本發(fā)明涉及生物化學領(lǐng)域，具體涉及包含核酸、酶或微生物的測定或檢驗方法，特別是涉及寨卡病毒的檢測方法。

背景技術(shù)：

寨卡病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒，其主要的傳播媒介是埃及伊蚊和白紋伊蚊。1947年首次在烏干達從恒河猴體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)寨卡病毒，1952年在烏干達和坦桑尼亞的人體中分離到。2007年以前，世界僅報告14例ZIKV病散發(fā)病例，2007年首次在太平洋島國密克羅尼西亞的雅普島發(fā)現(xiàn)寨卡病毒暴發(fā)疫情之后，出現(xiàn)ZIKV感染病例和暴發(fā)疫情的國家及地區(qū)增加明顯，已經(jīng)在非洲、東南亞和美洲等地造成多次暴發(fā)流行。2015年5月，巴西報告首例寨卡病毒感染病例；當年10月份，巴西報告新生兒小頭畸形數(shù)量處于明顯上升，時空分布與寨卡病毒流行區(qū)相吻合。截至2016年1月2日，巴西衛(wèi)生部官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，巴西因寨卡病毒所致的疑似新生兒小頭畸形病例已達3174例，其中已有38例死亡，2月初該數(shù)字已達4783例。研究表明，除了引起小頭畸形以外，寨卡病毒感染還和格林-巴利綜合征有也有著密切的聯(lián)系。疫情的快速蔓延以及與小頭畸形之間的可能因果關(guān)系，引起了國際社會的廣泛關(guān)注。

寨卡病毒全基因長度約為11Kb，直徑40～70nm，有包膜，包含10794個核苷酸，編碼3419個氨基酸，寨卡病毒基因編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白(C)、膜前體蛋白(prM)和包膜蛋白(M)，以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。目前，國內(nèi)外對寨卡病毒的診斷方法，主要還是依靠病毒培養(yǎng)、血清學試驗、常規(guī)的RT-PCR檢測及實時熒光定量PCR，其中，血清學試驗、組織培養(yǎng)具有靈敏度低、免疫交叉反應(yīng)以及周期長等缺點；而RT-PCR也存在容易污染、耗時長的不足，實時熒光PCR技術(shù)因為其儀器設(shè)備昂貴，不利于一般檢測機構(gòu)的檢測及大樣本量檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種寨卡病毒的可視化檢測方法，該方法具有準確、快速和直觀的優(yōu)點。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下：

一種寨卡病毒的可視化檢測方法，該方法包括以下步驟：

(1)取寨卡病毒，按北京全式金生物科技有限公司生產(chǎn)的Easy Pure Viral DNA/RNA Kit的說明書提取寨卡病毒核酸；

(2)以步驟(1)得到的寨卡病毒核酸為模板，采用環(huán)介導恒溫擴增方法(LAMP)擴增寨卡病毒NS5基因的RNA片段，獲得核酸擴增產(chǎn)物；所述的環(huán)介導恒溫擴增方法的引物由一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物組成，其中，

所述的一對外引物為：

Zika-F3：5’-TGGGATGTGGTGACTGGA-3’(SEQ NO.1)；

Zika-B3：5’-TGCATTGCTACGAACCTTGT-3’(SEQ NO.2)；

所述的一對內(nèi)側(cè)引物為：

Zika-BIP：5’-GTCTGGCACCCTAGTGTCCACTCACAGGAATAGCCATGACCG-3’(SEQ NO.3)；

Zika-FIP：5’-AGGCACTCGTCAGGTTATGAGCTACAGACTCGTGGCCGTT-3’(SEQ NO.4)；

所述的一對環(huán)引物為：

Zika-LF：5’-TGACCATACGGTGTGGTGT-3’(SEQ NO.5)；

Zika-LB：5’-ATGGTCTCTTCCTGGTTGTGG-3’(SEQ NO.5)；

上述環(huán)引物Zika-LB5’端標記生物素(Biotin)，環(huán)引物Zika-LF5’端標記6-羧基熒光素(6-FAM)；

(3)將核酸層析試紙垂直插入所述的核酸擴增產(chǎn)物中，層析5-10min，然后按以下方法判讀結(jié)果：陽性(+)：核酸層析試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)分別出現(xiàn)一條紅色條帶；陰性(-)：核酸層析試紙條的質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，而檢測區(qū)則沒有條帶；無效：核酸層析試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)均未出現(xiàn)條帶；其中，

所述的核酸層析試紙條包括條狀的塑料支撐片，該塑料支撐片的一表面自一頭至另一頭依次設(shè)有樣品墊、聚酯纖維素膜、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述聚酯纖維素膜上噴涂有一層由氯金酸制成的膠體金顆粒上制得的鏈霉親和素包被的AuNPs金納米粒子；所述硝酸纖維素膜上分布有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其中檢測區(qū)是在硝酸纖維素膜上噴涂生物素親和蛋白形成，質(zhì)控區(qū)是在硝酸纖維素膜上噴涂6-羧基熒光素抗體形成。

上述方案中，所述的環(huán)介導恒溫擴增方法的反應(yīng)體系為：12.5μL2×反應(yīng)緩沖液(RM)，1μL酶溶液(EM)，濃度為10μM的一對外引物各0.5μL、濃度為10μM的一對內(nèi)引物各4μL，濃度為10μM的一對環(huán)引物各2μL，RNA模板1μL；所述的環(huán)介導恒溫擴增方法的反應(yīng)條件為：65℃溫育60min，85℃溫育5min。

本發(fā)明所述的方法將環(huán)介導恒溫擴增技術(shù)與核酸層析試紙條聯(lián)合使用，因此具有特異性好，靈敏度高，快速高效，無污染，能準確、快速檢測寨卡病毒的優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于寨卡感染以及混合感染寨卡病毒的早期鑒別診斷、疫情防控、檢驗檢疫等多個領(lǐng)域，尤其是寨卡病毒流行爆發(fā)期大樣本量的檢測。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在濁度儀引物考察結(jié)果示意圖。

圖2是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物引物考察結(jié)果可視化示意圖。

圖3是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在濁度儀溫度考察結(jié)果示意圖。

圖4是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物溫度考察結(jié)果可視化示意圖。

圖5是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP檢測特異性試驗示意圖。

圖6是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP檢測特異性試驗結(jié)果可視化示意圖。

圖7是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP檢測靈敏度示意圖。

圖8是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒LAMP檢測靈敏度結(jié)果可視化示意圖。

圖9是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒One-StepRT-PCR特異性和靈敏度電泳圖。

圖10是本發(fā)明實施例提供的寨卡病毒臨床樣品血清的檢測結(jié)果可視化圖。

圖11和12是本發(fā)明所述核酸層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，其中圖11為主視圖，圖12為俯視圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合寨卡病毒實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。

本發(fā)明建立寨卡病毒環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法，針對寨卡病毒NS5基因序列設(shè)計并合成特異性LAMP引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，分析其靈敏度和特異性，結(jié)果表明所建立的寨卡病毒快速檢測檢測方法，對登革病毒4種血清型流感病毒H1N1無檢出，可檢出稀釋至10^-6(濃度為120fg/μl)的RNA，特異性、靈敏度及穩(wěn)定性良好。此方法簡單、快速，恒溫水浴鍋65℃反應(yīng)60min即可完成。反應(yīng)時，加入的環(huán)引物為熒光標記引物，產(chǎn)物進行濁度法檢測和橫向流核酸層析試紙條檢測，比較兩者檢測結(jié)果，驗證橫向流核酸層析試紙條檢測的準確、特異、靈敏性能。

下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進一步描述。

如圖1所示，本發(fā)明實施例的快速檢測寨卡病毒的方法包括以下步驟：

(1)獲取寨卡病毒(武漢大學病毒研究所提供)、4種血清型登革病毒(廣東省疾病預防控制中心提供)，將病毒原液接種到長滿C6/36細胞的培養(yǎng)瓶中，待細胞病變率達到90％時，收集培養(yǎng)液上清，1500r離心15min，將上清分裝，-80℃保存，待用；H1N1流感病毒(廣東省疾病預防控制中心提供)，用A549細胞培養(yǎng)。

(2)按照EasyPureViralDNA/RNAKit(Lot#K200633；北京全式金生物科技有限公司)提取寨卡病毒核酸；

(3)設(shè)計引物：通過查閱文獻和BLAST軟件分析篩選出寨卡病毒NS5基因的保守特異性區(qū)段，采用PrimerExplorerV4，針對區(qū)段設(shè)計LAMP引物，分別是Zika-F3(SEQ NO.1)和Zika-B3(SEQ NO.2)、Zika-FIP(SEQ NO.3)和Zika-BIP(SEQ NO.4)、Zika-LB(SEQ NO.5)和Zika-LF(SEQ NO.6)，進行引物稀釋，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

(4)標記引物：在環(huán)引物Zika-LB5’端標記生物素(Biotin)，環(huán)引物Zika-LF5’端標記6-羧基熒光素(6-FAM)，并確保兩種標記物可同時整合到雙鏈的擴增產(chǎn)物上；

反應(yīng)體系：LAMP反應(yīng)體系為26.5μL：12.5μL2×反應(yīng)緩沖液(RM)，1μL酶溶液(EM)，濃度為10μM的外引物F3、B3各0.5μL、濃度為10μM的內(nèi)引物FIP、BIP各4μL，濃度為10μM的環(huán)引物LB、LF各2μL，RNA模板1μL；

(5)反應(yīng)條件：61～65℃溫育60min，85℃溫育5min；

(6)設(shè)計橫向流核酸層析試紙條：參見圖11和12，核酸層析試紙條(簡稱試紙條)包括條狀的塑料支撐片7，該塑料支撐片7的上表面自一頭至另一頭依次設(shè)有樣品墊1、聚酯纖維素膜2、硝酸纖維素膜3和吸水墊4，其中，所述聚酯纖維素膜上噴涂有一層由氯金酸制成的膠體金顆粒上制得的鏈霉親和素包被的AuNPs金納米粒子，其顆粒大小為18～20nm，呈深紅色。所述硝酸纖維素膜3上分布有條狀的檢測區(qū)5和質(zhì)控區(qū)6，其中檢測區(qū)5是在硝酸纖維素膜3上噴涂生物素親和蛋白形成，質(zhì)控區(qū)6是在硝酸纖維素膜3上噴涂6-羧基熒光素抗體形成。

(7)產(chǎn)物檢測：將裝有LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的PCR管放入一次性核酸反應(yīng)檢測裝置(內(nèi)置有上述核酸層析試紙條，委托杭州優(yōu)思達生物科技有限公司定制)中，將裝置豎立在水平操作臺上，15-30min內(nèi)判讀結(jié)果。按照一次性核酸反應(yīng)檢測裝置說明書，陽性(+)：試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)6，一條位于檢測區(qū)5。陽性結(jié)果表明樣本中含有待檢測的核酸片段，且其數(shù)量達到或高于試紙條的最低檢出量。陰性(-)：試紙條質(zhì)控區(qū)6出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)5沒有條帶。陰性結(jié)果表明樣本中不含目的核酸，或其數(shù)量低于試紙條的最低檢出量。無效：試紙條質(zhì)控區(qū)6和檢測區(qū)5均未出現(xiàn)條帶，提示所用的試紙條和擴增試劑可能已損壞、失效或者操作有誤(參見圖11和12)。

下面結(jié)合試驗對本發(fā)明的應(yīng)用效果作進一步的說明。

1.1儀器和試劑

臺式H1850高速冷凍離心機，購自湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；LA-500Loopamp實時濁度檢測系統(tǒng)，租自北京藍譜生物科技有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，購自鞏義市予華儀器有限責任公司；

核糖核酸擴增試劑盒(逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增法)(批號：57005)，購自榮研生物科技(中國)有限公司；一次性核酸檢測裝置內(nèi)置有上述核酸層析試紙條，委托杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司定制(批號：20160801-31)。

1.2細胞與病毒及臨床血清樣本

寨卡病毒(武漢大學病毒研究所提供)，H1N1病毒和4種血清型登革病毒(DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4)(由廣東省疾病預防控制中心提供)，臨床血清樣本由廣東省疾病預防控制中心，共11份，均為寨卡病毒感染患者血清

1.3引物的設(shè)計與合成

LAMP技術(shù)穩(wěn)定性的關(guān)鍵在于3對特異性引物，根據(jù)LAMP引物設(shè)計原理，本試驗采用PrimerExplorerV4(http://primerexplorer.jp/e/)在線軟件，針對寨卡病毒NS5基因序列設(shè)計和篩選3對LAMP引物，分別是外引物ZIka-F3(SEQ NO.1)和Zika-B3(SEQ NO.2)、內(nèi)引物Zika-FIP(SEQ NO.3)和Zika-BIP(SEQ NO.4)、環(huán)引物Zika-LF(SEQ NO.5)、Zika-LB(SEQ NO.6)，引物由華大基因科技有限公司合成，按合成說明書進行引物稀釋，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

LAMP反應(yīng)在26.5μL體系中進行，反應(yīng)條件優(yōu)化如下：引物考察，寨卡病毒LAMP反應(yīng)產(chǎn)物溫度優(yōu)化，在為60℃～65℃進行溫度優(yōu)化，在多次反復試驗后確定最佳反應(yīng)條件。同時使用濁度儀和橫向流層試紙條進行檢測。

1.5LAMP靈敏度檢測

將提取到的寨卡病毒RNA原液，依次進行10倍梯度稀釋，設(shè)置8個梯度，備用，探索檢測靈敏度。用如上所述優(yōu)化后的LAMP檢測方法，分別對終濃度為10⁰～10^-8的RNA進行試驗，同時使用濁度儀和橫向流層試紙條進行檢測，探索檢測方法的檢測限。

1.6LAMP特異性試驗

H1N1流感病毒、登革病毒4種血清型無擴增結(jié)果顯示，表明該方法對寨卡病毒具有很好的特異性。用建立的LAMP擴增寨卡病毒核酸，同時使用濁度儀和橫向流層試紙條進行檢測，以此評估該方法的特異性。

1.7One-StepRT-PCR檢測

采用RT-PCR一步法試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：外引物F3、B3(10μM)各0.4μL，10μL2xOne-StepReactionMix，0.4μLOne-StepEnzymeMix，1μLRNA模板，補足RNase-freeWater至20μL.。反應(yīng)條件為：45℃，30min；94℃，5min；94℃，30s；56℃，30s；72℃，1min，共40循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后，取1μL反應(yīng)液，置2％瓊脂糖凝膠的點樣孔中，電壓120V，電泳35min。

1.8寨卡病毒血清臨床樣本檢測

針對11個寨卡病毒感染的病人的血清提取核酸，進行可視化檢測驗證。

1.9LAMP產(chǎn)物檢測

將LAMP反應(yīng)管中置于濁度儀里反應(yīng)，陽性反應(yīng)有擴增曲線出現(xiàn)，反之陰性反應(yīng)不會出現(xiàn)，引物設(shè)計最優(yōu)者，溫度最佳者，曲線達峰時間最短。將反應(yīng)產(chǎn)物置于一次性核酸反應(yīng)裝置里反應(yīng)，陽性(+)：試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)6，一條位于檢測區(qū)5。陽性結(jié)果表明樣本中含有待檢測的核酸片段，且其數(shù)量達到或高于試紙條的最低檢出量。陰性(-)：試紙條質(zhì)控區(qū)6出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)5沒有條帶。陰性結(jié)果表明樣本中不含目的核酸，或其數(shù)量低于試紙條的最低檢出量。無效：試紙條質(zhì)控區(qū)6和檢測區(qū)5均未出現(xiàn)條帶(參見圖11和12)。

2.0LAMP反應(yīng)條件的確立

經(jīng)過多次反應(yīng)條件的優(yōu)化，確立LAMP最佳反應(yīng)體系總量為26.5μL：濃度為10μM的外引物Zika-F3(SEQ NO.1)、Zika-B3(SEQ NO.2)各0.5μL、濃度為10μM的內(nèi)引物Zika-FIP(SEQ NO.3)、Zika-BIP(SEQ NO.4)各4μL，濃度為10μM的環(huán)引物Zika-LB(SEQ NO.5)、Zika-LF(SEQ NO.6)各0.5μL，RNA模板1μL；65℃溫育60min，85℃溫育5min；將LAMP反應(yīng)管中放入濁度儀里反應(yīng)，陽性反應(yīng)有擴增曲線出現(xiàn)，反之陰性反應(yīng)不會出現(xiàn)。證實構(gòu)建的LAMP方法的成功性(見圖1，圖2，圖3，圖4)。

2.1寨卡病毒LAMP可視化檢測

進行寨卡病毒LAMP可視化檢測。取出反應(yīng)管，在一次性核酸反應(yīng)裝置里反應(yīng)，陽性(+)：試紙條出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于質(zhì)控區(qū)6，一條位于檢測區(qū)5。陽性結(jié)果表明樣本中含有待檢測的核酸片段，且其數(shù)量達到或高于試紙條的最低檢出量。陰性(-)：試紙條質(zhì)控區(qū)6出現(xiàn)一條紅色條帶，檢測區(qū)5沒有條帶。陰性結(jié)果表明樣本中不含目的核酸，或其數(shù)量低于試紙條的最低檢出量。無效：試紙條質(zhì)控區(qū)6和檢測區(qū)5均未出現(xiàn)條帶(參見圖11和12)。

2.2 LAMP靈敏性試驗

用已經(jīng)建立的寨卡病毒LAMP進行靈敏度試驗。結(jié)果表明LAMP方法可以檢測到10^-7的寨卡病毒RNA(見圖5、圖6)，表明所建立的寨卡病毒LAMP檢測方法具有較好的敏感性。

2.3 LAMP特異性試驗

在寨卡病毒特異性檢測的試驗中，分別用建立的LAMP方法對寨卡病毒進行檢測?？梢郧逦目吹秸ú《綥AMP陽性產(chǎn)物在濁度儀出現(xiàn)擴增曲線和一次性核酸檢測裝置里試紙條有條帶，而寨卡病毒并無條帶的出現(xiàn)(見圖7、圖8)。證實該方法對寨卡病毒具有良好的特異性。

2.4 RT-LAMP與RT-PCR檢測比較

與RT-PCR相比，RT-LAMP檢測體系表現(xiàn)出良好的特異性和更高的靈敏度。其中，寨卡病毒RNA被稀釋10⁶倍后(濃度為120fg/μl)，RT-LAMP檢測方法仍可觀察到陽性結(jié)果，與RT-PCR相比，靈敏度高出10²倍(見圖9)。

2.5臨床樣本檢測

11個臨床樣本檢測皆成陽性，與其他檢測方法所測結(jié)果一致(見圖10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣州中醫(yī)藥大學

<120> 一種寨卡病毒的可視化檢測方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgggatgtgg tgactgga 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcattgcta cgaaccttgt 20

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtctggcacc ctagtgtcca ctcacaggaa tagccatgac cg 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggcactcgt caggttatga gctacagact cgtggccgtt 40

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgaccatacg gtgtggtgt 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggtctctt cctggttgtg g 21