本發(fā)明涉及一種可生物降解的核交聯(lián)含釓配合物的聚合物及其制備方法和用途。

背景技術：

在臨床實踐中，影像學檢查在大多數(shù)疾病的定性和定位診斷中發(fā)揮著非常重要的作用。在這些影像學檢查手段中，磁共振成像作為非侵入性診斷工具具有高分辨率成像和三維軟組織成像等優(yōu)勢，其中，對比增強磁共振成像通過對比劑可進一步增強正常組織和疾病組織之間的對比，獲得清晰準確的圖像。目前，dtpa-gd、dtpa-gd和其他釓螯合物對比劑正廣泛應用于磁共振增強成像，但是這些對比劑的效果、敏感度和循環(huán)系統(tǒng)弛豫時間具有諸多限制，比如，這些對比劑會很快被清除而不能獲得長時間的體內循環(huán)。因此，為了達到更好的效果不得不重復注射和高劑量注射，但是這種方式會導致一些不良效應。理想的對比劑，應當具有高弛豫率，還應當具有生物安全性。針對腫瘤診斷的對比劑還要求其在腫瘤部位有高聚集，實現(xiàn)腫瘤高靶向性等。

隨著最近材料化學和納米技術的發(fā)展，研究者們嘗試將dtpa-gd等小分子偶聯(lián)或包埋到大分子系統(tǒng)中形成具有納米尺寸的大分子磁共振對比劑。這些納米尺寸的載體包括脂質體、膠束和其他聚合物，它們通過增強滲透滯留效應(epr效應)增加弛豫效率和腫瘤聚集度。在這些材料中，納米尺寸的聚合物能夠有效克服傳統(tǒng)對比劑的缺點，并且擁有很好的臨床前景。

水解聚馬來酸酐hpma無毒，無免疫原性，能夠在血液中有良好的循環(huán)?，F(xiàn)有報道的hpma共聚物擁有良好的生物相容性、無致免疫性、中性電荷和良好的水溶性能，通常作為腫瘤載體使用，但是其存在無法有效降解的問題，若攜帶釓等物質，對人體的副作用較大，可能會導致腎系統(tǒng)性纖維化等疾病。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種可生物降解的含釓配合物的聚合物及其制備方法和用途。

本發(fā)明首先提供了一種可生物降解的線性hpma聚合物，它的結構式如下式(ⅰ)：

其中，m＝57～170，n＝380～1150。

優(yōu)選地，所述聚合物的結構式中，m＝100，n＝672。

優(yōu)選地，所述聚合物的質量平均分子量為10～40kda，優(yōu)選為28kda。

優(yōu)選地，所述聚合物中gd的重量百分比為4～10％，優(yōu)選為6.6％。

優(yōu)選地，所述聚合物的pdi<2.5，優(yōu)選為1.09。

本發(fā)明還提供了一種可生物降解核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物，它的結構式如下式(ⅱ)：

其中，m＝57～170，n＝380～1150，p＝16～50，q＝16～50；

代表如下結構(ⅲ)(含釓配合物的phpma的一條單鏈)：

優(yōu)選地，所述聚合物的結構式中，m＝100，n＝672，p＝28，q＝28。

優(yōu)選地，所述聚合物的質量平均分子量為100～300kda，優(yōu)選為181kda。

優(yōu)選地，所述聚合物中gd的重量百分比為4～10％，優(yōu)選為6.1％。

優(yōu)選地，所述聚合物的pdi<2.5，優(yōu)選為1.95。

本發(fā)明前述線性聚合物可以按照如下方法制備，步驟如下：

(1)線性共聚物phpma-dota的合成：取hpma、4-cta、ma-dota和va044，加入水/甲醇溶液，反應，經液氮冷卻后在丙酮中沉淀出聚合物，得到粉紅色固體，透析后凍干，得含二硫代苯甲酸酯基團的hpma共聚物；將含二硫代苯甲酸酯基團的hpma共聚物與v501溶于甲醇，加熱，反應，透析后凍干，即得phpma-dota；

(2)線性含釓hpma共聚物的合成：將phpma-dota和gdcl3·6h2o溶解在水中，然后調節(jié)ph至5.2-5.4，反應，透析后凍干，即得phpma-dota-gd。

步驟(1)中，所述hpma、4-cta、ma-dota和va044的摩爾比為：9.75mmol：79μmol：6.5mmol：26.3μmol；所述水/甲醇溶液中，水與甲醇的體積比為5：1；每9.75mmolhpma，加入22ml水/甲醇溶液；所述反應是在0℃下溶液充滿氬氣40分鐘，然后44℃下旋轉8h；所述透析的時間是12h。

步驟(1)中，白色固體與v501的反應是在室溫下旋轉24小時；透析的時間是24h。

步驟(2)中，所述phpma-dota和gdcl3·6h2o的質量比為800：928mg，每800mg的phpma-dota使用的水為25ml；透析的時間是24h。

本發(fā)明前述核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物可以按照如下方法制備，步驟如下：

1)線性hpma共聚物phpma-dota的合成：取hpma、4-cta、ma-dota和va044，加入水/甲醇溶液，反應，經液氮冷卻后在丙酮中沉淀出聚合物，得到得到粉紅色固體，為含二硫代苯甲酸酯基團的hpma共聚物；

2)吡啶二硫代基團修飾的phpma-dota共聚物的合成:取含二硫代苯甲酸酯基團的聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup)和ptema，加入水/甲醇溶液和va044，反應，經液氮冷卻后在丙酮中沉淀出聚合物，得到粉紅色固體；將粉紅色固體與v501溶于甲醇，加熱反應，透析后凍干，得到產物吡啶二硫代基團修飾hpma共聚物；

3)核交聯(lián)phpma-dota聚合物的合成：氮氣保護下，吡啶二硫代基團修飾的phpma-dota溶解在去離子水/甲醇溶液中，充分攪拌后,乙酸乙酯/丙酮溶解的三羥甲基丙烷三(3-巰基丙酸酯)緩慢逐滴加入然后繼續(xù)攪拌；丙酮脫去雜質,然后通過sec儀器的系統(tǒng)進一步純化；收集有用成分、透析、凍干后得到白色產物核交聯(lián)phpma-dota聚合物；

4)核交聯(lián)phpma-dota-gd聚合物的合成：將核交聯(lián)phpma-dota聚合物和gdcl3·6h2o溶解在水中，然后調節(jié)ph至5.2-5.4，反應，透析后凍干，即得核交聯(lián)phpma-dota-gd聚合物。

步驟1)中，所述hpma、4-cta、ma-dota和va044的摩爾比為：9.75mmol：79μmol：6.5mmol：26.3μmol；所述水/甲醇溶液中，水與甲醇的體積比為5：1；每9.75mmolhpma，加入22ml水/甲醇溶液；所述反應是在0℃下溶液充滿氬氣40分鐘，然后44℃下旋轉8h；所述透析的時間是12h。

步驟2)中，所述含二硫代苯甲酸酯基團的聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup)與ptema的質量比為6:1；反應時加入的水/甲醇溶液中，水與甲醇的體積比為3：1；每1.2gphpma-dota，加入1.8ml水/甲醇溶液和3.2mgva044；所述反應是0℃下溶液充滿氬氣40分鐘，然后44℃下旋轉8小時；將白色固體溶解在水/甲醇溶液中時，所述水/甲醇溶液中的水與甲醇的體積比為4：1，以反應的起始物聚合物phpma-dota為1.2g計，水/甲醇溶液的用量為8ml；

步驟2)中，所述粉紅色固體，與10倍量的v501在70℃反應3小時。

步驟3)中，每900mg氮吡啶二硫代基團修飾的phpma-dota溶解在20ml水/甲醇溶液中；所述水/甲醇溶液中，水與甲醇的體積比為6：1；所述乙酸乙酯/丙酮中，二者體積比為1:1；三羥甲基丙烷三(3-巰基丙酸酯)每20mg加入1ml的乙酸乙酯/丙酮中；所述三羥甲基丙烷三(3-巰基丙酸酯)每20mg的滴加時間為1小時；反應為攪拌反應6小時；所述純化時采用sec儀器的系統(tǒng)純化。

步驟4)中，所述phpma-dota和gdcl3·6h2o的質量比為800：928mg，每800mg的phpma-dota使用的水為25ml；透析的時間是24h。

本發(fā)明還提供了前述聚合物在制備磁共振成像的對比增強劑中的用途。

本發(fā)明的優(yōu)勢在于：

1.本發(fā)明的制備方法設計并通過可逆加成-斷裂鏈轉移(raft)聚合和“點擊”化學構建了功能化的線性含釓配合物的聚合物phpma-dota-gd，以及可降解的核交聯(lián)的聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd。首先通過可逆加成-斷裂鏈轉移(raft)聚合，制備的分子量基本可控、分子量多分散系數(shù)(pdi)低的聚合物；并通過與gd(iii)偶聯(lián)，合成線性化的hpma-dota-gd。在此基礎之上，合成了核交聯(lián)的聚合物，將腫瘤微環(huán)境特意響應可降解的二硫鍵引入內核中，使其具有支化分子的分子結構特征，大大提高弛豫效能。與臨床上在用的二乙基三胺五乙酸-gd(dtpa-gd)磁共振成像探針相比，縱向弛豫效能(t1)是前者的三倍以上(10.49mm^-1·s^-1/gd)。同時，交聯(lián)的聚合物量與線性聚合物以及臨床試劑比較，可以延長在血液中的循環(huán)時間，增加epr被動靶向的能力，提高磁共振成像探針在腫瘤部位的聚集度，從而增加腫瘤部位的成像效果及治療效果。

2.本發(fā)明的內核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物能夠結合多個小分子量gd(iii)共軛物(dota)，分子量獲得提高(mw>180kda)，其可以降解為低于腎臟閾值的低分子量產物(<50kda)，且具有無免疫性、無毒性、水溶性及良好的生物相容性。

本發(fā)明還提供了前述聚合物在制備增強磁共振成像的對比劑中的用途。

本發(fā)明可生物降解核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd具有高的弛豫率，用于體內成像的效果優(yōu)良，同時無毒，生物相容性好，可降解，作為磁共振成像的對比劑使用的效果優(yōu)良，臨床應用前景優(yōu)良。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1合成線路圖

圖2聚合物核磁譜圖。

圖3phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd水溶液在3.0t磁共振中的t1-加權掃描圖像(a)和縱向弛豫率(1/t1)vs.gd(iii)(b)。

圖4phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd水溶液在1.5t磁共振中的t1-加權掃描圖像(a)和縱向弛豫率(1/t1)vs.gd(iii)(b)。

圖5注射濃度為0.08mmolgd(iii)/kg的phpma-dota-gd、core-crosslinked-phpma-dota-gd和dtpa-gd的小鼠在不同時間點下掃描圖像(a).小鼠體內腫瘤部位信號相對增強百分比(b),每組5只小鼠。

圖6注射濃度為0.08mmolgd(iii)/kg的phpma-dota-gd、core-crosslinked-phpma-dota-gd和dtpa-gd的小鼠在不同時間點下掃描圖像(a).小鼠體內膀胱部位信號相對增強百分比(b),每組5只小鼠。

圖7注射濃度為0.08mmolgd(iii)/kg的phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd24小時后體內重要器官的殘余量；每組5只小鼠。

圖8phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd在4t1(a)和lo2(b)細胞系中的細胞毒性實驗。

圖9紅細胞在不同條件下的溶血實驗:phpma-dota-gd溶液中(a)和core-crosslinkedphpma-dota-gd溶液中(b)；紅細胞在不同濃度的phpma-dota-gd溶液中和core-crosslinkedphpma-dota-gd溶液中的(c)

圖10不同濃度(2mg/mland5mg/ml)phpma-dota-gd(a)和core-crosslinkedphpma-dota-gd(b)溶液對于正常人鮮血aptt和pt的影響，pbs為對照組。

圖11通過sem觀察phpma-dota-gd(3mg/ml,a)、core-crosslinkedphpma-dota-gd(3mg/ml,b)和pbs溶液(c)對于紅細胞形態(tài)和聚集度的影響。

圖12正常balb/c小鼠注射0.08mmolgd(iii)/kg的dtpa-gd、phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和生理鹽水。21天內小鼠體重變化(a)，注射20天后小鼠重要器官釓的殘余量(b)；每組5只小鼠。

圖13正常balb/c小鼠注射0.08mmolgd(iii)/kg的dtpa-gd、phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和生理鹽水。注射20天后小鼠血常規(guī)檢測結果；每組7只小鼠。

圖14正常balb/c小鼠注射0.08mmolgd(iii)/kg的dtpa-gd、phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和生理鹽水。注射20天后小鼠生化檢測結果；每組7只小鼠。

圖15注射core-crosslinkedphpma-dota-gd、phpma-dota-gd和生理鹽水20天后體內重要器官的組織he染色切片。

具體實施方式

實施例1本發(fā)明可生物降解核交聯(lián)支化大分子釓聚合物的制備

1、制備方法

偶氮二異丁咪唑啉鹽酸鹽(va044)，環(huán)偶氮脒類引發(fā)劑v501，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(4-cta)和三羥甲基丙烷三(3-巰基丙酸酯)購買自sigma-adrich公司。

單體hpma(eur.polym.j.,1973,9,7-14)、ma-dota(acsappl.mater.interfaces,2016,8,10499-10512)、ptema(bioconjug.chem.,1998,9,749-757)均按已有文獻制備。

hpma、ptema和ma-dota的制備方法如下：

hpma：其結構式為按照j,h.poly[n-(2-hydroxypropyl)methacrylamide]—i.radicalpolymerizationandcopolymerization.eurpolymj.1973；9:7–14公開的hpma制備方法制備。

ma-dota：其結構式為按照lingsunetal.,stimuli-responsivebiodegradablehyperbranchedpolymer-gadoliniumconjugatesasefficientandbiocompatiblenanoscalemagneticresonanceimagingcontrastagents，acsappl.mater.interfaces,2016,8(16),pp10499–10512的附件部分公開的ma-dota方法制備。

ptema：其結構式為按照wang,l.,j.kristensen,andd.e.ruffner,deliveryofantisenseoligonucleotidesusinghpmapolymer:synthesisofathiolpolymeranditsconjugationtowater-solublemolecules.，《bioconjugatechemistry》,1998,9(6):749-757方法部分公開的方法制備。

合成材料的平均分子量(mw)以及多分散性均采用體積排阻色譜法(sec)進行檢測(ge公司，系統(tǒng))，使用含30％甲醇的乙酸鈉溶液作為流動相。

本發(fā)明的合成線路圖如圖1所示。

線性hpma共聚物(phpma-dota)的合成：hpma(1.4g,9.75mmol)、4-cta(12mg，79μmol)、ma-dota(3.34g,6.5mmol)和va044(8.5mg,26.3μmol)投入反應瓶，加入去離子水/甲醇溶液(5：1，22ml)。0℃下溶液充滿氬氣40分鐘，然后44℃下旋轉8小時。溶液經液氮冷卻后在丙酮中沉淀出聚合物，得到粉紅色固體。透析12小時后凍干，得到粉紅色產物二硫代苯甲酸酯基團聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup，45％產率，2.15g)。該聚合物的¹hnmr波譜圖見圖2a,其二硫代苯甲酸酯基團的氫質子峰為7.51-7.80ppm。二硫代苯甲酸酯基團聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup，1.2g)與v501(10倍量)溶于50ml甲醇，在70℃冷凝回流反應3小時，透析出去副產物，經過冷凍干燥可獲得聚合物(phpma-dota)，產率90％,1.08g。phpma-dota的1hnmr波譜圖見圖2b,其二硫代苯甲酸酯基團被取代,7.51-7.80ppmde氫質子峰消失。

線性含釓hpma共聚物(phpma-dota-gd)的合成：phpma-dota(800mg)和gdcl3·6h2o(928mg,2.5mmol)溶解在25ml去離子水中，然后用0.1mnaoh溶液調節(jié)ph至5.2-5.4，然后室溫下旋轉24小時。透析24小時后凍干得到終產物(phpma-dota-gd,810mg)，通過icp-ms測得載gd(iii)量為6.6％，分子量和分布見表1。

吡啶二硫代基團修飾的phpma-dota共聚物的合成:二硫代苯甲酸酯基團聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup，1.2g)和ptema(200mg,0.79mmol)投入反應瓶,然后加入去離子水/甲醇溶液(3:1,8ml)和va044(3.2mg,10μmol)，0℃下溶液充滿氬氣40分鐘，然后44℃下旋轉8小時。溶液經液氮冷卻后在丙酮中沉淀出聚合物，干燥得到粉紅色固體(產率75％y，1.05g)。同時含二硫代苯甲酸酯基團和吡啶二硫代基團的聚合物(1.0g)與v501(10倍量)溶于50ml甲醇，在70℃冷凝回流反應3小時，透析去出副產物，經過冷凍干燥可獲得吡啶二硫代基團的聚合物(pyridinedisulfidemodifiedphpma-dota),產率91％，0.91g。

核交聯(lián)的聚合物(core-corsslinkedphpma-dota)的合成：氮氣保護下，吡啶二硫代基團的聚合物(pyridinedisulfidemodifiedphpma-dota，900mg)溶解在去離子水/甲醇溶液(6:1,20ml)中，充分攪拌后，乙酸乙酯/丙酮(1:1,1ml)溶解的三羥甲基丙烷三(3-巰基丙酸酯)(20mg)緩慢逐滴加入(1小時)然后繼續(xù)攪拌6小時。200ml丙酮沉淀除去雜質,然后通過sec儀器的系統(tǒng)進一步純化、透析、凍干后得到白色產物核交聯(lián)聚合物(core-crosslinkedphpma-dota,810mg)。

核交聯(lián)含釓聚合物(core-corsslinkedphpma-dota-gd)的合成:核交聯(lián)聚合物(core-crosslinkedphpma-dota,800mg)和gdcl3·6h2o(928mg,2.5mmol)反應生成核交聯(lián)聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd，合成步驟與phpma-dota-gd合成步驟相同。通過icp-ms測得核交聯(lián)phpma-dota-gd聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)釓離子的含量為6.1％(重量百分含量)。核交聯(lián)phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的1hnmr波譜圖見圖2c，分子量表征見表1。

2、性質檢測

2.1檢測方法

質量平均分子量(mw)和多分散性(pdi)是通過尺寸排阻色譜(sec)測得。聚合物的核磁譜圖經高分辨超導核磁共振波譜儀(瑞士bruker公司，brukeravii-400mhz，brukeravii-600mhz)測得。釓離子含量經電感耦合等離子體質譜儀(icp-ms,elandrc-e,美國珀金埃爾默)測得。

同時檢測phpma-dota和核交聯(lián)phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的1hnmr波譜圖。

2.2檢測結果

含釓配合物的直鏈聚合物(phpma-dota-gd)和核交聯(lián)的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的表征結果如表1：

表1.含釓配合的直鏈聚合物(phpma-dota-gd)和核交聯(lián)的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的表征：

phpma-dota的1hnmr波譜圖見圖2b,其二硫代苯甲酸酯基團被取代,7.51-7.80ppmde氫質子峰消失。核交聯(lián)phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的1hnmr波譜圖見圖2c，分子量表征見表1。

實驗結果說明，本發(fā)明制備得到了線性phpma-dota-gd，其結構式為：

其中，m＝100，n＝672；

本發(fā)明還制備得到了核交聯(lián)phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)，其結構式如下式(ⅱ)：

其中，m＝100，n＝672，p＝28，q＝28；

代表如下結構(ⅲ)(含釓配合物的phpma的一條單鏈)：

以下用實驗例的方式來證明本發(fā)明的生物學效果：

實驗例1本發(fā)明可生物降解核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物的性質以及應用

取實施例1制備的核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物phpma-dota-gd，進行如下實驗，以檢測其性質：

1.1生物降解性研究

將core-crosslinkedphpma-dota-gd溶于含有含谷胱甘肽(gsh)的mcilvaine's緩沖液(4mg/ml，50mm檸檬酸鹽/0.1m磷酸鹽，2mmedta，4mm谷胱甘肽，ph＝5.4)，37℃孵育12小時，然后通過sec(系統(tǒng)，ge醫(yī)療)對樣本的降解性進行檢測，superose6hr10/30預裝柱裝載含30％甲醇(ph6.5)的乙酸鈉溶液作為流動相(流動率：0.4ml/min)。

1.2體外t1水相弛豫實驗

室溫下ph7.4pbs溶解材料，材料濃度為對應gd(iii)溶度(0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5mm)，臨床用gd-dtpa為對照組，1.5t磁共振掃描，t1加權磁共振掃描序列參數(shù)如下：te＝8.7ms,tr＝25,30,50,70,90,110,150,170,190,210,250,300,400,600,700,and800ms,fov＝200mm,slicethickness＝2.0mm,matrixdimensions＝256×256。弛豫效率值通過1/t1和gd(iii)離子線性關系的斜率得出。

1.3體內磁共振成像

通過體內磁共振成像實驗，觀察材料在腫瘤部位的聚集。利用4t1細胞小鼠背部皮下接種建立小鼠乳腺癌皮下模型。首先7×10⁵個4t1細胞準確接種到6-7周齡balb/c小鼠背部，腫瘤生長到約15mm³左右后將小鼠隨機分為3組，每組包括5只小鼠。三組小鼠分別尾靜脈注射phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和臨床用dtpa-gd((0.08mmolgd(iii)/kg)。通過3.0t磁共振掃描儀獲得不同時間點材料在腫瘤部位的聚集度。掃描前用苯巴比妥麻醉小鼠，然后將小鼠固定于定制線圈。t1加權掃描序列如下：tr＝450ms,te＝11ms,slices＝11,voxelsize＝0.2×0.2×1.5mm,fov＝51mm。注射前，注射后10、30、45、60、180分鐘后分別掃描，獲得腫瘤部位聚集圖像，然后利用磁共振成像系統(tǒng)工具圈取腫瘤部位獲得具體數(shù)值。信號相對增強比(δsnr)計算公式如下圖：

si(tumor),si(bladder)andsi(water)分別為腫瘤、膀胱和水膜的信號強度。

1.4體內組織分布實驗

15只皮下乳腺癌模型小鼠隨機分為3組，分別通過尾靜脈注射phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd(0.08mmgd(iii)/kg),24小時后處死小鼠，取出重要臟器和組織(心、肝、脾、肺、腎、腫瘤)，4％甲醛溶液固定。器官和組織用pbs清洗一次，稱重。用h2o2(1ml)和hno3(3ml)溶解器官，加熱到120℃直到組織完全消化，然后用去離子水稀釋到4ml。最終樣品用電感耦合等離子體質譜(icp-ms)測量各器官或組織內剩余的gd的濃度。體內剩余gd的含量通過下面公式可計算出：

1.5材料細胞毒性實驗

通過觀察材料對腫瘤細胞和正常細胞的細胞活性的影響來評價其毒性。實驗用到4t1細胞(乳腺癌細胞)和lo2細胞(正常肝臟細胞)，兩種細胞分別接種到96孔板中(5×10³個/孔，100μldmem培養(yǎng)基在37℃，5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去96孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基。然后加入含有不同濃度(25,50,100,200μg/ml)的phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24小時。24小時候用pbs洗三次細胞，然后每孔加入細胞毒性評價試劑盒cck-8(dojindo,japan)。孵育2小時后，用用酶標儀(thermofisherscientific)測450nm處的吸光度。為處理的細胞活性記作100％，根據(jù)橫線和縱向比較評價其細胞毒性作用。

1.6紅細胞溶血性實驗

該實驗用來評價材料對于紅細胞是否有影響。用含有檸檬酸鈉的抗凝管抽取正常短期內為服用任何藥物的志愿者新鮮血液，1000g離心5min，pbs洗3次，棄去上層清液，取紅細胞和pbs配成16％的紅細胞懸液。然后向50ul細胞懸液中分別加入濃度分別為phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd至終濃度為1、3、5mg/ml，設立去離子水為對照組，37℃孵育12小時后1000g離心5min，取上層清液200μl轉移至96孔板中，酶標儀測定樣品在540nm的od值。每個濃度設立三個平行組進行測試。溶血百分率通過下面的公式來計算：

溶血率(％)＝(a-b)/(c-b)×100

a:納米粒樣品溶液測試的吸光度，b:pbs緩沖液樣品測試的吸光度，c:水溶液樣品測試的吸光度。

1.7活化部分凝血活酶時間(aptt)，凝血酶原時間(pt)

抽取健康人體新鮮血液(抗檸檬酸鈉管子中)，1000g離心5min，取上層血漿。向1.5ml的ep管中，加入40μl的phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd材料溶液，然后加入360μl的血漿，設立同體積pbs為陰性對照組，在漩渦震蕩儀上混合均勻。采用全自動凝血分析儀上進行測試，每個樣品設立3個平行樣。

1.8紅細胞形貌和聚集

抽取健康人體新鮮血液(抗檸檬酸鈉管子中)，加入pbs,1000g離心5min，棄去上層清液，重復兩次，搜集紅細胞。向1.5ml的ep管中，加入100μl的phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd材料pbs溶液，設立同體積pbs溶液為對照組，然后加入20μl的紅細胞，吹打混勻。室溫孵育15min，離心，棄去上清液，加入0.5ml4％的pbs多聚甲醛溶液，吹打，混勻，固定至少1h。將固定的紅細胞重懸，吸取20μl懸浮液均勻涂在24孔板底部，5min后次用75％，85％，95％，100％的乙醇水溶液進行脫水。最后在25度恒溫條件下自然晾干，sem掃描觀察細胞形貌和聚集。

1.9體內毒性實驗

28只正常雌性balb/c小鼠(20±2g)，隨機分為4組，稱重，標記(實驗通過動物實驗倫理委員會的審查)。其中三組小鼠分別尾靜脈給予0.08mmolgd(iii)/kg濃度的dtpa-gd,phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd，另外一組給予相同體積的生理鹽水作為陰性對照，每4天給藥一次，共3次，給藥后每2天小鼠稱重一次并記錄。20天后，小鼠眼球取血后送血常規(guī)和生化檢測，其中5只處死后取出重要器官(心、肝、脾、肺、腎)，消化后用電感耦合等離子體質譜(icp-ms)測量各器官或組織內剩余的gd的濃度，并計算體內剩余gd的含量。剩余2只小鼠處死后取出重要器官(心、肝、脾、肺、腎)，用4％的多聚甲醛溶液固定48小時，石蠟包埋，he染色，作組織切片分析。

1.10數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)用均值±標準差、方差分析以及雙尾t-檢驗分析，p<0.05被認為結果有顯著差異。

2.結果和討論

2.1核交聯(lián)聚合物的降解

提高聚合物磁共振成像對比劑的弛豫效能及腫瘤部位的聚集的有效方法就是提高其分子量，同時將聚合物的分子結構調節(jié)到支化結構。核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的分子量較其直鏈的含釓配合物的聚合物(cphpma-dota-gd，mw＝28kda)的分子量得到顯著提高，達到1-2倍。由于內核的交聯(lián)，其分子結構調節(jié)為支化結構。此外，為了滿足腎臟排泄的需要，腎閾值又要求分子量更低。因此，可生物降解的二硫鍵被引入到交聯(lián)聚合物的內核中。在腫瘤細胞高表達的谷胱甘肽(gsh)存在的情況下，核交聯(lián)的聚合物能夠降解成低分子量的片段。與gsh共孵育8小時后，交聯(lián)的聚合物已完全降解為低分子量產物(小于30kda)(表2)，而這一大小低于腎閾值(50kda)。這一降解性歸因于gsh可以切開二硫鍵。研究結果表示這一核交聯(lián)的聚合物一旦到達腫瘤部位完成作為磁共振對比劑的任務就會發(fā)生降解，從而保證他們的有效清除和生物相容性。表2.核交聯(lián)的含釓配合物的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的分子量和pdi，以及其降解隨時間變化的分析。

2.2體外磁共振成像

如圖3所示，3t磁共振下t1加權mr成像顯示在相同的gd濃度下，phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd在腫瘤部位信號強度明顯高于臨床用dtpa-gd，意味著兩種聚合物在腫瘤部位的聚集度明顯高于臨床用dtpa-gd。同時定量r1弛豫率顯示phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd的r1值分別為6.42和10.49mm^-1·s^-1，是臨床用dtpa-gd[2.54mm^-1·s^-1,pergadolinium(iii)]的3-4倍。1.5t磁共振中也得到同樣的結果(見圖4)。并且，core-crosslinkedphpma-dota-gd與phpma-dota-gd相比較，前者有更好的磁共振增強效果。

2.3體內磁共振成像

基于體外t1成像效果，我們進一步探究了小鼠模型體內磁共振成像，觀察材料在腫瘤部位的增強效果。如圖5所示，通過體內磁共振成像圖片可以明顯看出注射臨床用對比劑dtpa-gd后，小鼠腫瘤部位強度在10分鐘到180分鐘之前先升高后下降，而注射兩種材料后，腫瘤部位信號強度明顯增加，沒有出現(xiàn)下降的趨勢。

為了更加準確比較，我們對腫瘤部位強化做了定量分析，通過不同時間點的腫瘤部位的信號強度(si)來量化增強效果。如圖6所示，尾靜脈注射臨床用dtpa-gd的小鼠，與水膜相比，10分鐘后信號增強明顯(約為220％)，但是30分鐘后信號強度開始下降，180分鐘后恢復到注射前水平。而應用phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd的小鼠腫瘤部位信號10分鐘后增強，然后繼續(xù)增加，180分鐘后信號強度明顯高于注射前(約為240-260％)。兩者比較，不同時間點core-crosslinkedphpma-dota-gd的增強效果比phpma-dota-gd更加明顯。實體腫瘤表現(xiàn)的epr效應各方面因素有關，core-crosslinkedphpma-dota-gd比phpma-dota-gd擁有更加適合的尺寸透過腫瘤新生血管間隙，聚集腫瘤部位達到增強的效果。

值得注意的是，小鼠模型的膀胱信號強度的變化正好與腫瘤部位相反，如圖6所示。注射臨床用dtpa-gd的小鼠在不同時間點均高于注射core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd的小鼠。這也從另一方面反映了兩種材料在體內的循環(huán)時間要比臨床用dtpa-gd長，可能也是由于分子量的原因。小鼠膀胱更加容易濾過小分子的dtpa-gd，而大分子藥物在體內循環(huán)過后通過體內酶的作用降解后再排出體外。這樣的特性也保證了材料的生物安全性，有利于未來的利用。

2.4材料的體內生物分布

影響信號強度的一個重要因素就是材料的體內分布。如圖7所示，與臨床用dtpa-gd相比，core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd24小時后腫瘤部位和其他重要器官釓的殘余量顯著增加。腫瘤部位的釓殘余量也正好與磁共振信號強度相印證，再次證明了兩種材料的增強效果。其次，其他器官的釓的殘余量也明顯增加，可能的原因是材料的分子量和尺寸較大，在體內循環(huán)時間較長，器官中血供豐富，導致釓的殘余量增加。

2.5材料的細胞毒性

通過cck-8實驗，我們進一步探究了材料對腫瘤細胞和正常細胞的細胞毒性作用。如圖8所示，與臨床用dtpa-gd相比，材料在4t1腫瘤細胞的細胞活性更低而在lo2正常肝細胞的活性更高(從25μg/ml到200μg/ml)。應該主要歸因于我們材料成分的生物相容性和表面帶負電荷等因素。這也驗證了材料的良好的生物安全性。

2.6血液相容性試驗

材料對于紅細胞溶血的影響：紅細胞表面可以和某些抗體結合形成免疫復合物，激活補體導致紅細胞溶血。材料進入人體內，首先與細胞膜相接觸，可能導致補體激活，所以分析材料對紅細胞溶血的影響是很有必要的。在我們的實驗中，如圖9所示，1.0、2.0、5.0mg/ml濃度的材料經過孵育12小時，沒有發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象，最高溶血率還是低于1％。而美國材料試驗學會標準指出可接受的溶血率應低于5％，所以兩種材料具有很好的生物安全性。這個結果有可能是很多因素導致的，表面負電荷和可降解等特點可能發(fā)揮了重要作用。

aptt和pt:對于正常機體來說，某些內源性和/或外源性物質能夠刺激血液中凝血因子的激活，血小板的聚集，纖維蛋白原的激活最終導致凝血，所以aptt和pt的檢測反應血液凝血時間的實驗尤為重要。如圖10所示，與pbs陰性對照比較，在不同的濃度下aptt和pt的時間均在正常范圍之內，說明材料對于血液凝血功能沒有太大的影響。

2.7材料對于紅細胞聚集和形態(tài)的影響

根據(jù)之前的文獻報道，紅細胞表面負電荷與帶正電材料之間的電子間相互作用可能影響到紅細胞的形態(tài)的聚集狀態(tài)，同時材料中的部分疏水性結構也會對紅細胞有所影響，因此觀察紅細胞的形態(tài)和聚集狀態(tài)也是很有必要的。如圖11所示，不同濃度的材料和pbs比較，紅細胞的形態(tài)和聚集都沒有明顯的改變。在低倍下，經過材料孵育過的紅細胞具有良好的分散性，沒有出現(xiàn)異常的表現(xiàn)；高倍下，紅細胞膜表面光滑完整，呈現(xiàn)正常的雙凹圓盤狀結構，和pbs對照組相比，沒有明顯的結構變化。因此，我們認為材料對紅細胞的形貌和聚集狀態(tài)沒有明顯的負面影響，血液安全性良好。

2.8材料對于正常小鼠的毒性作用

材料對于正常小鼠是否具有毒性作用能夠綜合反映出材料的生物安全性。尾靜脈注射材料后，小鼠沒有表現(xiàn)出脫水、運動失協(xié)調、肌肉萎縮、貧血等其他動物毒性相關特征。小鼠體重變化如圖12所示，與生理鹽水對照，材料組和dtpa-gd組的均沒有太大的變化，處于正常生長范圍之內。體重變化說明材料對于正常小鼠沒有明顯的毒副作用。血常規(guī)和生化檢測能夠反映出小鼠體內血液狀態(tài)和肝腎功能。如圖13所示，注射core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd的小鼠血常規(guī)指標：紅細胞(rbc)、血紅蛋白(hgb)、紅細胞壓積(hct)、血小板數(shù)(plt)、平均血小板體積(mpv)、白細胞數(shù)(wbcs)，所有指標與注射dtpa-gd組無明顯差異。如圖14所示，注射core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd的小鼠生化檢查指標：谷丙轉氨酶(alt)、谷草轉氨酶(ast)、堿性磷酸酶(alp)、谷氨酰轉移酶(ggt)、尿素氮(bun)、肌酐(cre)，所有指標與注射dtpa-gd組無明顯差異。為了進一步驗證體內毒性，小鼠處死后器官組織切片分析沒有發(fā)現(xiàn)組織損害、炎癥等變化(圖15)。

3.結論

綜上所述，本發(fā)明phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd的弛豫率r1值分別為6.42和10.49mm^-1·s^-1，是臨床用dtpa-gd[2.54mm^-1·s^-1,pergadolinium(iii)]的2.5-4.1倍，體內磁共振成像實驗也進一步驗證它們作為對比劑用于體內成像的效果非常良好，同時可降解，體內體外毒性試驗表明材料具有良好的生物相容性和生物安全性。

綜上，本發(fā)明可生物降解核交聯(lián)支化大分子釓聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd具有高的弛豫率，用于體內成像的效果優(yōu)良，同時可降解，無毒，生物相容性好，臨床應用前景優(yōu)良。