18

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 23

cggttgatct tttcgggatg 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 24

tccgagccgt ccgtgcgtc 19