本發(fā)明屬于藥物合成領(lǐng)域，具體涉及一類新型四肽環(huán)氧丙烷衍生物及其在藥效學(xué)上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：目前，惡性腫瘤仍然是威脅人們生命的主要疾病之一。癌癥的治療目前雖然已經(jīng)取得了很大的進(jìn)步，但還未能從根本上治療癌癥。目前上市的抗癌藥物雖然具有一定的療效，但它們大多是細(xì)胞毒藥物，具有嚴(yán)重的毒副作用。因此，如何從有效的腫瘤靶點(diǎn)出發(fā)來研究靶向性的新型抗癌藥物成為醫(yī)藥工作者的當(dāng)務(wù)之急。泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasomepathway，簡(jiǎn)稱upp)能夠調(diào)控參與細(xì)胞周期控制的蛋白質(zhì)的水平，這一途徑與癌癥、心腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病等都有重要的關(guān)系。使用一些有效的抑制劑來抑制這一途徑過度降解重要的蛋白質(zhì)將會(huì)為上述疾病的治療提供新的思路。卡非佐米(carfilzomib)用于治療之前接受至少2種藥物(包括硼替佐米和免疫調(diào)節(jié)劑治療)的多發(fā)性骨髓瘤(mm)，是新一代的高度選擇性不可逆蛋白酶體阻斷劑，于2012年7月20日由美國食品與藥物管理局(fda)批準(zhǔn)上市。多個(gè)臨床研究證實(shí)卡非佐米單藥或與其他藥物聯(lián)合治療均具有較強(qiáng)的抗mm作用，毒性小，尤其外周神經(jīng)病變發(fā)生率較低，耐受性好，安全性高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明目的提供一種結(jié)構(gòu)新穎的且具有抑制蛋白酶體功能的環(huán)氧酮類化合物。它們作為20s蛋白酶體抑制劑，能阻斷腫瘤細(xì)胞增殖，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而可用于人和動(dòng)物的多種疾病如惡性腫瘤的治療和預(yù)防。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述化合物的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種上述化合物在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。技術(shù)方案：本發(fā)明公開了一種四肽環(huán)氧丙烷衍生物或其藥物可接受鹽，其結(jié)構(gòu)如式i所示，其中：r1為取代或非取代的c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或者雜環(huán)芳基；r2為取代或非取代的c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或者雜環(huán)芳基；r3為取代或非取代的c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或者雜環(huán)芳基；r4為取代或非取代的c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或者雜環(huán)芳基；z選自以下片段：p為氫，或者為取代或非取代的c1～10的烷基、c1～10的烷氧基、苯基、萘基、四氫萘基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)芳基。優(yōu)選，所述r1、r2、r3和r4為取代基團(tuán)時(shí)，其中取代基為c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、羥基、巰基、氨基、取代氨基或鹵素；p為取代基團(tuán)時(shí)，其中取代基為c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、鹵素或c1～4的鹵代烷基。優(yōu)選，所述雜環(huán)烷基具有3，4，5，6或7個(gè)成環(huán)原子；所述芳基具有4，5，6，7，8，9或10個(gè)成環(huán)原子；所述雜環(huán)芳基具有4，5，6，7，8，9或10個(gè)成環(huán)原子。r1優(yōu)選為c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基等含雜原子的芳香基團(tuán)，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基或鹵素取代；r1更優(yōu)選為c1～10的烷基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、取代氨基或鹵素取代；r1最優(yōu)選為吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、硝基或鹵素取代。r2優(yōu)選為c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)基、苯基、萘基或吲哚基、噻唑基、苯并噻唑基等含雜原子的芳香基團(tuán)，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、取代氨基或鹵素取代；r2更優(yōu)選為c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基或鹵素取代；r2最優(yōu)選為c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、硝基或鹵素取代。r3優(yōu)選為c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基等含雜原子的芳香基團(tuán)，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、取代氨基或鹵素取代；r3更優(yōu)選為c1～10的烷基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基或鹵素取代；r3最優(yōu)選為吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、硝基或鹵素取代。r4優(yōu)選為c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基或雜環(huán)基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基等含雜原子的芳香基團(tuán)，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基、取代氨基或鹵素取代；r4更優(yōu)選為c1～10的烷基、苯基、萘基、吲哚基、噻唑基、噻吩基、苯并噻吩基、咪唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、硝基、羥基、巰基、氨基或鹵素取代；r4最優(yōu)選為c1～10的烷基、苯基、噻唑基，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、硝基或鹵素取代。優(yōu)選，z選自以下片段：p為氫或c1～10的烷?；1～10的烷氧基、芳基或雜環(huán)基(如含有雜原子n、s或o)，或者任選地被c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、鹵素或c1～4的鹵代烷基取代；p優(yōu)選為氫、嗎啉基、異惡唑基、苯基、萘基、四氫萘基、n-丙氧基或異丙氧基。本發(fā)明r1、r2、r3、r4和p基團(tuán)中的“任選地被取代”是指r1、r2、r3、r4和p的基團(tuán)可以被這些基團(tuán)取代，也可以不被這些基團(tuán)取代，即并不僅限于被所列舉的這些基團(tuán)取代的情況，也包括不被所列舉的這些基團(tuán)取代的情況。這種表達(dá)方式與“r1為取代或非取代的c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、苯基、萘基或吲哚基，其中取代基為c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、羥基、巰基、氨基、取代氨基或鹵素”的表達(dá)方式相同，但是取代或非取代的限定并非僅狹義地指c1～10的烷基，而是擴(kuò)大到所有所述的基團(tuán)，即包括取代或非取代的c3～6的環(huán)烷基或雜環(huán)烷基、取代或非取代的芐基、取代或非取代的萘基、取代或非取代的吲哚基等，其中取代基為c1～4的烷基、c1～4的烷氧基、氰基、羥基、巰基、氨基或鹵素。所述“r1為取代或非取代的c1～10的烷基、c3～6的環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或者雜環(huán)芳基”，是指：例如r1為取代的c1～10的烷基時(shí)，該烷基的某些基團(tuán)還被其他基團(tuán)取代，r1為非取代的c1～10的烷基時(shí)，該烷基的基團(tuán)沒有被其他基團(tuán)取代。術(shù)語“烷基”用于表示飽和烴基，c1～10的烷基是指含有1～10個(gè)碳原子的飽和烴基，c1～4的烷基是指含有1～4個(gè)碳原子的飽和烴基。術(shù)語“環(huán)烷基”指非芳族碳環(huán)基，包括環(huán)化的烷基。環(huán)烷基可以包括二環(huán)或多環(huán)系統(tǒng)。環(huán)烷基的例子包括環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基，c3～6的環(huán)烷基是指含有3～6個(gè)碳原子的環(huán)烷基。術(shù)語“芐基”是指苯甲基，取代的芐基是指在芐基的苯環(huán)上至少一個(gè)氫原子被非氫部分取代，芐基的取代基可以是鹵素，-cn，-oh，-sh，-nh2，1-6個(gè)碳的直鏈或支鏈烷基，1-6個(gè)碳的取代的直鏈或支鏈烷基。術(shù)語“雜環(huán)烷基”是指非芳族雜碳環(huán)基，包括環(huán)化的烷基，其中一個(gè)或多個(gè)成環(huán)碳原子被雜原子例如o，n或s原子取代。本發(fā)明雜環(huán)烷基優(yōu)選具有3，4，5，6或7個(gè)成環(huán)原子。術(shù)語“雜環(huán)芳基”是指含有雜原子o、n或s的環(huán)狀芳香基團(tuán)，如呋喃、噻吩、苯并噻吩、吡咯、噻唑、惡唑、咪唑、吡啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪、喹啉、異喹啉、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、吖啶等。本發(fā)明雜環(huán)芳基優(yōu)選具有4，5，6，7，8，9或10個(gè)成環(huán)原子?！巴檠趸笔侵?o-烷基基團(tuán)，其碳原子數(shù)一般為1～10個(gè)。烷氧基的例子包括甲氧基，乙氧基，丙氧基(如，n-丙氧基和異丙氧基)，t-丁氧基等。“芳基”是指芳族碳環(huán)基，包括單環(huán)或多環(huán)芳烴例如苯基，萘基，蒽基，菲基等。本發(fā)明芳基優(yōu)選具有4，5，6，7，8，9或10個(gè)成環(huán)原子?！胺佳趸笔侵?o-芳基，而芳基的概念如上所述，芳氧基最優(yōu)選的例子是苯氧基?！胞u素”包括氟，氯，溴和碘。本發(fā)明化合物中的r1、r2、r3、r4基團(tuán)取代的氨基酸(合成用原料)可以為消旋體，也可以具有光學(xué)活性，本發(fā)明中的r1、r2、r3、r4基團(tuán)取代的氨基酸優(yōu)選為s構(gòu)型。本發(fā)明優(yōu)選的化合物為：本發(fā)明還公開了所述四肽環(huán)氧丙烷衍生物或其藥物可接受鹽的制備方法，其總的制備路線為：該反應(yīng)式中各基團(tuán)p，r1，r2，r3，r4,z的定義如前所述，式(i-1)，(i-2)在縮合劑作用下反應(yīng)得到式(i-3)，式(i-3)在三氟乙酸作用下生成(i-4)。式(i-4)，(i-5)在縮合劑作用下生成式(i-6)，式(i-6)在三氟乙酸作用下生成(i-7)，其中式(i-7)再和p基團(tuán)取代的羧酸在肽縮合劑的作用下反應(yīng)生成式(i-8)，式(i-8)在lioh和水作用下生成(i)。以下詳述本發(fā)明化合物的制備方法：p，r1，r2，r3，r4,z的定義如前所述?；衔?i)的制備方法包括如下的步驟：1)式(i-1)結(jié)構(gòu)的氨基酸和式(i-2)結(jié)構(gòu)的氨基酸甲酯在縮合劑作用下得到式(i-3)結(jié)構(gòu)的化合物；2)式(i-3)結(jié)構(gòu)的化合物溶于dcm后，加入三氟乙酸，反應(yīng)生成式(i-4)結(jié)構(gòu)的化合物。3)式(i-4)結(jié)構(gòu)的化合物和式(i-5)結(jié)構(gòu)的氨基酸在縮合劑作用下縮合生成式(i-6)結(jié)構(gòu)的化合物。4)式(i-6)結(jié)構(gòu)的化合物和三氟乙酸反應(yīng)得到式(i-7)結(jié)構(gòu)的化合物；5)式(i-7)結(jié)構(gòu)的化合物和化合物(i-8)在縮合劑作用下縮合生成式(i-9)結(jié)構(gòu)的化合物。6)式(i-9)結(jié)構(gòu)的化合物經(jīng)皂化反應(yīng)得到(i)結(jié)構(gòu)的化合物。最后將化合物(i)和(ii)在一定的縮合劑存在下反應(yīng)生成(ⅲ)。所用縮合劑為1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(縮寫為edc.hcl)，或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷縮寫為(pybop)，1-羥基苯并三氮唑(縮寫為hobt)。本發(fā)明還提供了所述四肽環(huán)氧丙烷衍生物或其藥物可接受鹽在制備治療炎癥、癌癥、過度增殖性疾病或者免疫相關(guān)性疾病的藥物方面的用途。此外，還提供了四肽環(huán)氧丙烷衍生物或其藥物可接受鹽在改變生物體中蛋白酶體產(chǎn)生的各種抗原肽方面的用途。酶抑制劑的用途有多種蛋白酶體抑制的生物效應(yīng)。據(jù)報(bào)道，在細(xì)胞水平上，用各種蛋白酶體抑制劑處理細(xì)胞后，出現(xiàn)多泛蛋白化蛋白的累積、細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞凋亡。抑制蛋白酶體也被建議作為一種可能的抗腫瘤治療策略。在抗腫瘤化合物篩選中首先鑒定出epoxomicin，證實(shí)了蛋白酶體是抗腫瘤化療藥物靶。因此，這些化合物可用于治療癌癥。還把抑制蛋白酶體與抑制nf-κb激活和穩(wěn)定p53水平聯(lián)系起來。因此，本發(fā)明化合物還可用于抑制nf-κb激活以及穩(wěn)定細(xì)胞培養(yǎng)物中的p53水平。由于nf-κb是炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，所以它是抗炎治療干預(yù)的富有吸引力的靶。因此，本發(fā)明化合物可用于治療慢性炎癥相關(guān)性疾病，包括但不限于copd、銀屑病、支氣管炎、肺氣腫和囊性纖維化。本公開化合物可用于治療蛋白酶體的蛋白水解功能直接介導(dǎo)的病癥(例如肌肉廢用)或者通過蛋白酶體加工的蛋白質(zhì)(例如nf-κb)間接介導(dǎo)的病癥。蛋白酶體參與蛋白質(zhì)(例如酶)的快速消除和翻譯后加工，所述蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞調(diào)節(jié)(例如細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄和代謝途徑)、胞間通訊和免疫反應(yīng)(例如抗原呈遞)。下文闡述的具體例子包括；β-淀粉狀蛋白和調(diào)節(jié)蛋白，例如細(xì)胞周期蛋白、tgf-β和轉(zhuǎn)錄因子nf-κb。本發(fā)明的其它實(shí)施方案涉及惡病質(zhì)和肌肉萎縮病。蛋白酶體降解成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞和生長中成纖維細(xì)胞內(nèi)的許多蛋白。在缺乏胰島素或血清的細(xì)胞中，蛋白水解速率幾乎加倍。抑制蛋白酶體可減少蛋白水解作用，由此減少肌肉蛋白損失以及腎或肝的氮負(fù)荷。本發(fā)明抑制劑可用于治療癌癥、慢性傳染病、發(fā)熱、肌肉廢用(萎縮)和去神經(jīng)、神經(jīng)損傷、禁食、酸中毒相關(guān)性腎衰竭、糖尿病和肝衰竭等疾病。參見例如goldberg的美國專利5,340,736。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括以下方法：降低細(xì)胞的肌肉蛋白降解速率；降低胞內(nèi)蛋白降解速速率；降低細(xì)胞的p53蛋白降解速速率；以及抑制p53相關(guān)性癌生長。上述方法都包括使細(xì)胞(體內(nèi)或體外，例如患者的肌肉)與有效量的本發(fā)明化合物(例如藥物組合物)接觸。蛋白酶體加工的另一種蛋白是rel蛋白家族的成員nf-κb。rel家族的轉(zhuǎn)錄激活蛋白可以分為兩組。第一組需要蛋白酶解加工，包括p50(nf-κb1，105kda)和p52(nf-κ2、100kda)。第二組不需要蛋白酶解加工，包括p65(rela、rel(c-rel)和relb)。同二聚體和雜二聚體均可由rel家族成員形成；例如，nf-κb是p50-p65雜二聚體。iκb和p105在磷酸化和泛蛋白化后，這兩種蛋白分別被降解和加工，從而產(chǎn)生活性nf-κb，nf-κb從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。泛蛋白化p105也由純化的蛋白酶體加工(palombella等，cell(1994)78：773-785)。活性nf-κb與其它轉(zhuǎn)錄激活因子以及例如hmgi(y)形成立體特異性增強(qiáng)子復(fù)合物，誘導(dǎo)選擇性表達(dá)特定基因。nf-κb調(diào)節(jié)涉及免疫、炎癥反應(yīng)和有絲分裂事件的基因。例如，免疫球蛋白輕鏈κ基因、il-2受體α鏈基因、i類主要組織相容性復(fù)合體基因以及編碼例如il-2、il-6、粒細(xì)胞集落刺激因子和ifn-β的許多細(xì)胞因子基因的表達(dá)都需要nf-κb(palombella等，cell(1994)78：773-785)。本發(fā)明部分實(shí)施方案包括影響il-2、mhc-i、il-6、tnfα、ifn-β或任何其它前述蛋白的表達(dá)水平的方法，每種方法都包括給予患者有效量的本公開化合物。包括p50的復(fù)合體是急性炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)的快速介質(zhì)(thanos，d.和maniatis，t.，cell(1995)80：529-532)。nf-κb還參與編碼e-選擇蛋白、p-選擇蛋白、icam和vcam-1的細(xì)胞粘附基因的表達(dá)(collins，t.，lab.invest.(1993)68：499-508)。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是抑制細(xì)胞粘附(例如e-選擇蛋白、p-選擇蛋白、icam或vcam-1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附)的方法，該方法包括使細(xì)胞與有效量的本發(fā)明化合物(或藥物組合物)接觸，或者給予患者有效量的本發(fā)明化合物(或藥物組合物)。胞內(nèi)蛋白水解產(chǎn)生用于呈遞給t淋巴細(xì)胞的小肽，從而誘導(dǎo)i類mhc介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。免疫系統(tǒng)篩選被病毒感染或已經(jīng)歷癌轉(zhuǎn)化的自體細(xì)胞。一個(gè)實(shí)施方案是抑制細(xì)胞的抗原呈遞的方法，該方法包括使細(xì)胞與本發(fā)明化合物接觸。本發(fā)明化合物可以用于治療免疫相關(guān)性疾病，例如變態(tài)反應(yīng)、哮喘、器官/組織排斥反應(yīng)(移植物抗宿主病)和自身免疫疾病，包括但不限于狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化和炎性腸病(例如潰瘍性結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎)。因此，另一實(shí)施方案是抑制患者免疫系統(tǒng)的方法(例如抑制移植排異反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)、自身免疫疾病和哮喘)，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明化合物。再一個(gè)實(shí)施方案是改變由蛋白酶體或其它具有多催化活性的ntn產(chǎn)生的抗原肽庫的方法。例如，如果20s蛋白酶體的pgph活性被選擇性抑制，由該蛋白酶體產(chǎn)生并用mhc分子呈遞到細(xì)胞表面的抗原肽組，不相同于沒有任何酶抑制作用或者例如該蛋白酶體的胰凝乳蛋白酶樣活性被選擇性抑制這兩種情況任一種所產(chǎn)生和呈遞的抗原肽組。某些蛋白酶體抑制劑在體外和體內(nèi)阻斷泛蛋白化nf-κb的降解和加工。蛋白酶體抑制劑還阻斷iκb-α降解和nf-κb激活(palombella等，cell(1994)78：773-785；traenckner等，emboj.(1994)13：5433-5441)。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是抑制iκb-α降解的方法，該方法包括使細(xì)胞與本發(fā)明化合物接觸。另一實(shí)施方案是降低nf-κb在細(xì)胞、肌肉、器官或患者中的細(xì)胞含量的方法，該方法包括使細(xì)胞、肌肉、器官或患者與本發(fā)明化合物接觸。需要蛋白酶解加工的其它真核轉(zhuǎn)錄因子包括通用轉(zhuǎn)錄因子tfiia、單純皰疹病毒vp16輔助蛋白(宿主細(xì)胞因子)、病毒誘導(dǎo)性ifn調(diào)節(jié)因子2蛋白以及結(jié)合膜的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1。本發(fā)明的其它實(shí)施方案是影響細(xì)胞周期蛋白依賴性真核細(xì)胞周期的方法，該方法包括使細(xì)胞(體外或體內(nèi))與本發(fā)明化合物接觸。細(xì)胞周期蛋白涉及細(xì)胞周期調(diào)控。蛋白酶體參與細(xì)胞周期蛋白的降解。細(xì)胞周期蛋白的實(shí)例包括有絲分裂細(xì)胞周期蛋白、g1細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白b。細(xì)胞周期蛋白的降解使得細(xì)胞退出一個(gè)細(xì)胞周期階段(例如有絲分裂)，而進(jìn)入另一個(gè)階段(例如分裂)。人們認(rèn)為所有的細(xì)胞周期蛋白都與p34.sup.cdc2蛋白激酶或相關(guān)激酶締合。蛋白水解靶向信號(hào)定位于氨基酸42-raalgnisen-50(降解框)。有證據(jù)表明，細(xì)胞周期蛋白被轉(zhuǎn)化為易被泛蛋白連接酶破壞的形式，或者細(xì)胞周期蛋白特異性連接酶在有絲分裂期間被激活(ciechanover，a.，cell，(1994)79：13-21)。抑制蛋白酶體可抑制細(xì)胞周期蛋白降解，從而抑制例如細(xì)胞周期蛋白相關(guān)性癌癥中的細(xì)胞增殖(kumatori等，proc.natl.acad.sci.usa(1990)87：7071-7075)。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案是治療患者增殖性疾病(例如癌癥、銀屑病或再狹窄)的方法，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明化合物。本發(fā)明還包括治療患者細(xì)胞周期蛋白相關(guān)性炎癥的方法，該方法包括給予患者治療有效量的本發(fā)明化合物。另外一些實(shí)施方案是影響癌基因蛋白的蛋白酶體依賴性調(diào)節(jié)的方法以及治療或抑制癌生長的方法，每種方法都包括使細(xì)胞(體內(nèi)，例如患者體內(nèi)，或者體外)與本發(fā)明化合物接觸。hpv-16和hpv-18-衍生的e6蛋白在粗制網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中刺激p53的atp-和泛蛋白-依賴性綴合和降解。已經(jīng)證實(shí)，具有突變不耐熱e1的細(xì)胞系中隱性癌基因p53在非許可溫度下累積。高水平的p53可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由泛蛋白系統(tǒng)降解的原癌基因蛋白實(shí)例包括c-mos、c-fos和c-jun。一個(gè)實(shí)施方案是治療p53相關(guān)性細(xì)胞凋亡的方法，該方法包括給予患者有效量的本發(fā)明化合物。最后，本發(fā)明化合物還可作為診斷試劑(例如用于診斷試劑盒或臨床實(shí)驗(yàn)室)，用于篩選ntn水解酶(包括蛋白酶體)加工的蛋白(例如酶、轉(zhuǎn)錄因子)。本發(fā)明化合物還可作為研究用試劑用于特異性結(jié)合x/mb1亞基或α鏈以及抑制與其相關(guān)的蛋白水解活性。例如，可以測(cè)定蛋白酶體其它亞基的活性(及其特異性抑制劑)。大多數(shù)細(xì)胞蛋白在成熟或激活期間都要進(jìn)行蛋白酶解加工。本文公開的酶抑制劑可用于測(cè)定細(xì)胞、發(fā)育或生理過程或輸出量是否受到特定ntn水解酶的蛋白水解活性的調(diào)節(jié)。一種這樣的方法包括獲取生物體、完整細(xì)胞制備物或細(xì)胞提取物；使所述生物體、細(xì)胞制備物或細(xì)胞提取物接觸本發(fā)明化合物；使接觸了本發(fā)明化合物的生物體、細(xì)胞制備物或細(xì)胞提取物發(fā)信號(hào)，然后監(jiān)測(cè)所述過程或輸出量。本發(fā)明化合物的高度選擇性允許在特定的細(xì)胞、發(fā)育或生理過程中快速、準(zhǔn)確地消除或影響ntn(例如20s蛋白酶體)。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包含所述四肽環(huán)氧丙烷衍生物或其藥物可接受鹽以及藥物可接受載體。給藥根據(jù)待治療疾病和患者的年齡、健康狀況和體重，按照本文所述方法制備的化合物可以按各種不同的形式給藥，這是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，當(dāng)化合物準(zhǔn)備用于口服給藥時(shí)，它們可以配制為片劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑或糖漿劑；或者用于胃腸外給藥時(shí)，可以配制為注射劑(靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下)、輸注制劑或栓劑。通過眼粘膜途徑給藥時(shí)，它們可以配制為滴眼劑或眼膏劑。這些制劑可以通過常規(guī)方法制備，必要時(shí)，活性成分可以與任何常規(guī)添加劑或賦形劑(例如粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、增溶劑、懸浮劑、乳化劑、包衣劑、環(huán)糊精和/或緩沖劑)混合。盡管劑量將取決于患者的癥狀、年齡和體重、所要治療或預(yù)防的疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、給藥途徑和藥物形式，但是一般來講，本發(fā)明化合物對(duì)成人患者的推薦日劑量為0.01mg-2000mg，可作為單劑量或多個(gè)分劑量給予。與載體混合制備單劑量形式的活性成分量通常是可產(chǎn)生治療效果的化合物量。就特定患者上的治療效果而言，獲得最佳療效的精確給藥時(shí)間和/或組合物劑量將取決于具體化合物的活性、藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度、患者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對(duì)特定劑量的反應(yīng)以及藥物類型)、給藥途徑等。無論如何，以上的準(zhǔn)則可用作精確調(diào)整療法的基礎(chǔ)，例如確定最佳的給藥時(shí)間和/或給藥劑量，這僅僅需要常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，包括監(jiān)測(cè)患者和調(diào)節(jié)劑量和/或給藥時(shí)間。本文所用術(shù)語“藥物可接受”是指那些配體、原料、組合物和/或劑型在合理的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)，適合與人體組織和動(dòng)物組織接觸，而不會(huì)有過度的毒性、刺激性、變態(tài)反應(yīng)或者其它問題或并發(fā)癥，同時(shí)具有合理的利益/風(fēng)險(xiǎn)比。本文所用術(shù)語“藥物可接受載體”是指藥物可接受原料、成分或溶媒，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包囊材料。所有載體都必須是“可接受的”，即與制劑的其它制劑成分是相容的，并且對(duì)患者沒有害處?？捎米魉幬锟山邮茌d體的部分實(shí)例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉以及取代或未取代的β環(huán)糊精；(3)纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀黃蓍膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，例如可可油和栓劑用蠟；(9)油，例如花生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；(10)二元醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無熱原水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏液(ringer’ssolution)；(19)乙醇；(20)磷酸鹽緩沖溶液；(21)藥物制劑中使用的其它無毒相容性物質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明藥物組合物是非致熱的，即在給予患者后不會(huì)引起明顯的體溫升高。術(shù)語“藥物可接受鹽”是指抑制劑的相對(duì)無毒的無機(jī)酸加成鹽和有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可以在抑制劑的最終分離和純化時(shí)在原位制備，或者使游離堿形式的純化抑制劑單獨(dú)與合適的有機(jī)酸或無機(jī)酸反應(yīng)，然后分離由此形成的鹽。代表性的鹽包括氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、萘甲酸鹽(naphthylate)、甲磺酸鹽、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基磺酸鹽和氨基酸鹽等。(參見例如berge等，(1977)“pharmaceuticalsalts”，j.pharm.sci.66：1-19)。在其它情況下，用于本發(fā)明方法的抑制劑可包含一個(gè)或多個(gè)酸性官能團(tuán)，因此，能夠與藥物可接受堿形成藥物可接受鹽。在這些情況下，術(shù)語“藥物可接受鹽”是指抑制劑的相對(duì)無毒的無機(jī)堿加成鹽和有機(jī)堿加成鹽。這些鹽同樣可以在抑制劑的最終分離和純化時(shí)在原位制備，或者使游離酸形式的純化抑制劑單獨(dú)與合適的堿(例如藥物可接受金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、氨或者藥物可接受有機(jī)伯胺、仲胺或叔胺反應(yīng)。代表性的堿金屬鹽或堿土金屬鹽包括鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽和鋁鹽等?？捎糜谛纬蓧A加成鹽的代表性有機(jī)胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(參見例如berge等，出處同上)。組合物中也可以加入潤濕劑、乳化劑和潤滑劑(例如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂)以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑、增香劑、防腐劑和抗氧劑。藥物可接受抗氧劑例子包括：(1)水溶性抗氧劑，例如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧劑，例如棕櫚酸維生素c酯、丁羥茴醚(bha)、丁羥甲苯(bht)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。適合口服給藥的制劑可以為膠囊劑、扁囊劑、丸劑、片劑、錠劑(使用經(jīng)調(diào)味的基質(zhì)，通常用蔗糖和阿拉伯樹膠或西黃蓍膠)、散劑、顆粒劑，或者為水性或非水性液體中的溶液劑或混懸劑，或者為水包油或油包水的液體乳劑，或者為酏劑或糖漿劑，或者為軟錠劑(使用惰性基質(zhì)，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或?yàn)槭趧┑?，所有劑型都包含預(yù)定量的抑制劑作為活性成分。組合物還可以大丸劑、沖劑或糊劑給藥。在口服固體劑型中(膠囊劑、片劑、丸劑、糖錠、散劑、顆粒劑等)，活性成分與一種或多種藥物可接受載體混合，例如檸檬酸鈉或磷酸二鈣和/或以下任何載體：(1)填充劑或增量劑，例如淀粉、環(huán)糊精、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合劑，例如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；(3)保濕劑，例如甘油；(4)崩解劑，例如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸鹽和碳酸鈉；(5)溶解遲延劑，例如石蠟；(6)吸收促進(jìn)劑，例如季銨化合物；(7)潤濕劑，例如乙酰醇和單硬脂酸甘油酯；(8)吸附劑，例如高嶺土和膨潤土；(9)潤滑劑，例如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉及其混合物；(10)著色劑。在為膠囊劑、片劑和丸劑時(shí)，藥物組合物還可包含緩沖劑。相似類型的固體組合物也可以在軟質(zhì)和硬質(zhì)填充明膠膠囊劑中用作填充劑，使用諸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等賦形劑。片劑可以通過壓制或模制制備，任選使用一種或多種助劑。壓制片劑可以使用粘合劑(例如明膠或羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如羥基乙酸淀粉鈉或交聯(lián)羧甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑制備。通過將惰性液體稀釋劑潤濕的粉末狀抑制劑混合物在合適的機(jī)器中模壓，可制備模制片劑。片劑和其它固體劑型(例如糖錠、膠囊劑、丸劑和顆粒劑)可以任選被刻痕或者制備為具有包衣和外殼，例如腸溶衣和制藥領(lǐng)域公知的其它包衣。它們也可以配制為用于緩釋或控釋活性成分，使用例如不同比例的羥丙基甲基纖維素、其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體以提供所需釋放速率。它們可以通過例如以下方式滅菌：通過細(xì)菌過濾器過濾，或者摻入無菌固體形式的滅菌劑，它可以在臨用前溶于無菌水或某些其它無菌注射介質(zhì)。這些組合物還可任選包含遮光劑，可以是僅僅或者優(yōu)先在胃腸道某些部位釋放活性成分的組合物，并且任選采用延遲釋放方式?？梢允褂玫陌窠M合物例子包括聚合物和蠟。活性成分也可為微膠囊形式，適當(dāng)時(shí)，具有一種或多種上述賦形劑。口服液體劑型包括藥物可接受乳劑、微乳劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑和酏劑。除活性成分以外，液體劑型還可以包含本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑，例如水或其它溶劑、增溶劑和乳化劑，例如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油類(尤其是棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯和它們的混合物。除惰性稀釋劑以外，口服組合物還可包含輔劑，例如潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、香味劑和防腐劑。除活性成分以外，混懸劑還可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和山梨聚糖酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂、西黃蓍膠和它們的混合物。直腸或陰道給藥制劑可以為栓劑，可通過將一種或多種抑制劑與一種或多種無刺激的合適賦形劑或載體混合而制備栓劑，所述賦形劑或載體包括例如可可油、聚乙二醇、栓劑用蠟或水楊酸酯，它們?cè)谑覝叵率枪腆w，而在體溫下是液體，因此，將在直腸或陰道腔中熔融，釋放活性劑。適合陰道給藥的制劑還包括陰道栓劑、棉塞、乳膏劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧劑，這些制劑中包含本領(lǐng)域已知的合適載體。局部或透皮給予抑制劑的劑型包括散劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、溶液劑、貼劑和吸入劑?；钚猿煞挚梢栽跓o菌條件下與藥物可接受載體和任何必需的防腐劑、緩沖劑或拋射劑混合。除抑制劑以外，軟膏劑、糊劑、乳膏劑和凝膠劑還可包含賦形劑，例如動(dòng)物和植物油脂、油類、蠟、石蠟、淀粉、西黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨潤土、硅酸、滑石粉、氧化鋅或它們的混合物。除抑制劑以外，散劑和噴霧劑還可包含賦形劑，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氫氧化鋁、硅酸鈣、聚酰胺粉末或者這些物質(zhì)的混合物。噴霧劑還可包含常用的拋射劑，例如含氯氟烴和揮發(fā)性無取代烴，例如丁烷和丙烷。抑制劑還可通過氣霧劑給予。這可以通過制備含有所述組合物的水性氣霧劑、脂質(zhì)體制劑或固體顆粒而實(shí)現(xiàn)?？梢允褂梅撬?例如碳氟化合物拋射劑)懸浮液。優(yōu)選采用聲波霧化器，因?yàn)樗鼈兡軌蜃钚』梢鸹衔锝到獾募羟辛?。通常，通過將藥物的水性溶液或懸浮液與常規(guī)的藥物可接受載體和穩(wěn)定劑一起配制，制備水性氣霧劑。載體和穩(wěn)定劑根據(jù)具體組合物的要求而變化，但是通常包括非離子型表面活性劑(吐溫、pluronic、山梨聚糖酯、卵磷脂、cremophor)、藥物可接受助溶劑(例如聚乙二醇)、無害蛋白(如血清白蛋白)、油酸、氨基酸(例如甘氨酸)、緩沖劑、鹽、糖或糖醇。氣霧劑通常用等滲溶液制備。在控制給予身體抑制劑方面，透皮貼劑具有更多的優(yōu)勢(shì)。將藥物溶于或分散于合適介質(zhì)中可制備這樣的劑型。還可以使用吸收促進(jìn)劑來增加抑制劑穿過皮膚的通量。這樣的遷移速率可以通過速率調(diào)控膜控制，或者通過將抑制劑分散到聚合物基質(zhì)或凝膠中來控制。適合胃腸外給藥的本發(fā)明藥物組合物包含一種或多種抑制劑以及一種或多種藥物可接受無菌水性或非水性溶液、分散體、懸浮液或乳液，或者在臨用前可重建為無菌注射溶液或分散液的無菌粉末，它們可包含抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑、使制劑與預(yù)定接受者血液等滲的溶質(zhì)、懸浮劑或增稠劑?？稍诒景l(fā)明藥物組合物中使用的合適水性和非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、它們的合適混合物、植物油(例如橄欖油)和注射用有機(jī)酯，例如油酸乙酯。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可以通過例如以下方式維持：使用包衣材料(例如卵磷脂)，對(duì)分散體可維持其所需的粒徑，以及使用表面活性劑。這些組合物還可以包含輔劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。加入各種不同的抗細(xì)菌劑和抗真菌劑可以防止微生物作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。組合物中也可能需要張力調(diào)節(jié)劑例如糖、氯化鈉等。另外，通過加入延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鋁和明膠)可延長注射藥物制劑的吸收。在某些情況下，為了延長藥物效果，需要減緩皮下或肌內(nèi)注射藥物的吸收速率。例如，通過將藥物溶解或懸浮于油溶媒來延遲胃腸外給予的藥物的吸收。通過在生物可降解聚合物(例如聚交酯-聚乙交酯)中形成抑制劑的微膠囊基質(zhì)來制備注射貯庫制劑。根據(jù)藥物與聚合物的比例和所用的具體聚合物性質(zhì)，可以調(diào)控藥物的釋放速率。其它生物可降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酐)。也可通過將藥物包封于與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳中，制備貯庫注射制劑。藥物制劑可以通過口服、胃腸外、局部或直腸給藥。當(dāng)然，是以適合各種給藥途徑的劑型給予。例如，它們以片劑或膠囊劑形式給予，通過注射劑、吸入劑、洗眼劑、軟膏劑、栓劑、輸液劑給予；用洗劑或軟膏劑局部給予；用栓劑直腸給予。優(yōu)選口服給藥。本文所用術(shù)語“胃腸外給予”是指除腸內(nèi)和局部給藥以外的給藥方式，通常是指注射和輸注給予，注射包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射。本文所用術(shù)語“全身給予”和“外周給予”是指配體、藥物或其它物質(zhì)不是直接給予進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這樣它們進(jìn)入患者全身，并且因此經(jīng)歷代謝或其它類似過程，例如皮下給予。這些抑制劑可以給予人或其它動(dòng)物用作治療目的，可采用任何合適的給藥途徑，包括口服、經(jīng)鼻(例如用噴霧劑)、直腸、陰道內(nèi)、胃腸外、腦池內(nèi)和局部(例如用散劑、軟膏劑或滴劑，包括口腔含服和舌下給藥)。不管選擇哪種給藥途徑，本發(fā)明抑制劑(可以使用其合適的水合形式)和/或本發(fā)明藥物組合物可以通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法配制為藥物可接受劑型?？梢愿淖儽景l(fā)明藥物組合物活性成分的實(shí)際劑量水平，從而針對(duì)具體患者、組合物和給藥方式，獲得活性成分實(shí)現(xiàn)所需治療反應(yīng)而不會(huì)使患者中毒的有效量。藥物可接受混合物中本發(fā)明化合物的濃度將根據(jù)多種因素變化，包括所給予化合物的劑量、所用化合物的藥代動(dòng)力學(xué)特征和給藥途徑。一般來講，本發(fā)明組合物可作為含約0.1-10％w/v本發(fā)明化合物的水溶液劑提供，用于胃腸外給藥。典型劑量為每天約0.01mg/kg體重至約50mg/kg體重，分1-4次給予。各分劑量中可以包含相同或不同的本發(fā)明化合物。給藥劑量一定是有效劑量，有效劑量將取決于多種因素，包括患者的總的健康狀況、所選化合物的制劑和給藥途徑。本發(fā)明另一方面提供聯(lián)合療法，其中一種或多種其它治療藥物與本發(fā)明蛋白酶體抑制劑一起給予。這類聯(lián)合療法可以通過同時(shí)、序貫或單獨(dú)給予治療各組分實(shí)現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物與一種或多種其它蛋白酶體抑制劑聯(lián)合給予。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物與化療藥聯(lián)合給予。合適的化療藥可包括天然產(chǎn)品，例如長春花屬生物堿(即長春花堿、長春新堿和長春瑞濱)、紫杉醇、表鬼臼毒素(epidipodophyllotoxin)(即依托泊苷、替尼泊苷)、抗生素(更生霉素(放線菌素d)、柔紅霉素、多柔比星和伊達(dá)比星)、蒽環(huán)霉素類、米托蒽醌、博來霉素、普卡霉素(光輝霉素)和絲裂霉素、酶(l-天冬酰胺酶，它系統(tǒng)性代謝l-天冬酰胺，清除不能合成自己的天冬酰胺的細(xì)胞)；抗血小板藥；抗增殖/抗有絲分裂的烷基化劑，例如氮芥類(氮芥、環(huán)磷酰胺及其類似物、美法侖、苯丁酸氮芥)、氮丙啶類和甲基三聚氰胺類(六甲蜜胺和噻替派)、磺酸烷基酯類(白消安)、亞硝基脲類(卡莫司汀(bcnu)及其類似物、鏈佐星)、trazenes-達(dá)卡巴嗪(dacarbazinine)(dtic)；抗增殖/抗有絲分裂類抗代謝藥例如葉酸類似物(甲氨蝶呤)、嘧啶類似物(氟尿嘧啶、氟尿苷和阿糖胞苷)、嘌呤類似物及相關(guān)抑制劑(巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁和2-氯脫氧腺苷)；芳香酶抑制劑(阿那曲唑、依西美坦和來曲唑)；鉑配位絡(luò)合物(順鉑、卡鉑)、丙卡巴肼、羥基脲、米托坦、氨魯米特；組蛋白去乙酰酶(hdac)抑制劑(曲古抑菌素、丁酸鈉、apicidan、辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilidehydroamicacid))；激素(即雌激素)和激素類激動(dòng)劑，例如促黃體生成激素釋放激素(lhrh)激動(dòng)劑(戈舍瑞林、亮丙瑞林和曲普瑞林)。其它化療藥物可包括氮芥、喜樹堿、異環(huán)磷酰胺、他莫昔芬、雷洛西芬、吉西他濱、諾維本或者前述藥物的任何類似物或衍生物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物與細(xì)胞因子聯(lián)合給予。細(xì)胞因子包括但不限于干擾素-γ、-α和-β、白細(xì)胞介素1-8、10和12-粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、tnf-α和-β、tgf-β。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物與類固醇聯(lián)合給予。合適的類固醇包括但不限于21-乙酸基孕烯醇酮、阿氯米松、阿爾孕酮、安西奈德、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯潑尼松、氯倍他索、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯(difuprednate)、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、氟尼縮松、氟輕松、醋酸氟輕松、氟可丁丁酯、氟可龍、氟米龍、醋酸氟培龍、醋酸氟潑尼定、氟潑尼龍、氟氫縮松、丙酸氟替卡松、福莫可他、哈西奈德、丙酸鹵倍他索、鹵米松、氫化可的松、氯替潑諾碳酸乙酯、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼松、甲潑尼龍、糠酸莫米松、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼松龍、潑尼松龍25-二乙基氨基醋酸酯、潑尼松龍磷酸鈉、潑尼松、強(qiáng)的松龍戊酸酯、潑尼立定、利美索龍、替可的松、曲安西龍、曲安奈德、苯曲安奈德、己曲安奈德和它們的鹽和/或衍生物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明化合物與免疫治療劑聯(lián)合給藥。合適的免疫治療劑包括但不限于mdr調(diào)節(jié)劑(維拉帕米、伐司樸達(dá)(valspordar)、比立考達(dá)、tariquidar、laniquidar)、環(huán)孢菌素、沙利度胺和單克隆抗體。單克隆抗體可以是裸單克隆抗體或者綴合單克隆抗體，例如利妥昔單抗、托西莫單抗、阿侖單抗、依帕珠單抗、替伊莫單抗、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumabozogamicin)、貝伐單抗、西妥昔單抗、埃羅替尼和曲妥珠單抗。具體實(shí)施方式第一部分化合物的合成本發(fā)明的化合物的制備可按照如下過程實(shí)施：一、化合物(i)的制備1、化合物(i-3)的制備：將化合物(i-1)，hobt溶解在無水dcm中在-5℃攪拌10min后，在此溫度下加入edihcl，攪拌15～20min，再加入化合物(i-2)攪拌15～20min，隨后加入dipea攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用稀hcl，碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物(i-3)。2、化合物(i-4)的制備：將化合物(i-3)溶解在無水dcm中，在-5℃下緩慢滴加tfa，攪拌0.5小時(shí)候后，升到室溫?cái)嚢?小時(shí)后檢測(cè)。反應(yīng)完畢，濃縮反應(yīng)液得到棕紅色油狀物，緩慢加入甲基叔丁基醚劇烈攪拌得到白色固體，過濾得到化合物(i-4)。3、化合物(i-6)的制備：將化合物(i-5)，hobt溶解在無水dcm中在-5℃攪拌10min后，在此溫度下加入edihcl，攪拌15～20min，再加入化合物(i-4)攪拌15～20min，隨后加入dipea攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用稀hcl，碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物(i-6)。4、化合物(i-7)的制備：將化合物(i-6)溶解在無水dcm中，-5℃下緩慢滴加tfa，攪拌0.5小時(shí)后，升到室溫?cái)嚢?小時(shí)后檢測(cè)。反應(yīng)完畢，濃縮反應(yīng)液得到棕紅色油狀物，緩慢加入甲基叔丁基醚劇烈攪拌得到白色固體，過濾得到化合物(i-7)。5、化合物(i-9)的制備：將p基團(tuán)取代的羧酸(i-8)，hobt溶解在無水dcm中在-5℃攪拌10min，在此溫度下加入edihcl，攪拌15～20min，再加入化合物(i-7)攪拌15～20min，隨后加入dipea攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用稀hcl，碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物(i-9)?；衔?i)的制備：將化合物(i-9)溶解在meoh/h2o中，0℃下滴加lioh水溶液，攪拌2小時(shí)，升到室溫反應(yīng)一定時(shí)間，加水并用鹽酸調(diào)ph到6-7，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得化合物(i)。二、化合物(ii)的制備1、化合物(ii-2)的制備：將化合物(ii-1)、hobt溶于dcm，加入edc.hcl，-5℃攪拌15min后，加入二甲羥胺鹽酸鹽，15min后加入dipea，低溫下反應(yīng)25min，室溫反應(yīng)結(jié)束后，用dcm萃取，有機(jī)相用1nhcl洗，5％nahco3洗，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑得到化合物(ii-2)。2、化合物(ii-3)的制備：將化合物(ii-2)用四氫呋喃溶解，-20℃下，滴加乙基溴化鎂，滴畢升至室溫反應(yīng)，結(jié)束后，緩慢滴加1n稀鹽酸淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮得化合物(ii-3)。3、化合物(ii-4)的制備：將化合物(ii-3)用四氫呋喃溶解，加入乙酸哌啶鹽和哌啶，分批加多聚甲醛，回流3h后，加適量水后用乙酸乙酯萃取，分別用1n稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮后得化合物(ii-4)。4、化合物(ii-5)的制備：化合物(ii-4)溶于甲苯，加異丙醇鋁、異丙醇，50℃反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用水和乙酸乙酯萃取，用1n稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮后得化合物(ii-5)。5、化合物(ii-6)的制備：化合物(ii-5)溶于dcm，然后加入乙酰丙酮釩，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，冰浴冷卻至0℃，緩慢滴加過氧叔丁醇。反應(yīng)結(jié)束后，加適量水后用二氯甲烷萃取，分別用飽和硫代硫酸鈉，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮純化后得化合物(ii-6)。6、化合物(ii-7)的制備：化合物(ii-6)溶于二甲基亞砜，加入二異丙基乙胺，冰浴下分批加入吡啶三氧化硫，升至室溫反應(yīng)，反應(yīng)至完全，加適量水后用乙酸乙酯萃取，分別用1n稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮后得化合物(ii-7)。7、化合物(ii)的制備：將化合物(ii-7)溶解在無水dcm中，在-5℃下緩慢滴加tfa，攪拌0.5小時(shí)候后，升到室溫?cái)嚢?小時(shí)后檢測(cè)。反應(yīng)完畢，濃縮反應(yīng)液得到棕紅色油狀物，緩慢加入甲基叔丁基醚劇烈攪拌得到白色固體，過濾得到化合物(ii)。三、化合物(iii)的制備化合物(iii)的制備：將化合物(i)，hobt溶解在無水dcm中在-5℃攪拌10min后，在此溫度下加入edihcl，攪拌15～20min，再加入化合物(ⅱ)攪拌15～20min，隨后加入dipea攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用稀hcl，碳酸氫鈉溶液，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物(ⅲ)。以下以具體化合物的合成來描述本發(fā)明的化合物制備過程：一、酸片段的制備：以n-2-嗎啉乙酰基-l-噻唑丙氨?；?l-亮氨?；?l-苯丙氨酸的制備為例:將化合物1(3.22g,13.91mmol),hobt(2.82g,20.87mmol)溶解在無水dcm(100ml)中，在-5℃攪拌10min后，在此溫度下加入edihcl(4.0g,20.87mmol)攪拌15～20min，再加入化合物2(3.0g，13.91mmol)攪拌15～20min，隨后加入dipea(10ml,62.60mmol)攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入冰水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用0.4nhcl，5％naco3碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物3。將化合物3(6.79g,17.29mmol)，溶解在無水dcm(100ml)中，在-5℃下于緩慢滴加tfa(11.37ml)，攪拌0.5小時(shí)后，升到室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)完畢，濃縮反應(yīng)液得到棕紅色油狀物，緩慢加入甲基叔丁基醚劇烈攪拌得到白色固體，過濾得到化合物4。將化合物5(5g,18.4mmol),hobt(3.73g,27.6mmol)溶解在無水dcm(100ml)中在-5℃攪拌10min后，在此溫度下加入edihcl(5.32g,27.6mmol)攪拌15～20min，再加入化合物4(7.48g,18.4mmol)攪拌15～20min，隨后加入dipea(20ml,124.2mmol)攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入冰水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用0.4nhcl，5％naco3碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物6。將化合物6(6.6g,12.1mmol)溶解在無水dcm(100ml)，-5℃下緩慢滴加tfa(10ml)，攪拌0.5小時(shí)后，升到室溫?cái)嚢?小時(shí)。反應(yīng)完畢，濃縮反應(yīng)液得到棕紅色油狀物，緩慢加入甲基叔丁基醚劇烈攪拌得到白色固體，過濾得到化合物7。將化合物8(2.67g,18.4mmol),hobt(3.74g,27.6mmol)溶解在無水dcm(100ml)中在-5℃攪拌10min后，在此溫度下加入edihcl(5.32g,27.6mmol)攪拌15～20min，再加入化合物7(7.48g,18.4mmol)攪拌15～20min，隨后加入dipea(12.16ml，73.6mmol)攪拌20分鐘，移至室溫反應(yīng)。反應(yīng)完全后，傾入冰水中，用dcm萃取，合并有機(jī)相后分別用0.4nhcl，5％naco3碳酸氫鈉，飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物9。將化合物9(9.6g,16.7mmol)溶于meoh/h2o(200ml/50ml)中，0℃下滴加lioh·h2o(1.01g,23.38mmol)在h2o(10ml)溶液，攪拌2小時(shí)，升到室溫反應(yīng)一定時(shí)間，加水并用鹽酸調(diào)ph到6-7，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，蒸干溶劑，得到化合物10，收率89％,m.p.:177-178；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ0.81–0.73(m,3h),0.85(t,j＝10.2hz,3h),1.25(d,j＝4.5hz,2h),1.60–1.49(m,j＝7.1hz,1h),2.19(s,8h),2.70(s,2h),3.27(s,2h),3.79(d,j＝12.5hz,2h),4.33(s,1h),4.67(s,1h),4.79(s,1h),7.13(s,1h),7.26–7.15(m,4h),7.27(s,1h),7.41(s,1h),8.49(s,1h),8.65(s,1h),8.71(d,j＝4.9hz,1h)；ms(esi)m/z:674.0[m+h]+.。本發(fā)明中所有酸片段化合物的合成方法和10相似。合成的具體化合物及其名稱如下表。二、胺片段的制備：以化合物(s)-2-氨基-4-甲基-1-((r)-2-甲基環(huán)氧乙烷-2-基)戊-1-酮2,2,2-三氟乙酸鹽(38)的制備為例：將化合物31(10.0g,43.23mmol)、hobt(5.8g,43.23mmol)溶于dcm(100ml)，加入edc.hcl(11.65g,64.85mmol)，-5℃攪拌15min后，加入二甲羥胺鹽酸鹽(4.21g,43.23mmol)，15min后加入dipea(13.97g,108.08mmol)，低溫下反應(yīng)25min，室溫反應(yīng)結(jié)束后，用dcm萃取，有機(jī)相1nhcl洗，5％nahco3洗，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑得到化合物32。稱取n-叔丁氧羰?；?l-亮氨酸-n’-甲氧基-n’-甲酰胺32(0.5mol)置于反應(yīng)瓶中，用500ml四氫呋喃溶解，-20℃下，滴加乙基溴化鎂(2.0m，750ml)，滴畢升至室溫過夜。緩慢滴加1n稀鹽酸淬滅反應(yīng)，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮得33。稱取33(0.4mol)，用400ml四氫呋喃溶解，加入乙酸哌啶鹽(1.5mol)和哌啶(1.0mol)和多聚甲醛(2.0mol)，回流3h后，再加入多聚甲醛(2.0mol)，tlc檢測(cè)反應(yīng)至完全，加適量水后用乙酸乙酯萃取，分別用1n稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相干燥濃縮后得34。稱取異丙醇鋁(0.3mol)和異丙醇(3mol)，加入200ml甲苯及34(0.3mol)，用100ml甲苯溶解，室溫下滴加進(jìn)反應(yīng)體系，滴畢，于50℃反應(yīng)，tlc檢測(cè)反應(yīng)至完全，加適量水后用乙酸乙酯萃取，分別用1n稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌1次，有機(jī)相干燥濃縮后得35。稱取35(0.2mol)，加200ml二氯甲烷溶解，然后加入乙酰丙酮釩(0.04mol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，冰浴冷卻至0℃，緩慢滴加過氧叔丁醇，加倍強(qiáng)力攪拌過夜，tlc檢測(cè)原料消失，加適量水后用二氯甲烷萃取，分別用飽和硫代硫酸鈉，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮純化后得36。將36(0.12mol)溶于100ml二甲基亞砜，加入二異丙基乙胺(0.24mol)，冰浴下分批加入吡啶三氧化硫(0.24mol)，升至室溫反應(yīng)，tlc檢測(cè)反應(yīng)至完全，加適量水后用乙酸乙酯萃取，分別用1n稀鹽酸，飽和食鹽水洗滌，有機(jī)相干燥濃縮后得37。將化合物37(1.0g,3.69mmol)溶解在無水dcm(10ml)，中在-5℃下于緩慢滴加tfa(3ml)，攪拌0.5小時(shí)候后，升到室溫?cái)嚢?小時(shí)后檢測(cè)。反應(yīng)完畢，濃縮反應(yīng)液得到棕紅色油狀物，緩慢加入甲基叔丁基醚劇烈攪拌得到白色固體，過濾得到化合物38。本發(fā)明中39～42合成方法和38合成方法類似。合成的具體化合物及其名稱如下表。三、式(ⅲ)化合物的制備以n-2-嗎啉乙?；?l-噻唑丙酰-l-亮氨酰-l-苯丙酰-l-亮氨酰-甲基環(huán)氧乙烷(43)的制備為例：將化合物10(7g，10.55mmol)、hobt(21.3g，15.83mmol)溶于dcm，加入edchcl(3g，15.83mmol)，-5℃攪拌15min后，加入39(2.8g,10.55mmol)，15min后加入dipea(4ml，4.75mmol)，低溫下反應(yīng)25min，室溫反應(yīng)結(jié)束后，用dcm萃取，有機(jī)相1nhcl洗，5％nahco3洗，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，蒸去溶劑得到化合物43，收率30％，m.p.:108-109℃；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ0.80(-ch3,ddd,j＝15.3,9.0,4.9hz,6h),0.90(-ch3,dt,j＝8.5,4.2hz,6h),1.25(-ch3,s,3h),1.28(-ch,d,1h),1.33(-ch,d,j＝4.1hz,1h),1.50(-ch2,d,j＝3.9hz,2h),1.64(-ch2,s,2h),2.48(-ch3,t,3h),2.87(-ch2,d,j＝5.1hz,1h),3.05–2.97(-ch2,m,3h),3.26–3.07(-ch2,m,2h),3.37–3.27(-ch2,m,2h),3.72(-ch2,t,4h),4.31–4.20(-ch,m,1h),4.74–4.49(-ch,m,3h),6.42(-conh,d,j＝7.1hz,1h),6.57(-conh,d,j＝8.1hz,1h),7.12(-ph,d,j＝1.9hz,1h),7.15(-ph,s,1h),7.17(-ph,d,j＝1.4hz,1h),7.25–7.19(-ph,m,3h),7.27(-ph,d,j＝3.1hz,1h),8.36(-conh,d,j＝6.4hz,1h),8.78(-conh,d,j＝2.0hz,1h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ16.63,21.20,21.54,22.89,23.29,24.65,24.97,29.61,32.59,36.93,39.88,40.32,49.98,52.19,52.25,52.75,53.74,53.8858.96,61.70,66.84,116.18,126.71,128.39,129.12,136.96,152.36,153.42,170.66,170.73,170.88,171.78,207.87；ms(esi)m/z:714.0[m+h]+,736.1[m+na]+；hrmscalcdforc36h52n6nao7s,[m+na]+735.35504,found735.35104.。本發(fā)明中所有化合物的合成方法與43類似。合成的具體化合物及其名稱如下表。第二部分抑制蛋白酶體活性測(cè)定一、蛋白酶體抑制活性本發(fā)明利用熒光多肽底物suc-leu-leu-val-tyr-amc(簡(jiǎn)寫suc-llvy-amc，suc表示琥珀?；琣mc表示7-酰胺-4-甲基香豆素)來測(cè)定蛋白酶體的糜蛋白酶樣酶活性。本發(fā)明所用的蛋白酶體為人紅細(xì)胞20s蛋白酶體，酶、熒光底物及測(cè)試緩沖液均購自enzo公司。實(shí)驗(yàn)體系為16μl，其中底物8μl，蛋白酶體4μl(0.8ng)，最終濃度為50μm，藥物(抑制劑)4μl，最終濃度為2×10-6m～4.88×10-10m,最后一個(gè)濃度是0m，實(shí)際配置濃度為8×10-6m～1.95×10-9m，最后一個(gè)濃度是0m。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：1、藥物配置：稱取藥物，加入dmso溶解至濃度為10-2m。用移液槍吸取2μl加至98μldmso得到2×10-4m，然后再從2×10-4m濃度藥物中吸取8μl加入198μlh2o中得到8×10-6m，利用同樣的方法得到2×10-6m、5×10-7m、1.25×10-7m、3.12×10-8m、7.8×10-9m、1.95×10-9m濃度的藥物，最后一個(gè)濃度0m為不加藥。2、底物制備：將25mg熒光多肽底物溶解于654μldmso中，得到50mm儲(chǔ)備液，于-20℃保存，使用時(shí)稀釋500倍，每份樣品中加入8μl，使得反應(yīng)體系中的最終底物濃度為50μm。3、反應(yīng)體系制備：用緩沖溶液將20s蛋白酶體由2ng/μl稀釋成濃度為8ng/μl的溶液，加入到384孔熒光酶標(biāo)板中，每孔加入4μl，再在每孔中加入4μl待測(cè)樣品，使用已上市藥物carfilzomib為陽性對(duì)照藥，37℃下反應(yīng)15min。反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入8μl熒光底物，37℃避光反應(yīng)1小時(shí)，利用360nm/460nm熒光酶標(biāo)儀(bmglabtechpolarstaroptimamicroplatereader)檢測(cè)熒光值。4、數(shù)據(jù)處理計(jì)算扣除本底物后不同濃度的藥物作用下所得產(chǎn)物的熒光值,運(yùn)用graphpadprism軟件，計(jì)算藥物對(duì)蛋白酶體抑制的ic50濃度。化合物編號(hào)ic50(nm)化合物編號(hào)ic50(nm)化合物編號(hào)ic50(nm)4322.3057>20007144.3144354.175824.687218.024523.295917.767312.884634.416023.437429.464740.896114.9575>20004826.70629.737620.614930.976317.8677>200050812.166415.5478na5151.526520.157961.765230.606612.3580164.715352.796727.37carfilzomib11.425462.4168na5511.566921.455617.247016.31二、細(xì)胞株抑制活性本發(fā)明利用的檢測(cè)液為單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)盒，來自promega公司；所用的細(xì)胞為u266，rpmi8226。實(shí)驗(yàn)體系為110ul，其中含有細(xì)胞懸液90μl，檢測(cè)液10μl，藥物(抑制劑)10μl，其終濃度為4.54×10-8m～1.77×10-9m，最后一個(gè)濃度是0m，實(shí)際配置濃度為5×10-7m～1.95×10-8m，最后一個(gè)濃度是0m。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：1、藥物配置：準(zhǔn)確稱量藥物，加入dmso溶解至10-2m。用移液器吸取1μl加至199μldmso得到5×10-5m，然后從5×10-5m濃度藥物中吸取3.3μl加326.7μl無血清的rpmi1640培養(yǎng)基得到5×10-7m，1.5倍梯度稀釋，得到3.3×10-7m、2.2×10-7m、1.48×10-7m、9.87×10-8m、6.58×10-8m、4.38×10-8m、2.92×10-8m、1.95×10-8m濃度的藥物，最后一個(gè)濃度0m為不加藥。2、細(xì)胞懸液配置：細(xì)胞分別計(jì)數(shù)后，稀釋配置u266為1×104個(gè)/孔，rpmi8226為1×104個(gè)/孔。3、反應(yīng)體系制備：96孔熒光酶標(biāo)板中每孔加入細(xì)胞懸液90μl，孵育24h；然后每孔中加入10μl待測(cè)樣品，使用已上市藥物carfilzomib為陽性對(duì)照藥，孵育24h；反應(yīng)完畢后，每孔加入10μl檢測(cè)液，孵育2-3h，490nm熒光酶標(biāo)儀(bmglabtechpolarstaroptimamicroplatereader)檢測(cè)吸光度。4、數(shù)據(jù)處理計(jì)算扣除本底后不同濃度藥物作用下所得產(chǎn)物的吸光度,運(yùn)用graphpadprism軟件，計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞毒性的ic50濃度(nm)。部分化合物的結(jié)果如下表：編號(hào)rpmi8226u266b1編號(hào)rpmi8226u266b14327.5924.467054.3745.385542.2250.887187.4480.985625.5236.947277.7056.875946.9545.487323.2616.456035.2833.17452.9055.956114.6923.18carfilzomib39.0935.726764.9150.81三、化合物毒性比較本發(fā)明中化合物43和73在尾靜脈給藥劑量15mg/kg下，2組各5只icr實(shí)驗(yàn)鼠未出現(xiàn)死亡等嚴(yán)重的毒副作用，給藥后一周體重略有降低，但第10天后體重恢復(fù)；而對(duì)照藥carfilzomib在給藥劑量10mg/kg下，給藥一次后5只icr實(shí)驗(yàn)鼠全部死亡，因此本發(fā)明中的化合物毒性明顯低于對(duì)照化合物。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：1、藥物配制稱取0.2110g的一水合檸檬酸置于燒杯中，用量筒量取100ml生理水緩慢加入燒杯中，溶解后轉(zhuǎn)移至容器中，配置成10mm檸檬酸緩沖液。稱取4mg的受試物至于燒杯中，用量筒量取4ml的10mm檸檬酸緩沖液加入燒杯，調(diào)ph到2-3后，超聲至受試物溶解后，得到1mg/ml的受試物溶液。稱取4mg的carfilzomib粉末置于研缽中，加入少量10％磺丁基-β-環(huán)糊精研磨，用10mm檸檬酸緩沖液加至4ml，得到1mg/ml的carfilzomib受試物溶液。2、給藥方案種系：icr小鼠性別：雄性周齡：6-8周；衛(wèi)生級(jí)別：spf級(jí)來源/產(chǎn)地：上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司3、監(jiān)測(cè)指標(biāo)：自給藥之日起每日定時(shí)測(cè)量小鼠體重，觀察呼吸、活動(dòng)力、毛色、以及死亡情況等。4、數(shù)據(jù)處理：統(tǒng)計(jì)小鼠體重，通過spss19.0進(jìn)行相應(yīng)計(jì)算，分析組間差異。四、溶解度實(shí)驗(yàn)將本發(fā)明中化合物43、73和carfilzomib分別溶解在ph2.0磷酸緩沖液、ph4.0醋酸緩沖液、ph6.8磷酸緩沖液和純水中，形成飽和溶液。采用hplc進(jìn)行定量測(cè)定飽和溶解度，結(jié)果見下表。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，化合物43和73在不同ph的溶媒和水中溶解性明顯好于陽性藥carfilzomib。本發(fā)明中所設(shè)計(jì)的化合物的治療劑量可以根據(jù)給藥的方式、治療的用途、病人的健康狀況以及醫(yī)生的處方而決定。組合藥物中本發(fā)明所設(shè)計(jì)的化合物的濃度和所占比例將隨多種因素而改變，包括給藥途徑、給藥劑量以及化學(xué)特性(如疏水性)。例如，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的化合物可以提供于用于非腸道給藥的含大約0.1到10％w/v化合物的水性生理緩沖液中。一些常規(guī)的劑量范圍為每天大約1μg/kg到1g/kg。在具體實(shí)施方案中，劑量范圍從每天大約10μg/kg體重到100mg/kg體重。劑量會(huì)根據(jù)給藥途徑、病人的健康狀態(tài)、疾病或失調(diào)的類型和進(jìn)展程度、化合物的相對(duì)生物學(xué)效價(jià)以及賦形劑的配方而改變。有效的劑量可以從體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)的劑量反應(yīng)曲線推算出。當(dāng)前第1頁12