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轉(zhuǎn)基因水稻多重數(shù)字PCR定量檢測方法與流程

文檔序號:12697749閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.用于檢測轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針,其特征在于,包括:

由核苷酸序列為SEQ ID No.1所示上游引物和SEQ ID No.2所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF2轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻KF2轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.3所示;

由核苷酸序列為SEQ ID No.4所示上游引物和SEQ ID No.5所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF6轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻KF6轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.6所示;

由核苷酸序列為SEQ ID No.7所示上游引物和SEQ ID No.8所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KF8轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻KF8轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.9所示;

由核苷酸序列為SEQ ID No.10所示上游引物和SEQ ID No.11所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻KMD1轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻KMD1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.12所示;

由核苷酸序列為SEQ ID No.13所示上游引物和SEQ ID No.14所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻M12轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻M12轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.15所示;

由核苷酸序列為SEQ ID No.16所示上游引物和SEQ ID No.17所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.18所示;以及,

由核苷酸序列為SEQ ID No.19所示上游引物和SEQ ID No.20所示下游引物組成的轉(zhuǎn)基因水稻G6H1轉(zhuǎn)化體特異性引物對;轉(zhuǎn)基因水稻G6H1轉(zhuǎn)化體特異性探針的核苷酸序列為SEQ ID No.21所示。

2.權(quán)利要求1所述的多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針在檢測轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1或G6H1中的任意一種或多種中的應(yīng)用。

3.一種轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重數(shù)字PCR定量檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)提取待檢測水稻樣品的DNA;(2)以提取的DNA為模板,以權(quán)利要求1所述的多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針,以及水稻內(nèi)參基因檢測引物對和探針建立數(shù)字PCR體系并進行PCR擴增;(3)對擴增結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析,計算外源基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)之比,獲得轉(zhuǎn)基因成分的定量值。

4.按照權(quán)利要求3所述的多重數(shù)字PCR定量檢測方法,其特征在于,所述數(shù)字PCR體系為:反應(yīng)體系的總體積為20μL,其中,2xddPCR Supermix for probe 10μL,權(quán)利要求1所述多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針以及水稻內(nèi)參基因檢測引物對和探針組成的引物與探針的混合物6μL,DNA模板4μL。

5.按照權(quán)利要求3所述的多重數(shù)字PCR定量檢測方法,其特征在于,所述水稻內(nèi)參基因為水稻蔗糖磷酸酶基因;所述水稻內(nèi)參基因檢測引物對由核苷酸序列為SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物組成;

所述水稻內(nèi)參基因探針的核苷酸序列為SEQ ID No.24所示。

6.按照權(quán)利要求4所述的多重數(shù)字PCR定量檢測方法,其特征在于:所述引物與探針的混合物中,水稻內(nèi)參基因檢測引物對的上、下游引物濃度分別為3000nmol/L,水稻內(nèi)參基因探針的濃度為600nmol/L;

權(quán)利要求1所述多重數(shù)字PCR定量檢測引物對的上、下游引物濃度分別為1500nmol/L;權(quán)利要求1所述探針的濃度分別為300nmol/L。

7.按照權(quán)利要求3所述的多重數(shù)字PCR定量檢測方法,其特征在于,所述PCR擴增的程序包括:95℃預變性5min;95℃變性30sec, 60℃退火及延伸60sec,共40個循環(huán);98℃ 10min。

8.按照權(quán)利要求3所述的多重數(shù)字PCR定量檢測方法,其特征在于,所述水稻內(nèi)參基因探針的5’端標記熒光基團HEX,3’端標記熒光淬滅基團BHQ1;

權(quán)利要求1所述探針的5’端分別標記熒光基團FAM,3’端分別標記熒光淬滅基團BHQ1。

9.一種轉(zhuǎn)基因水稻KF2、KF6、KF8、KMD1、M12、TT51-1和G6H1的多重數(shù)字PCR定量檢測試劑盒,包括:2xddPCR Supermix for probe、水稻內(nèi)參基因檢測引物對和探針、轉(zhuǎn)基因水稻的多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針;其特征在于,所述轉(zhuǎn)基因水稻的多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針為權(quán)利要求1所述的多重數(shù)字PCR定量檢測引物對和探針;在探針的5’端分別標記熒光基團FAM,3’端分別標記熒光淬滅基團BHQ1。

10.按照權(quán)利要求9所述的多重數(shù)字PCR定量檢測試劑盒,其特征在于,所述水稻內(nèi)參基因檢測引物對由核苷酸序列為SEQ ID No.22所示上游引物和SEQ ID No.23所示下游引物組成;所述水稻內(nèi)參基因探針的核苷酸序列為SEQ ID No.24所示,探針的5’端標記熒光基團HEX,3’端標記熒光淬滅基團BHQ1。

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