百日咳桿菌fha抗原單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品及制備領域，具體涉及百日咳桿菌FHA抗原單克隆抗體及其 應用。
【背景技術】
[0002] 百日咳是由百日咳桿菌（BordetellaPertussis)引起的嚴重急性呼吸道傳染病， 主要感染5歲以下兒童，對于未免疫或未完成基礎免疫程序的兒童，百日咳仍是導致其死 亡的主要原因。百日咳是可以通過疫苗預防的傳染病，全球自20世紀50-60年代廣泛使用 全細胞百日咳疫苗（WP)以來，尤其是1974年全球?qū)嵤U大免疫規(guī)劃（EPI)后，百日咳的 流行得到有效控制，發(fā)病率和死亡率明顯下降。但是，接種全細胞百日咳疫苗（WP)可能產(chǎn) 生一定的不良反應，比如嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥等，嚴重的甚至導致死亡。1981年日本首 先研制成功無細胞百日咳疫苗（AP)，含有百日咳毒素和絲狀血凝素，替代了百日咳全菌體； 其不良反應明顯低于WP，目前AP與白喉和破傷風疫苗組成的聯(lián)合疫苗DTaP已成為許多國 家兒童聯(lián)合免疫的基礎?，F(xiàn)已通過美國食品藥品管理局（FDA)批準的三聯(lián)DTaP聯(lián)合疫苗 主要有：賽諾菲巴斯德公司（SanofiPasteus，SP)的Tripedia?和Daptacel?，葛蘭素史克 公司（GlaxoSmithKline，GSK)的Infanrix?。
[0003] 百日咳桿菌的抗原組份主要包含百日咳毒素（PertussisToxin，PT)、絲狀血清 素（FilamentousHemagglutinin，F(xiàn)HA)、凝集原（Agglutinogen，Agg) 2, 3 和百日咳黏著素 (Pertactin，PRN)，在無細胞百日咳疫苗中主要包含上述組分，其中PT和FHA屬于主要組 份。
[0004]目前《中華人民共和國藥典》2010年版三部中對于含有無細胞百日咳成分的聯(lián)合 疫苗中有效抗原（FHA等）的鑒別實驗，主要是通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA)，而具有高度 特異性的FHA單克隆抗體可以大大提高實驗的準確性和可靠性；同時藥典中對于百日咳抗 原含量的測定主要包括蛋白氮含量測定、SDS-PAGE純度測定以及效價測定。其中，蛋白氮含 量測定以及SDS-PAGE法測定不是特異性檢測方法，無法特異性區(qū)分PT、FHA、PRN，在三種組 分混合的百日咳疫苗以及DTaP疫苗中，上述方法無法用于FHA成分的檢測，而效價實驗步 驟復雜、過程較長且需要大量實驗動物，不利于疫苗生產(chǎn)過程中對于各個步驟FHA含量的 監(jiān)測，也違背WHO關于減少動物使用量的原則。因此使用高度特異性的FHA單克隆抗體采用 ELISA法對于百日咳FHA純化各個步驟樣品以及百日咳類疫苗成品中FHA抗原含量進行檢 測，將大大提高檢測的準確性、特異性和工作效率，降低試驗的時間成本和資金成本。目前 存在的FHA單抗都是將純化后抗原免疫小鼠，制備雜交瘤細胞，該方法制備的單抗經(jīng)過多 步純化過程，蛋白變性后復性等步驟可能導致蛋白空間構(gòu)象變化，免疫原性遭到部分破壞， 致使以其為免疫原制備得到的單抗僅能夠識別該空間構(gòu)象已發(fā)生變化的抗原，而無法識別 全真抗原（原始抗原）。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是突破目前DTaP疫苗生產(chǎn)過程各個步驟以及成品中對于FHA抗原 含量檢測方法特異性差、檢測效率低的缺點，提供一種效價高、均一度高、具有良好特異性、 穩(wěn)定性的低成本的百日咳桿菌FHA抗原單克隆抗體，實現(xiàn)降低成本、提高百日咳疫苗生產(chǎn) 過程中質(zhì)控的準確性和效率的目標。
[0006] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種百日咳桿菌FHA抗原單克隆抗體雜交瘤細胞 株，其保藏編號為CGMCCNo. 10589。
[0007] 所述雜交瘤細胞株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter，CGMCC)，地址北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCCNo. 10589， 保藏日期2015年5月4日，分類命名為：百日咳桿菌FHA抗原單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0008] 本發(fā)明提供了所述雜交瘤細胞株在制備檢測百日咳桿菌FHA抗原試劑盒中的應 用或在制備檢測百日咳桿菌FHA抗體試劑盒中的應用。
[0009] 本發(fā)明還提供了由上述雜交瘤細胞株分泌產(chǎn)生的單克隆抗體。
[0010] 具體而言，本發(fā)明采用小鼠骨髓瘤細胞雜交瘤技術制備抗百日咳桿菌FHA抗原單 克隆抗體，步驟如下：
[0011] (1)制備百日咳桿菌發(fā)酵液。
[0012] (2)動物免疫：收集菌體，研磨，然后將研磨后的百日咳桿菌菌體與弗氏佐劑等比 例混合并乳化；乳化后〇. 2iig/只腹腔免疫小鼠。
[0013] (3)加強免疫；首次免疫后2周，對小鼠進行2次加強免疫，劑量和佐劑用量同上。 免疫后采用間接酶聯(lián)免疫法檢測抗體效價，如果抗體效價大于1〇 3,則進行研磨抗原的腹腔 沖擊，0. 2yg/只，否則繼續(xù)加強免疫。
[0014] (4)取腹腔沖擊3天后的免疫后小鼠的脾臟，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0按 1:10~10:1的比例混合，于37°C水浴滴加50%PEG4000進行細胞融合；然后緩慢加入無 血清培養(yǎng)基2ml洗滌2次融合后的細胞，再加入完全培養(yǎng)基2ml重懸，將細胞懸液100y1/ 孔加入到細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)，培養(yǎng)后添加HAT培養(yǎng)液2ml。
[0015] (5)雜交瘤細胞長到瓶底的50%以上時，ELISA法檢測細胞上清中的抗體效價。篩 選出特異性針對百日咳桿菌FHA抗原的、高效價的雜交瘤細胞株，擴大培養(yǎng)建庫，凍存，并 將該雜交瘤細胞株進行生物保藏。
[0016] (6)將凍存的工作種子庫細胞復蘇，培養(yǎng)到細胞覆蓋瓶底的50%以上時搖下細 胞，計數(shù)，腹腔免疫小鼠，制備腹水。
[0017] 本發(fā)明還提供包含上述單克隆抗體的試劑盒。
[0018] 所述試劑盒中，所述單克隆抗體經(jīng)生物標記或化學標記。
[0019] 進一步地，所述單克隆抗體經(jīng)酶標記。
[0020] 進一步地，所述單克隆抗體經(jīng)辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記。
[0021] 所述試劑盒中，所述單克隆抗體可以不經(jīng)過生物標記或化學標記，而是通過添加 生物標記或化學標記的抗鼠二抗進行試驗。
[0022] 進一步地，所述抗鼠二抗經(jīng)酶標記。
[0023] 進一步地，所述抗鼠二抗經(jīng)辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標記。
[0024] 所述試劑盒中，單克隆抗體可以用于包被。
[0025] 進一步地，所述試劑盒添加生物標記或化學標記的夾心抗體。
[0026] 進一步地，所述試劑盒也可以添加夾心抗體后，再加入生物標記或化學標記的抗 夾心抗體的二抗。
[0027] 所述的試劑盒用于百日咳桿菌FHA抗原的檢測。
[0028] 本發(fā)明提供了雜交瘤細胞株CGMCCNo. 10589分泌的單克隆抗體在制備檢測百日 咳桿菌抗原試劑盒中的應用。
[0029] 進一步地，所述百日咳桿菌抗原為百日咳桿菌PHA抗原。
[0030] 本發(fā)明提供了雜交瘤細胞株CGMCCNo. 10589分泌的單克隆抗體在制備檢測百日 咳桿菌抗體試劑盒中的應用。
[0031] 進一步地，所述百日咳桿菌抗體為百日咳桿菌PHA抗體。
[0032] 本發(fā)明提供了雜交瘤細胞株CGMCCNo. 10589分泌的單克隆抗體在制備預防或治 療百日咳桿菌感染藥物中的應用。
[0033] -種治療或預防百日咳桿菌感染引起的疾病的藥物，其含有本發(fā)明所述的單克隆 抗體。
[0034] 保藏編號為CGMCCNo. 10589的雜交瘤細胞株或其分泌產(chǎn)生的百日咳FHA抗原單 克隆抗體在制備百日咳疫苗中的應用。
[0035] 本發(fā)明提供了所述單克隆抗體在百日咳疫苗質(zhì)量檢測中的應用。
[0036] 本發(fā)明還提供所述單克隆抗體在檢測百日咳桿菌FHA抗原含量中的應用。
[0037] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點和效果：
[0038] 1、本發(fā)明采用百日咳全菌體作為免疫原進行免疫，保證抗原決定簇的完整性和的 高免疫原性，篩選得到了能夠穩(wěn)定分泌特異性針對百日咳桿菌FHA抗原的單克隆抗體的雜 交瘤細胞株。
[0039] 2、本發(fā)明的百日咳桿菌FHA抗原單克隆抗體腹水，具有較高的效價，效價高于108， 同時具有較好的特異性，可以用于FHA抗原純化過程中各個工序段含有FHA組分樣品中FHA 抗原含量的檢測，也可用于DTaP疫苗成品以及其他混合成分中的FHA抗原含量的測定。同 時，該單抗可以用于靈敏度更高的雙抗體夾心ELISA檢測方法，檢測各種含有FHA抗原的樣 品中FHA抗原的含量，大大提高疫苗生產(chǎn)過程中質(zhì)控的特異性和效率，降低實驗成本。
【具體實施方式】
[0040] 以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本 發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的 范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段；所用 試劑、培養(yǎng)基、菌株、細胞等均為市售商品。
[0041] 實施例1免疫原制備與動物免疫
[0042] (1)采用包姜培養(yǎng)基，發(fā)酵百日咳桿菌58003菌株（來源于中國醫(yī)學細菌保藏管理 中心）的菌體。
[0043] (2)發(fā)酵后，在發(fā)酵菌體中加入甲醛溶液至終濃度為0. 5%進行殺菌。
[0044] (3)4000rpm以上離心10分鐘以上，棄掉上清，收集菌體，菌體采用PBS/0. 5%甲醛 吹懸。
[0045] (4)研磨菌體，研磨后用PBS/0. 5%甲醛重懸稀釋。
[0046] (5)將上述重懸菌體與弗氏完全佐劑等體積混合，形成的乳化物于0天、14天、28 天免疫BALB/c小鼠，0? 2ml/只。
[0047] (6)末次免疫后一周采血檢測抗體效價，若高于103,在采血1周后采用乳化物 〇.2yg/只進行腹腔沖擊，3天后取小鼠脾臟，進行細胞融合。
[0048]