本發(fā)明公開了一種多肽，更具體地，公開了一種抗體，屬于免疫學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：癌胚抗原(cea，又稱為ceacam-5或cd66e)是一種具有約180kda分子量的糖蛋白。cea是免疫球蛋白超家族的一名成員，并且含有經(jīng)由糖基磷脂酰肌醇(gpi)錨與細胞膜連接的7個域。7個域包括單一n端ig可變域和與ig恒定域同源的6個域(a1-b1-a2-b2-a3-b3)。cea最初分類為僅在胎兒組織中表達的蛋白質(zhì)，現(xiàn)在已經(jīng)在幾種正常成年組織中鑒定出。cea的過量表達在許多類型的癌癥中觀察到，包括結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、肝細胞瘤、乳腺癌和甲狀腺癌。因此，cea已經(jīng)被鑒定為腫瘤相關(guān)抗原。cea容易自細胞表面切割，并直接或經(jīng)由淋巴系統(tǒng)自腫瘤脫落入血流中。由于此特性，已經(jīng)使用血清cea的水平作為臨床標志物以診斷癌癥并篩選癌癥。而且，cea也已被用作腫瘤標記，測量癌癥患者血液中升高的cea的免疫學(xué)測定法已在臨床上用于癌癥的預(yù)后和控制。更重要的是，cea已成為用于靶向治療的潛在有用的腫瘤相關(guān)抗原。已經(jīng)報道的使用cea靶向免疫治療癌癥主要有2種主要方法：一種方法使用抗cea抗體引發(fā)免疫細胞的溶解活性，特別是通過抗體依賴性細胞毒性(adcc)或補體依賴性細胞毒性(cdc)，以消除表達cea的腫瘤細胞。另一種方法是通過抗cea抗體或抗體片段與例如藥物、毒素、放射性核苷酸、免疫調(diào)節(jié)劑或細胞因子等效應(yīng)分子綴合，特異性靶向表達cea的腫瘤細胞，從而發(fā)揮效應(yīng)分子的治療作用。目前已經(jīng)針對cea生成多種單克隆抗體。chester等已經(jīng)自噬菌體展示文庫分離出單鏈抗cea抗體以在放射性免疫檢測和放射性免疫療法中使用(美國專利no.5,876,691)，隨后將抗體人源化(美國專利no.7,232,888)。放射性標記的抗cea抗體已經(jīng)在結(jié)腸直腸癌患者的臨床試驗中使用。1993年，hamers-casterman等研究發(fā)現(xiàn)，在駱駝科動物(駱駝，單峰駱駝和美洲駝)的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種天然缺失輕鏈的抗體，即，僅有重鏈的抗體(heavychain-only-likeantibody，hcabs)，由于該抗體只包含一個重鏈可變區(qū)(vhh)和兩個常規(guī)的ch2與ch3區(qū)，其抗原結(jié)合區(qū)僅是一個通過鉸鏈區(qū)與fc區(qū)連接的單結(jié)構(gòu)域，因此該類抗體又稱為單域抗體。該類抗體不像人工改造的單鏈抗體片段(scfv)那樣容易相互沾粘，甚至聚集成塊。vhh結(jié)構(gòu)域的晶體為2.5nm，長4nm，分子量只有15kda，此也被稱作納米抗體(nanobody，nb)，單獨克隆并表達出來的vhh結(jié)構(gòu)具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合活性，是目前已知的可結(jié)合目標抗原的最小單位。相對于常規(guī)的四鏈抗體的scfv而言，納米抗體或者單域抗體在親和力方面與其對應(yīng)的scfv相當(dāng)，但在可溶性、穩(wěn)定性、對聚集的抗性、可重折疊性、表達產(chǎn)率以及dna操作、文庫構(gòu)建和3-d結(jié)構(gòu)測定的容易性方面超越scfv。因此，納米抗體或單域抗體在疾病的治療和診斷中具有很大的價值，在腫瘤的抗體靶向診斷和治療中也具有很大的發(fā)展前景。但是，基于單表位識別抗體存在的結(jié)構(gòu)性缺陷也同時制約著該類抗體的進一步應(yīng)用。這是因為傳統(tǒng)的天然抗體雖然是雙價抗體，但是兩組相同的重鏈和輕鏈組合，只能識別和結(jié)合相同的抗原表位，這種單價的線性結(jié)合不僅會使識別和結(jié)合的能力低下，還會因為結(jié)合表位的缺失和變異而難以完成識別和結(jié)合的目的。雙特異性抗體是近幾年發(fā)展起來的一種抗體技術(shù)，可以同時識別2種不同的抗原。利用雙特異性抗體，可以研發(fā)同時針對同一抗原不同表位的雙價抗體。抗體分子是通過其重鏈和輕鏈可變區(qū)共同組成一個特定的空間結(jié)構(gòu)，識別抗原分子，普通的抗體有四條多肽鏈組成，2條相同的輕鏈，2條相同的重鏈，只能識別同一個抗原分子。雙特異性抗體可以利用不同的技術(shù)獲得，如將2種不同抗體的可變區(qū)序列串聯(lián)在同一個恒定區(qū)序列基因上，這樣表達出來的抗體分子有2種不同的抗原結(jié)合區(qū)；或者利用化學(xué)的方法，將2個不同輕鏈、2個不同的重鏈分子連接成一個抗體樣結(jié)構(gòu)的分子?？贵w分子的重鏈和輕鏈可變區(qū)可以形成一定的空間結(jié)構(gòu)，識別特定的抗原分子。有研究發(fā)現(xiàn)，不同的抗體分子間，存在輕鏈序列或者重鏈序列相同的現(xiàn)象，證明輕鏈和重鏈通過空間結(jié)構(gòu)的相互契合，可以識別不同的抗原分子或者識別同一抗原的不同表位，這也是抗體分子交叉反應(yīng)的理論基礎(chǔ)?；诂F(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)抗體在識別和結(jié)合cea抗原中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的就是提供一種能夠特異性識別cea抗原的vhh結(jié)構(gòu)域，即納米抗體，含有該結(jié)構(gòu)域的單域抗體，以及能夠同時針對cea抗原不同表位的雙特異性納米抗體。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于上述目的，本發(fā)明首先提供了一種抗cea抗原的vhh結(jié)構(gòu)域，所述vhh結(jié)構(gòu)域的3個互補決定區(qū)cdr1、cdr2、cdr3分別為seqidno：1的第21-30、45-61、94-99位氨基酸序列所示，或者如seqidno：3的第21-30、45-61、95-110位氨基酸序列所示。在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述vhh結(jié)構(gòu)域的序列如seqidno：1或者seqidno：3所示的氨基酸序列所示；在本發(fā)明中納米抗體11c12即具有如seqidno：1所示氨基酸序列的vhh結(jié)構(gòu)域，納米抗體2c2即具有如seqidno：3所示氨基酸序列的vhh結(jié)構(gòu)域。其次，本發(fā)明還提供了一種含有上述vhh結(jié)構(gòu)域的單域抗體，所述抗體的恒定區(qū)序列如seqidno：5所示；所述單域抗體即帶有缺失ch1的恒定區(qū)序列的vhh結(jié)構(gòu)域序列。第三，本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，所述抗體含有兩條序列不同的重鏈，所述兩條序列不同的重鏈由seqidno：1所示的氨基酸序列與seqidno：3所示的氨基酸序列串聯(lián)而成。優(yōu)選地，由seqidno：1所示的氨基酸序列位于所述串聯(lián)的氨基端。優(yōu)選地，所述串聯(lián)的兩條序列不同的重鏈可變區(qū)之間設(shè)有連接肽，所述連接肽為(g4s)n，其中，n為1-6之間的整數(shù)。更為優(yōu)選地，所述n＝3。再為優(yōu)選地，所述抗體的氨基酸序列如seqidno：6所示。尤為優(yōu)選地，在所述串聯(lián)的兩條序列的羧基端還帶有如seqidno：5所示的氨基酸序列恒定區(qū)，。第四，本發(fā)明還提供了一種編碼上述抗體序列的核苷酸序列，所述編碼序列由seqidno：7所示。第五，本發(fā)明提供了一種含有上述的核苷酸編碼序列的表達載體。優(yōu)選地，所述載體為pmes4。第六，本發(fā)明還提供了一種含有上述表達載體的宿主細胞。優(yōu)選地，所述細胞為大腸桿菌bl21(de3)。最后，本發(fā)明提供了前述的任一抗體在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的vhh結(jié)構(gòu)域、單域抗體以及雙特異性抗體均具有優(yōu)異的抗體識別能力，顯著的adcc效應(yīng)、并具有較長的體內(nèi)半衰期，在體內(nèi)外診斷和藥物制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1.pmes4表達載體結(jié)構(gòu)示意圖；圖2.提取的總rna電泳鑒定圖；圖3.第一輪pcr擴增抗體可變區(qū)基因電泳鑒定圖；圖4.第二輪pcr擴增抗體可變區(qū)基因電泳鑒定圖；圖5.pmes4載體雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物電泳鑒定圖；圖6.菌落pcr鑒定轉(zhuǎn)化子電泳鑒定圖；圖7.納米抗體sds-page鑒定圖；圖8.納米抗體純化sds-page鑒定圖；圖9.融合表達載體pcdna3.1(+)-11c12-2c2構(gòu)建示意圖；圖10.雙特異性納米抗體純化sds-page圖；圖11.融合表達載體pfuse-higg1-fc-11c12-2c2構(gòu)建示意圖；圖12.具有恒定區(qū)的雙特異性單域抗體純化sds-page圖；圖13.單域抗體adcc效應(yīng)曲線；圖14.雙特異性抗體與納米抗體在兔體內(nèi)的代謝曲線圖具體實施方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的保護范圍構(gòu)成任何限制。實施例1抗cea納米抗體噬菌體展示文庫的構(gòu)建及篩選1.1羊駝的免疫：選取健康成年羊駝一只，將重組蛋白cea與弗氏佐劑按1:1的比例混勻，按6-7μg/kg采用背部皮下多點注射的方式免疫羊駝，共免疫四次，免疫間隔為2周。之后采集羊駝外周血，用于構(gòu)建噬菌體展示文庫。1.2駝源淋巴細胞的分離：按照本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)程序從采集的駝源抗凝全血中分析淋巴細胞，每2.5×107個活細胞加入1mlrna分離試劑，取1ml進行rna提取，其余-80℃保存。1.3總rna提?。喊凑毡?br>技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)程序提取總rna，用rnase-free水調(diào)整濃度到1μg/μl(總rna提取電泳鑒定結(jié)果見圖2)。1.4反轉(zhuǎn)錄合成cdna：根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(roche公司的transcriporfirststandcdnasynthesiskit)以1.3步驟獲得的rna為模板進行逆轉(zhuǎn)錄cdna。1.5抗體可變區(qū)基因擴增：將反轉(zhuǎn)錄得到的cdna作為模版進行pcr反應(yīng)。擴增共進行兩輪，第一輪pcr的引物序列如下：call001：gtcctggctgctcttctacaaggcall002：ggtacgtgctgttgaactgttccpcr反應(yīng)條件及程序為：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，30cycles；72℃7min使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒膠回收700bp左右的條帶，最終用水調(diào)整核酸濃度至5ng/μl(第一輪pcr產(chǎn)物鑒定見圖3，其中，1：第一輪pcr產(chǎn)物；m：分子量標記)。第二輪pcr的引物序列如下：vhh-back：gatgtgcagctgcaggagtctggrggaggvhh-for：ctagtgcggccgctggagacggtgacctgggtpcr反應(yīng)條件及程序為：：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，15cycles；72℃7min使用pcr產(chǎn)物回收試劑盒純化pcr產(chǎn)物(第二輪pcr產(chǎn)物鑒定見圖4，其中，1：第二輪pcr產(chǎn)物；m：分子量標記)。1.6載體構(gòu)建將pmes4(購自biovector，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)與第二次pcr產(chǎn)物分別進行psti、bsteii雙酶切，取1.5μg酶切后載體和450ng酶切后的第二次pcr產(chǎn)物，加15μlt4dna連接酶，補充緩沖液和水至150μl總體積，16℃過夜連接并回收連接產(chǎn)物。使用pcr產(chǎn)物回收試劑盒進行產(chǎn)物回收，20μl水洗脫。圖5為pmes4載體雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物電泳鑒定圖(1:pmes4載體雙酶切產(chǎn)物；2：pmes4載體；m：分子量標記)。1.7電轉(zhuǎn)化及庫容測定取10μl純化后的連接產(chǎn)物，加入到含有50μl大腸桿菌tg1感受態(tài)細胞的預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯中置入電轉(zhuǎn)儀(ecm630電轉(zhuǎn)儀，美國btx公司)進行電轉(zhuǎn)化，取出電轉(zhuǎn)杯，復(fù)蘇并培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子。隨機挑選24個克隆，進行菌落pcr鑒定(電泳鑒定見圖6，其中，1-23：23個轉(zhuǎn)化子；n：陰性對照；m：分子量標記)。根據(jù)pcr陽性率推算庫容(庫容量＝克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×[陽性率]pcr鑒定×10)。引物序列如下：mp57：ttatgcttccggctcgtatggiii：ccacagacagccctcatag1.8噬菌體擴增取復(fù)蘇的菌液接種至yt-ag培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)到培養(yǎng)物od600＝0.5。取出10ml菌液加入4×1010vcsm13，37℃靜止感染30min。4000rpm，常溫離心10min，去凈上清。用2×yt-ak(含氨芐青霉素和卡那霉素)培養(yǎng)基重懸菌體，37℃200rpm培養(yǎng)過夜。離心取上清40ml管中，加入10mlpeg/nacl(20％/2.5m)溶液充分混合，離心棄上清，沉淀用1ml冰pbs洗滌離心，取上清250μl預(yù)冷的peg/nacl，充分混勻并洗滌重懸。測定噬菌體滴度：將tg1培養(yǎng)至od600＝0.4，用lb培養(yǎng)基梯度稀釋噬菌體，取倍比稀釋的噬菌體tg1培養(yǎng)物混合培養(yǎng)，次日觀察培養(yǎng)板中噬菌斑形成情況，對噬菌斑數(shù)在30-300的稀釋梯度平板進行計數(shù)并按照下列公式計算噬菌體滴度(pfu)。噬菌體滴度(pfu/ml)＝稀釋倍數(shù)×噬菌斑數(shù)目×1001.9納米抗體篩選通過elisa方法以重組cea抗原篩選陽性克隆。以重組cea抗原包被elisa板，5％bsa封閉，pbst洗滌。每孔加入100μl噬菌體上清液，37℃放置1h。棄上清，加入hrp標記的小鼠抗m13的二抗，37℃放置1h。棄上清，加入tmb溶液，室溫孵育5min，每孔加入2m硫酸終止液，用酶標儀450nm讀數(shù)。1.10納米抗體在大腸桿菌中的表達挑選噬菌體elsia結(jié)果陽性的克隆，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至菌株bl21感受態(tài)細胞，以iptg誘導(dǎo)納米抗體蛋白表達，收集上清(周質(zhì)提取物)，將上清進行sds-page電泳分析，結(jié)果參見圖7(1：分子量標記；2：pmes4空載體對照；3-5：分別為11c12、15e7(該抗體序列公開于cn201611098964.x的抗體vhh-cea1，seqidno.4)、2c2誘導(dǎo)上清)。并將周質(zhì)提取物使用ni-nta樹脂進行純化，使用不同濃度咪唑進行洗脫和收集，將收集的樣品進行還原型蛋白電泳分析，最后將納米抗體透析到pbs中。通過羊駝免疫、細胞分離、噬菌體文庫的構(gòu)建、納米抗體的篩選，共篩選出2株抗cea的納米抗體。用vectornti軟件對測序結(jié)果進行分析，登錄imgt(http://www.imgt.org/imgt_vquest)，對抗體輕鏈和重鏈基因進行分析，以確定可變區(qū)的框架區(qū)(frameworkregions，fr)和互補決定區(qū)(complementaritydeterminingregions，cdr)。納米抗體11c12的重鏈核苷酸序列為seqidno.2所示，可變區(qū)氨基酸序列為seqidno.1所示，其中第1-20位氨基酸序列為fr1，第21-30位氨基酸序列為cdr1，第31-44位氨基酸序列為fr2，第45-61位氨基酸序列為cdr2，第62-93位氨基酸序列為fr3，第94-99位氨基酸序列為cdr3，第105-115位氨基酸序列為fr4。納米抗體2c2的重鏈核苷酸序列為seqidno.4，可變區(qū)氨基酸序列為seqidno.3，其中第1-20位氨基酸序列為fr1，第21-30位氨基酸序列為cdr1，第31-44位氨基酸序列為fr2，第45-61位氨基酸序列為cdr2，第62-94位氨基酸序列為fr3，第95-110位氨基酸序列為cdr3，第111-121位氨基酸序列為fr4。實施例2.抗cea納米抗體的制備2.1納米抗體原始菌株tg1擴增及納米抗體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)將含有納米抗體核酸的原始菌株tg1甘油菌，按照1：1000比例接種于5ml新鮮的lb-a培養(yǎng)基，37℃，200rpm過夜培養(yǎng)。次日，使用plasmidminikit(omega)按照說明書提取質(zhì)粒。經(jīng)驗證后將上述質(zhì)粒1ul轉(zhuǎn)化于100ul感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，在冰上放置30min，42℃水浴熱擊90s，冰浴冷卻3min。向離心管加入600ullb培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60min。取上清100ul，用三角涂布器涂布在lb-a平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。2.2納米抗體的誘導(dǎo)表達和提取挑取上述單克隆菌落于lb-a培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，取該菌液按照1：100比例加入100ml新鮮lb-a培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)3h至菌液od600＝0.8左右，加入終濃度為1mmiptg，30℃誘導(dǎo)過夜。第三日，8000rpm，離心10min收集菌體，加入1.5ml的預(yù)冷tes緩沖液重懸沉淀。冰浴2min后，輕柔振蕩30s，重復(fù)此循環(huán)6次。加3.0mltes/4(將tes用水稀釋4倍)，輕柔振蕩30s后，冰浴靜置2min，同樣重復(fù)振蕩和靜置步驟共6次。9000rpm，4℃離心10min，收集約4.5ml的上清(周質(zhì)提取物)，將上清進行蛋白電泳分析。2.3納米抗體的純化和鑒定將imacsepharose(ge公司)重懸后，取2ml加入到重力柱內(nèi)，靜置30min，使sepharose自然沉降于重力柱底部，流出保存緩沖液。加入2倍柱體積的硫酸鎳溶液(0.1m)，按照約8s/滴的流速流出硫酸鎳溶液；加入10倍柱體積的平衡緩沖液平衡并洗滌sepharose，流速維持不變；將樣品使用平衡緩沖液2倍稀釋后，加入重力柱中，調(diào)節(jié)流速為6s/滴，收集穿透液；加入10倍柱體積洗滌緩沖液洗滌sepharose，維持流速不變，收集洗滌液；加入3倍柱體積的洗脫緩沖液，流速維持在6s/滴，收集含有目的蛋白的洗脫液；最后依次加入10倍柱體積的平衡緩沖液、10倍柱體積的純水和10倍柱體積的20％乙醇洗滌sepharose，并最終保留4ml的20％乙醇以保存柱子。上述收集的樣品分別進行sds-page檢測(參見圖8，1-3：分別為抗體11c12穿透液、低濃度咪唑洗脫雜蛋白及洗脫目的蛋白；4：分子量標記；5-7：分別為抗體2c2穿透液、低濃度咪唑洗脫雜蛋白及洗脫目的蛋白；8-10：分別為抗體15e7穿透液、低濃度咪唑洗脫雜蛋白及洗脫目的蛋白)和westernblot檢測。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的納米抗體對cea抗原具有高度特異的結(jié)合活性，而與nca抗原(非特異性交叉反應(yīng)性蛋白)沒有反應(yīng)。實施例3抗cea納米抗體與cea抗原的親和活性3.1芯片抗原偶聯(lián)將抗原用不同ph的醋酸鈉緩沖液(ph5.5，ph5.0，ph4.5，ph4.0)配制成20ug/ml的工作液，同時準備50mm的naoh再生溶液，利用biacoret100蛋白相互作用分析系統(tǒng)儀器中的模板方法對不同ph條件的抗原與芯片(ge公司)表面之間的靜電結(jié)合進行分析，以信號增加的量達到5倍rl為標準，選擇合適的最偏中性的ph體系并根據(jù)需要調(diào)整抗原濃度作為偶聯(lián)時的條件。按照儀器中自帶的模板方法對芯片進行偶聯(lián)：其中1通道選擇空白偶聯(lián)模式，2通道選擇target偶聯(lián)模式，目標設(shè)置為設(shè)計好的理論偶聯(lián)量。偶聯(lián)過程大概耗時60min。3.2分析物濃度設(shè)置條件探索及再生條件優(yōu)化采取手動進樣模式，選擇1，2通道2-1模式進樣，流速設(shè)置為30ul/min。進樣條件均為120s，30ul/min。再生條件均為30s，30ul/min。首先持續(xù)空走運行緩沖液直至所有基線均穩(wěn)定。準備濃度跨度較大的納米抗體溶液，以運行緩沖液配置，建議設(shè)置200ug/ml，150ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，2ug/ml。準備再生溶液，選擇谷氨酸鹽酸體系四個ph梯度的再生溶液：1.5，2.0，2.5，3.0。手動進樣200ug/ml分析物樣品，觀察2通道，從最偏中性ph的再生緩沖液進行再生，直至2通道再生后的響應(yīng)線回到與基線同一高度。再手動進樣一次200ug/ml分析物樣品，觀察2-1通道的信號變化并記錄結(jié)合量，用上一步中最后使響應(yīng)線回到基線的再生溶液進行再生后，再次收手動進樣200ug/ml分析物樣品，觀察2-1通道的信號變化并記錄結(jié)合量與剛才的結(jié)合量數(shù)值對比，若偏差小于5％，即認為此ph的再生溶液為最佳的再生溶液，若再次進樣的結(jié)合量偏低，則繼續(xù)以更低ph的再生緩沖液進行實驗。以選擇的最佳再生溶液，作為每次進樣后的芯片表面再生試劑。分別進樣上面設(shè)置的分析物濃度樣品，并對每個濃度的結(jié)合量進行分析，最終確定親和力測試所需的濃度梯度。3.3親和力測試按優(yōu)化好的樣品濃度梯度，再生溶液，使用儀器自帶的模板方法(其中設(shè)置進樣條件為60s，30ul/min；解離時間：600s；再生條件：30s，30ul/min)對納米抗體及抗原之間的親和力進行測試。隨時觀察2-1通道的信號情況。親和力測試過程大概耗時200min。3.4結(jié)果分析選擇合適的幾個濃度梯度的結(jié)合解離曲線采用1:1binding的模式對所有曲線進行擬合，最終得到親和力數(shù)值及結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)等重要參數(shù)。表1：納米抗體親和力數(shù)據(jù)樣品親和力11c123.20e-0915e72.40e-092c21.10e-09從表1可以看出，本發(fā)明獲得的這三株抗cea的納米抗體與cea抗原的親和活性在3.20e-09和1.10e-09之間，具有極高的親和力，完全可以在診斷試劑和藥物制備中得到應(yīng)用。實施例4.三種不同納米抗體與cea抗原結(jié)合的重疊實驗4.1抗原飽和濃度的確定以2ug/ml的濃度包被cea抗原，100ul/孔，4℃包被24h，洗板5遍。以1％bsa作為封閉劑過夜封閉，洗板5遍。酶標板中加入不同梯度稀釋的納米抗體，陰性對照(陰性血清1:100)，pbs空白對照，37℃孵育30min，洗板5遍。加入1：4000比例稀釋的hrp標記的羊抗羊駝igg，37℃孵育30min，洗板5遍。加tmb顯色液，37℃孵育10min，2m硫酸終止反應(yīng)。讀取吸光值450nm讀數(shù)，繪制抗體飽和曲線，根據(jù)結(jié)果選擇隨濃度增加讀數(shù)不再增加的濃度為飽和濃度。4.2位點疊加實驗先加入第一種抗體進行反應(yīng)，洗板后再加第二種抗體，洗板后加酶標二抗，tmb顯色讀數(shù)(方法同4.1)。計算兩株抗體疊加率ai，ai>50％說明被測2株抗體抗原位點不同，ai<50％說明被測兩株抗體抗原表位相同，ai值越大，位點重疊可能性越低。公式為：ai＝[2*a(1+2)-(a1+a2)]/a(1+2)*100％a1—第一株抗體讀數(shù)a2—第二株抗體讀數(shù)a(1+2)--疊加2種抗體讀數(shù)表2：抗體抗原表位疊加實驗本實施例的實驗結(jié)果表明，三株納米抗體分別針對cea抗原不同的抗原表位，這預(yù)示著在納米抗體的診斷和治療應(yīng)用上，三株納米抗體可以作為表位互補的組合物聯(lián)合應(yīng)用，從而可以增大診斷或治療的效率。實施例5.雙特異性抗體制備選取11c12和2c2進行蛋白融合表達，將兩個抗體的可變區(qū)融合后送往金唯智公司進行基因合成。合成后的基因兩端保留hindⅲ和ecorⅰ兩個酶切位點，且連接在puc57載體上獲得puc57-11c12-2c2。合成的抗體核苷酸序列為seqidno.6。將融合抗體載體puc57-11c12-2c2與pcdna3.1(+)同時利用hindⅲ和ecorⅰ(neb)進行雙酶切，利用t4連接酶(neb)將雙酶切后的載體與雙納米抗體基因連接過夜，構(gòu)建pcdna3.1(+)-11c12-2c2(載體構(gòu)建示意圖參見圖9)，轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)后利用無內(nèi)毒素大提試劑盒(天根公司)提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染人293細胞，采用陰離子交換層析的方法從293細胞的培養(yǎng)上清中純化雙納米抗體，參見圖10(1：純化后pcdna3.1(+)-11c12-2c2；2：分子量標記)。實施例6.雙特異性抗體與11c12或2c2單株抗體的親和力比較6.1親和力測試按照實施例3的方法優(yōu)化雙特異性抗體、11c12和2c2單株抗體的濃度梯度，按優(yōu)化好的樣品濃度梯度，再生溶液，使用儀器自帶的模板方法(其中設(shè)置進樣條件為60s，30ul/min；解離時間：600s；再生條件：30s，30ul/min)對納米抗體及抗原之間的親和力進行測試。隨時觀察2-1通道的信號情況。親和力測試過程大概耗時200min。6.2結(jié)果分析選擇合適的幾個濃度梯度的結(jié)合解離曲線采用1:1binding的模式對所有曲線進行擬合，最終得到親和力數(shù)值及結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)等重要參數(shù)。表3：雙特異性抗體與單株納米抗體親和力數(shù)據(jù)樣品編號親和力11c123.20e-092c21.99e-0911c12-2c22.12e-10從表3可以看出，本發(fā)明獲得的雙特異性抗體與cea抗原的親和活性明顯高于單株納米抗體的親和活性，具有極高的親和力，完全可以在診斷試劑和藥物制備中得到應(yīng)用。實施例7.帶恒定區(qū)的抗cea雙特異性單域抗體的制備及其誘導(dǎo)的adcc活性測定利用引物，以puc57-11c12-2c2為模板，pcr擴增雙特異性抗體可變區(qū)基因。引物序列如下：f:ccgaaattcgagtctgggggaggr:ggaagatctctgggtcccctggccc利用ecorⅰ和bglii限制性內(nèi)切酶(neb)將pcr產(chǎn)物與融合表達載體pfuse-higg1-fc(恒定區(qū)序列如seqidno.5所示)分別進行雙酶切。利用t4連接酶(neb)將雙酶切后的載體與納米抗體基因連接過夜(參見圖11)，轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)后利用無內(nèi)毒素大提試劑盒(天根公司)提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染人293細胞，采用蛋白a親和層析的方法從293細胞的培養(yǎng)上清中純化帶恒定區(qū)的抗cea雙特異性單域抗體，參見圖12(1：純化帶恒定區(qū)的11c12-2c2；2：分子量標記)。在96孔細胞微孔板內(nèi)培養(yǎng)mkn-45和mkn-74細胞(3×104/孔)48小時，然后根據(jù)特定比例加入lak細胞(淋巴因子激活的殺傷細胞，lymphokineactivatedkillercells)、帶恒定區(qū)的抗cea雙特異性單域抗體、11c12、2c2或者igg抗體對照，lak細胞與靶細胞的比例為1、5、10、15、20:1，抗體濃度均為2μg/ml。在5％co2環(huán)境下37℃孵育6小時，吸去lak細胞和死亡的腫瘤細胞，使用mts方法進行細胞活力測定。細胞毒性(％)＝[實驗靶細胞的od490/對照靶細胞的od490]×100結(jié)果顯示，帶恒定區(qū)的抗cea雙特異性單域抗體、11c12、2c2均能顯著誘導(dǎo)lak細胞的adcc活性，腫瘤細胞裂解率在45-78％之間，在不表達cea的mkn-74細胞中未觀察到這種裂解現(xiàn)象(參見圖13)。實施例8.雙特異性納米抗體在家兔血漿中的代謝本實施例以新西蘭兔為對象，進行藥物代謝動力學(xué)的初步研究，每6只新西蘭兔為一組，采取背部皮下給藥，雙特異性納米抗體和11c12、2c2、的給藥劑量均為1nmol/kg。即雙特異性抗體為30μg/kg，11c12與2c2為15μg/kg。給藥后不同時間點0.5h,1h，2h，4h，8h，12h，18h，24h，36h，48h，60h，72h，84h，96h，120h，144h進行耳緣靜脈取血，分離血清進行抗體滴度的測定(測定使用自制的elisa試劑盒)，繪制藥物滴度時間曲線，見圖14。結(jié)果顯示納米抗體在72h后已經(jīng)基本代謝完畢，納米抗體處于較低水平。而雙特異性抗體在72h后仍然具有很高的濃度，具有治療效果。graphpadprism軟件分析藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見下表。表4.納米抗體和雙特異性抗體的家兔體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)表4中，tmax是指抗體滴度達到最大時的時間；t1/2是指抗體達到最大濃度后代謝掉一半時的時間。從表中可以看到，雙特異性抗體在新西蘭兔體內(nèi)的半衰期長達48小時，明顯長于納米抗體的24小時。序列表<110>深圳市國創(chuàng)納米抗體技術(shù)有限公司<120>抗cea抗原vhh結(jié)構(gòu)域及含有其的雙特異性抗體<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>125<212>prt<213>lamapacos<400>1gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser151015cysalaalaserglyphethrphesersertyrthrglyargtrpasp202530argleualaproglylysgluarggluleuvalalathrilethrser354045thrglyglyserthrasntyralaaspservallysglyargphethr505560ileserargaspasnalalysasnthriletyrleuglnmetthrlys65707580leulysproaspaspthralavaltyrtyrcysvalalahisasngly859095argglytyrpheglyglnglythrglnvalthrvalserseralahis100105110hissergluaspproserserlyscysprolyscyspro115120125<210>2<211>1023<212>dna<213>lamapacos<400>2gagtctggaggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctct60ggattcaccttcagtagctataccgggaggtgggaccgcttggctccagggaaggagcgc120gagttggtcgcaactattactagtactggtggtagtacaaattatgcagactccgtgaag180ggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacgatatatctgcaaatgacgaaa240ctgaaacctgacgacacggccgtgtattactgtgtcgcccataatggtaggggctacttc300ggccaggggacccaggtcaccgtctcctcggcgcaccacagcgaagaccccagctccaag360tgtcccaaatgcccaggccctgagctccttggagggcccacggtcttcatcttccccccg420aaacccaaggacgtcctctccatcacccgaaaacctgaggtcacgtgcgttgtggtggac480gtgggtaaggaagaccctgagatcgagttcagctggtccgtggatgacacagaggtacac540acggctgagacaaagccaaaggaggaacagttcaacagcacgtaccgcgtggtcagcgtc600ctgcccatccagcaccaggactggctgacggggaaggaattcaagtgcaaggtcaacaac660aaagctctcccagcccccatcgagaggaccatctccaaggccaaagggcagacccgggag720ccgcaggtgtacgccctggccccacaccgggaagagctggccaaggacaccgtgagcgta780acctgcctggtcaaaggcttcttcccagctgacatcaacgttgagtggcagaggaacggg840cagccggagtcagagggcacctacgccaccacgctgccccagctggacaacgacgggacc900tacttcctctacagcaaactctccgtgggaaagaacacgtggcagcagggagaagtcttc960acctgtgtggtgatgcacgaggctctacacaatcactccacccagaaatccatctcccag1020tct1023<210>3<211>136<212>prt<213>lamapacos<400>3gluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleuargleuser151015cysalaalaserglyargthrpheserserhisprometglytrpphe202530argglnalaproglylysgluarggluphevalalaglyilesertrp354045serglyglyserthrhistyralaaspservallysglyargphethr505560ileserargaspthralalysasnthrvaltyrleuglnmetasnser65707580leulysprogluaspthralavaltyrtyrcysasnalaalaleuser859095gluargthrproilealathrmetproserglntyrasptyrtrpgly100105110glnglythrglnvalthrvalserseralahishissergluasppro115120125serserlyscysprolyscyspro130135<210>4<211>1056<212>dna<213>lamapacos<400>4gagtctgggggagggttggtgcaggctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctct60ggacgcaccttcagtagtcatcccatggggtggttccgccaggctcccgggaaggagcgt120gaatttgtcgcaggtattagctggagcggtggtagcacacattatgcagactccgtgaag180ggccgattcaccatctccagagacaccgccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagt240ctgaaacctgaggacacggccgtctattactgtaatgcagctttgtctgaaagaactccg300atagcgactatgccatcacagtatgactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcc360tcggcgcaccacagcgaagaccccagctccaagtgtcccaaatgcccaggccctgagctc420cttggagggcccacggtcttcatcttccccccgaaacccaaggacgtcctctccatcacc480cgaaaacctgaggtcacgtgcgttgtggtggacgtgggtaaggaagaccctgagatcgag540ttcagctggtccgtggatgacacagaggtacacacggctgagacaaagccaaaggaggaa600cagttcaacagcacgtaccgcgtggtcagcgtcctgcccatccagcaccaggactggctg660acggggaaggaattcaagtgcaaggtcaacaacaaagctctcccagcccccatcgagagg720accatctccaaggccaaagggcagacccgggagccgcaggtgtacgccctggccccacac780cgggaagagctggccaaggacaccgtgagcgtaacctgcctggtcaaaggcttcttccca840gctgacatcaacgttgagtggcagaggaacgggcagccggagtcagagggcacctacgcc900accacgctgccccagctggacaacgacgggacctacttcctctacagcaaactctccgtg960ggaaagaacacgtggcagcagggagaagtcttcacctgtgtggtgatgcacgaggctcta1020cacaatcactccacccagaaatccatctcccagtct1056<210>5<211>216<212>prt<213>lamapacos<400>5glyprogluleuleuglyglyprothrvalpheilepheproprolys151015prolysaspvalleuserilethrarglysprogluvalthrcysval202530valvalaspvalglylysgluaspprogluilegluphesertrpser354045valaspaspthrgluvalhisthralagluthrlysprolysgluglu505560glnpheasnserthrtyrargvalvalservalleuproileglnhis65707580glnasptrpleuthrglylysgluphelyscyslysvalasnasnlys859095alaleuproalaproilegluargthrileserlysalalysglygln100105110thrarggluproglnvaltyralaleualaprohisargglugluleu115120125alalysaspthrvalservalthrcysleuvallysglyphephepro130135140alaaspileasnvalglutrpglnargasnglyglnprogluserglu145150155160glythrtyralathrthrleuproglnleuaspasnaspglythrtyr165170175pheleutyrserlysleuservalglylysasnthrtrpglnglngly180185190gluvalphethrcysvalvalmethisglualaleuhisasnhisser195200205thrglnlysserileserglnser210215<210>6<211>247<212>prt<213>lamapacos<400>6gluserglyglyglyleuvalglnproglyglyserleuargleuser151015cysalaalaserglyphethrphesersertyrthrglyargtrpasp202530argleualaproglylysgluarggluleuvalalathrilethrser354045thrglyglyserthrasntyralaaspservallysglyargphethr505560ileserargaspasnalalysasnthriletyrleuglnmetthrlys65707580leulysproaspaspthralavaltyrtyrcysvalalahisasngly859095argglytyrpheglyglnglythrglnvalthrvalsersersergly100105110glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyseraspval115120125glnleuglngluserglyglyglyleuvalglnalaglyglyserleu130135140argleusercysalaalaserglyargthrpheserserhispromet145150155160glytrppheargglnalaproglylysgluarggluphevalalagly165170175ilesertrpserglyglyserthrhistyralaaspservallysgly180185190argphethrileserargaspthralalysasnthrvaltyrleugln195200205metasnserleulysprogluaspthralavaltyrtyrcysasnala210215220alaleusergluargthrproilealathrmetproserglntyrasp225230235240tyrtrpglyglnglythrgln245<210>7<211>741<212>dna<213>lamapacos<400>7gagtctggaggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtgcagcctct60ggattcaccttcagtagctataccgggaggtgggaccgcttggctccagggaaggagcgc120gagttggtcgcaactattactagtactggtggtagtacaaattatgcagactccgtgaag180ggccgattcaccatctccagagacaatgccaagaacacgatatatctgcaaatgacgaaa240ctgaaacctgacgacacggccgtgtattactgtgtcgcccataatggtaggggctacttc300ggccaggggacccaggtgaccgtgtcctcctcaggtggtggcggttcaggcggaggtggc360tctggcggtggcggatcggacgtgcagctgcaggagtctgggggagggttggtgcaggct420ggggggtctctgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccttcagtagtcatcccatg480gggtggttccgccaggctcccgggaaggagcgtgaatttgtcgcaggtattagctggagc540ggtggtagcacacattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacacc600gccaagaacacggtgtatctgcaaatgaacagtctgaaacctgaggacacggccgtctat660tactgtaatgcagctttgtctgaaagaactccgatagcgactatgccatcacagtatgac720tactggggccaggggacccag741當(dāng)前第1頁12