本發(fā)明涉及生物高分子材料領(lǐng)域，具體涉及一種ph和溫度敏感型水凝膠、其制備方法以及在藥物控制釋放中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和智能特性的刺激響應(yīng)性材料，由于可以響應(yīng)周圍環(huán)境的變化，吸引了研究者的廣泛關(guān)注。這些刺激包括溫度、ph、光、磁場(chǎng)、電場(chǎng)等。水凝膠是三維親水網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在水中溶脹但不溶解，作為長(zhǎng)期有效的藥物傳遞工具被廣泛研究，并且水凝膠中引入刺激響應(yīng)特性后吸引了研究者越來越多的關(guān)注。

在眾多外界環(huán)境刺激中，ph和溫度敏感型水凝膠由于在體外和體內(nèi)環(huán)境中表現(xiàn)出可控潛力，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到最廣泛的研究。而且體內(nèi)的不同組織有不同的ph值，提高了可控局部藥物傳遞的可能性。例如與正常的健康組織相比，腫瘤組織部位往往有較低的ph值。構(gòu)建ph和溫度敏感型水凝膠應(yīng)用于藥物控制釋放體系將對(duì)人體局部病變組織的治療有重要意義。

詹秀環(huán)等將n,n′-亞甲基雙丙烯酞胺(mba)作為交聯(lián)劑首先制備了聚丙烯酸水凝膠，隨后在聚丙烯酸水凝膠中聚合n-異丙基丙烯酰胺，采用兩步法合成了聚丙烯酸/聚(n-異丙基丙烯酰胺)水凝膠，研究了其ph和溫度響應(yīng)性能(詹秀環(huán)，田博士，姚新建“聚丙烯酸/聚(n-異丙基丙烯酰胺)互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備及其性能”。精細(xì)石油化工，2010，27(5)：73-75)。

汪玉辛等采用原位聚合方法制備了聚n-異丙基丙烯酰胺/聚甲基丙烯酸/氧化石墨烯復(fù)合水凝膠，研究了水凝膠的力學(xué)性能、溶脹性能和ph敏感性能，但并未涉及到水凝膠的細(xì)胞相容性方面研究。(汪玉辛，姜茜茜，陳婉，王平華“n－異丙基丙烯酰胺/甲基丙烯酸/氧化石墨烯復(fù)合水凝膠研究”。彈性體，2016，26(2)：40-44)。

在構(gòu)建ph和溫度敏感性智能水凝膠的同時(shí)，進(jìn)一步提高水凝膠的細(xì)胞相容性，在藥物控制釋放中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種ph和溫度敏感型智能水凝膠，這種水凝膠經(jīng)過類細(xì)胞外基質(zhì)的多糖修飾，可以提高水凝膠的細(xì)胞相容性。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，所采用的技術(shù)方案是：

一種透明質(zhì)酸修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠的制備方法，采用以下方法制備：

a、n-異丙基丙烯酰胺和丙烯酸溶于有機(jī)溶劑中，以偶氮二異丁腈(aibn)作為引發(fā)劑，逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(raft)試劑為鏈轉(zhuǎn)移劑，反應(yīng)得到反應(yīng)液，經(jīng)透析、冷凍干燥后得到聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠；

b、將透明質(zhì)酸(ha)溶于水中，加入己二酸二酰肼(adh)與透明質(zhì)酸(ha)反應(yīng)，使透明質(zhì)酸(ha)帶上肼基基團(tuán)，隨后將反應(yīng)溶液透析、冷凍干燥后得到帶有肼基基團(tuán)的透明質(zhì)酸；

c、將聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠浸泡在水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基丁二酰亞胺(nhs)反應(yīng)，最后加入帶有肼基基團(tuán)的透明質(zhì)酸進(jìn)行共價(jià)固定反應(yīng)，得到透明質(zhì)酸修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠。

采用可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(raft)聚合方法將n-異丙基丙烯酰胺和丙烯酸聚合為水凝膠，制備條件溫和，得到高產(chǎn)率的產(chǎn)物，副產(chǎn)物較少。

本發(fā)明將透明質(zhì)酸(ha)共價(jià)接枝在水凝膠中，所述透明質(zhì)酸(ha)為d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺組成的雙糖單位玻尿酸，其作用是將天然細(xì)胞外基質(zhì)中的多糖成分透明質(zhì)酸引入智能型水凝膠中，在保持ph和溫度敏感性的同時(shí)，并可進(jìn)一步提高水凝膠的細(xì)胞相容性。

所述的步驟a中，n-異丙基丙烯酰胺與丙烯酸摩爾比為85～95：5～15。

所述的步驟a中，raft試劑優(yōu)選為末端帶羧基的raft試劑。具體選用2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸等。

所述的步驟a中，有機(jī)溶劑優(yōu)選選自甲醇或二甲基甲酰胺；反應(yīng)溫度55-65℃；反應(yīng)時(shí)間24-48h。

所述的步驟b和c中，其機(jī)理為edc通過與羧基反應(yīng)形成o-酰基異硫脲中間體，然而，該中間體在水溶液中很不穩(wěn)定，并易于水解。o-?；惲螂逯虚g體在nhs存在的情況下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)榘被磻?yīng)活性的nhs-活性酯，這種nhs-活性酯中間體非常穩(wěn)定，可以允許將縮合反應(yīng)分解成兩步進(jìn)行。nhs-活性酯進(jìn)而與ha的肼基基團(tuán)反應(yīng)形成酰胺鍵，進(jìn)而將ha共價(jià)固定在水凝膠中。

優(yōu)選地，所述的步驟b和c中，加入edc和nhs的摩爾比為1:0.9～1.1；反應(yīng)時(shí)間為0.5-2h；溫度為室溫。

所述的步驟b中，ha與edc的質(zhì)量比為0.1～2:1；ha中羧基與adh中肼基基團(tuán)的當(dāng)量比為1:2～5，ha與adh反應(yīng)時(shí)間2-4h，反應(yīng)溫度為室溫。

所述的步驟c中，聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠與edc的質(zhì)量比為2～10:1；聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠與帶有肼基基團(tuán)的ha的質(zhì)量比為1:0.05～0.25，共價(jià)固定反應(yīng)的時(shí)間為12-36h，溫度為室溫。

本發(fā)明還提供了上述方法制備的透明質(zhì)酸修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠在藥物控制釋放中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：一是采用raft聚合方式合成了聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠，條件溫和，產(chǎn)率高，副產(chǎn)物少；二是引入透明質(zhì)酸類細(xì)胞外基質(zhì)成分，在保持ph和溫度敏感功能的同時(shí)，將細(xì)胞外基質(zhì)成分(透明質(zhì)酸)引入水凝膠中，提高了水凝膠的細(xì)胞相容性，使之在生物醫(yī)用領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1本發(fā)明實(shí)施例1制備的ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠。

圖2本發(fā)明應(yīng)用例1bsa裝載在ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠后并在ph＝2.0和ph＝7.4溶液中的釋放曲線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

(1)n-異丙基丙烯酰胺20.00g(0.177mol)，丙烯酸0.67g(0.009mol)，溶于300ml甲醇中，隨后加入引發(fā)劑aibn0.207g，再加入raft試劑2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸0.083g，55℃反應(yīng)48h，溶液產(chǎn)物透析、冷凍干燥后得到聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠；

(2)將0.5gha(分子量20萬)溶于100ml水中，加入edc1.917g和nhs1.151g，室溫下反應(yīng)0.5h后，加入adh0.452g，室溫下反應(yīng)2h，得到ha-adh溶液，溶液產(chǎn)物透析、冷凍干燥后得到ha-adh粉末；

(3)將(1)得到的水凝膠10g，浸泡在100ml水中24h，加入edc1.917g和nhs1.151g，室溫下反應(yīng)0.5h后，隨后加入(2)得到的ha-adh粉末0.5g，室溫下共價(jià)固定12h；將修飾后的水凝膠從反應(yīng)液中取出放入新的水中浸泡12h，反復(fù)2-3次，去除未反應(yīng)的ha-adh、edc、nhs,最終得到ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠。

實(shí)施例2

(1)n-異丙基丙烯酰胺18.58g(0.164mol)，丙烯酸2.09g(0.029mol)，溶于300ml甲醇中，隨后加入引發(fā)劑aibn0.103g，再加入raft試劑2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸0.042g，65℃反應(yīng)24h，溶液產(chǎn)物透析、冷凍干燥后得到聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠；

(2)將2.5gha(分子量20萬)溶于100ml水中，加入edc1.917g和nhs1.151g，室溫下反應(yīng)2h后，加入adh1.130g，室溫下反應(yīng)4h，得到ha-adh溶液，溶液產(chǎn)物透析、冷凍干燥后得到ha-adh粉末；

(3)將(1)得到的水凝膠10g，浸泡在100ml水中24h，加入edc1.917g和nhs1.151g，室溫下反應(yīng)2h后，隨后加入(2)得到的ha-adh粉末2.5g，室溫下共價(jià)固定36h，隨后將修飾后的水凝膠從反應(yīng)液中取出放入新的水中浸泡12h，反復(fù)2-3次，去除未反應(yīng)的ha-adh、edc、nhs,最終得到ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠。

實(shí)施例3

(1)n-異丙基丙烯酰胺19.31g(0.171mol)，丙烯酸1.36g(0.019mol)，溶于300ml二甲基甲酰胺中，隨后加入引發(fā)劑aibn0.155g，再加入raft試劑2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸0.062g，60℃反應(yīng)36h，溶液產(chǎn)物透析、冷凍干燥后得到聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠；

(2)將1.0gha(分子量20萬)溶于100ml水中，加入edc1.917g和nhs1.151g，室溫下反應(yīng)1h后，加入adh0.904g，室溫下反應(yīng)3h，得到ha-adh溶液，溶液產(chǎn)物透析、冷凍干燥后得到ha-adh粉末；

(3)將(1)得到的水凝膠10g，浸泡在100ml水中24h，加入edc1.917g和nhs1.151g，室溫下反應(yīng)1h后，隨后加入(2)種的ha-adh粉末0.8g，室溫下共價(jià)固定24h，隨后將修飾后的水凝膠從反應(yīng)液中取出放入新的水中浸泡12h，反復(fù)2-3次，去除未反應(yīng)的ha-adh、edc、nhs,最終得到ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠。

應(yīng)用例1

牛血清白蛋白(bsa)作為模型藥物，裝載在ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠中，隨后將包裹藥物的水凝膠浸沒在5ml且ph＝2.0的溶液中釋放2h，每間隔0.5h取出0.5ml釋放液，同時(shí)再補(bǔ)加0.5ml新鮮溶液，以保持溶液總體積不變。2h后將包裹藥物的水凝膠浸沒在5ml且ph＝7.4的溶液中釋放6h，每間隔0.5h取出0.5ml釋放液，同時(shí)再補(bǔ)加0.5ml新鮮溶液，以保持溶液總體積不變。上述藥物緩釋過程在37℃恒溫振蕩槽內(nèi)進(jìn)行。用紫外-可見分光光度計(jì)在595nm波長(zhǎng)測(cè)定釋放液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算釋放溶液中bsa藥物的累積釋放量。

結(jié)論：如圖2所示，本應(yīng)用例證明ha修飾的聚(n-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)水凝膠是ph響應(yīng)型水凝膠，并且這種水凝膠在不同ph環(huán)境下釋放藥物的速率不同，說明這種水凝膠在調(diào)控藥物釋放速率方面有廣泛的應(yīng)用前景。