經(jīng)修飾的百日咳博德特氏菌菌株的制作方法
【專利摘要】提供了衍生于母株Tohama的重組百日咳博德特氏菌菌株。所述新菌株使用等位基因交換載體pSS4245通過同源重組獲得，這容許替換細菌染色體的部分而不會留下任何附屬突變。編碼PT亞基SI的片段經(jīng)過替換而引入兩個導致PT毒性活性失活的突變。這種菌株能夠進一步修飾而表達增量的rPT和/或PRN。具有其啟動子和ptl終止子并含有上述突變的ptx-ptl操縱子的五個PT結(jié)構(gòu)基因的ptx簇的第二拷貝能夠插入所述染色體上其他位置。另外，所述PRN基因的第二拷貝能夠插入所述染色體上。在這兩種情況下，遺棄的基因位點選擇為所述插入位點而避免引入不期望的遺傳改變。
【專利說明】經(jīng)修飾的百日咳博德特氏菌菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明描述了衍生于標識為Tohama的母株并使用載體pSS4245整合突變和其它(附加，additional)基因拷貝的重組百日咳博德特氏菌(百日咳桿菌，Bordetellapertussis)菌株的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002]百日咳(Pertussis)或百日咳(whooping cough)是由上呼吸道的百日咳博德特氏菌感染所致的嚴重嬰兒疾病[I]。疫苗已經(jīng)面世幾十年，其由百日咳博德特氏菌的滅活全細胞構(gòu)成。它們作為三價白喉-破傷風-百日咳組合或者作為還提供抗乙型肝炎和b型流感嗜血桿菌侵襲性疾病的免疫力的新組合進行給藥[2]。在少數(shù)幾個國家中由于其令人質(zhì)疑的安全譜使用全細胞疫苗已經(jīng)減少、不鼓勵或甚至受禁，這種令人質(zhì)疑的安全譜是由于高水平內(nèi)毒素和與滅活全細胞相關(guān)的其它細菌毒素所致[3，4]。 [0003]無細胞疫苗，以它們不包含全細胞而只有部分或廣泛純化的細菌抗原而得名，在1981年引入日本[5]。在無細胞疫苗中的所述組分抗原的較高純度解讀為到改善的臨床安全譜。這些疫苗在驗證其安全性和有效性的廣泛現(xiàn)場試驗之后于90年代中期引入工業(yè)化國家[6]。然而，由WHO更廣泛引入到免疫擴展計劃項目(Expanded Program ofImmunization)卻受阻于無細胞疫苗的顯著較高的成本。
[0004]百日咳博德特氏菌的主要毒力因子是百日咳毒素(PT) [7，8]而百日咳類毒素(PTd)是無細胞疫苗中的主要抗原[8]。不像白喉和破傷風毒素，可以通過甲醛的簡單處理而失活，PT已經(jīng)證明更難以通過化學方法滅活[9]。目前，不同的失活方法都適用于商業(yè)化生產(chǎn)。在廣泛通用的PT變性中所有都是通過化學處理所致。兩候選疫苗都是使用遺傳滅活毒素(rPT)進行探究的[10~12]而這些候選疫苗之一列入了現(xiàn)場藥效試驗中[11-12]。
[0005]然而,含rPT的疫苗尚不可獲得。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式，提供了一種經(jīng)遺傳修飾的百日咳博德特氏菌Tohama菌株，其中所述Tohama菌株的具有ATCC登記號BAA-589的所述百日咳毒素SI基因，具有Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29突變并且由于所述突變而并未包括整合的抗生素抗性基因，其中所述經(jīng)修飾的菌株能夠表達去毒的百日咳毒素(rPT)。
[0007]載體pSS4245可以用于引入所述SI突變而并未整合抗生素抗性基因。
[0008]所述菌株可以通過使用載體PSS4245將所述ptx操縱子的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株染色體的非功能區(qū)而進一步進行修飾,其中所述整合的ptx操縱子包含一組S2-S5基因和經(jīng)修飾而包括所述突變Arg9 — Lys9和Glul29 — Gly 129的SI基因，所述經(jīng)修飾的菌株由此具有兩個分開定位在所述Tohama染色體中的ptx操縱子而并未整合抗生素抗性基因，并能夠表達相對于僅具有一個Ptx操縱子的菌株水平增強的去毒的百日咳毒素。[0009]所述ptx操縱子的拷貝可以整合于非功能假基因(偽基因，pseudogene)之內(nèi)或之間。
[0010]所述Ptx操縱子的拷貝可以整合于假定的(putative)銨轉(zhuǎn)運子(銨轉(zhuǎn)運蛋白，ammonium transporter)假基因amtB和假定的自主轉(zhuǎn)運子(自主轉(zhuǎn)運蛋白、自轉(zhuǎn)運蛋白，auto transporter)假基因之間。
[0011]所述整合的所述PtX操縱子的拷貝可以受控于Ptx-Ptl操縱子啟動子之下。
[0012]其它所述ptl操縱子的拷貝可以不引入到所述菌株中。
[0013]所述菌株可以包括多于一個所述經(jīng)修飾的ptx操縱子的插入拷貝。
[0014]所述菌株可以進一步通過使用載體PSS4245將編碼百日咳桿菌粘附素(Pertactin)的prn基因的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株染色體的非功能區(qū)中進行修飾，所述經(jīng)修飾的Tohama菌株由此具有兩個分開定位在所述Tohama染色體中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，而所述經(jīng)修飾的Tohama菌株能夠表達相對于僅具有一個prn基因的菌株水平增強的百日咳桿菌粘附素。
[0015]所述插入的prn基因可以位于非功能假基因之內(nèi)或之間。
[0016]所述prn基因的拷貝可以整合于假定的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶假基因(pseudo-putative glutathione S-transferase gene)和假定的天冬氨酸消旋酶假基因(pseudo putative aspartate racemase gene)之間。
[0017]所述prn基因的拷貝可 以受控于prn啟動子之下.。
[0018]所述菌株可以包含多于一個所述prn基因的插入拷貝，而可以包含至少兩個經(jīng)修飾的ptx操縱子和至少兩個prn基因。
[0019]優(yōu)選所述野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替換或失活。
[0020]根據(jù)本發(fā)明的第二實施方式，提供了一種生產(chǎn)經(jīng)修飾的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括用包含所述突變Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因替換標識為Tohama的百日咳博德特氏菌菌株內(nèi)具有ATCC登記號BAA-589的所述催化亞基SI基因的步驟，其中載體PSS4245用于用所述經(jīng)修飾的SI基因替換所述未經(jīng)修飾的SI基因，由此導致整合所述經(jīng)修飾的基因而未整合抗生素抗性基因并且產(chǎn)生能夠表達去毒的百日咳毒素(rPT)的菌株。
[0021]所述方法可以進一步包括使用載體PSS4245將所述ptx操縱子的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株染色體的非功能區(qū)中的步驟,其中所述整合的ptx操縱子包含一組S2-S5基因和經(jīng)修飾而包括所述突變Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因由此生成具有兩個分開定位在所述Tohama染色體中的ptx操縱子而未整合抗生素抗性基因的經(jīng)修飾的Tohama菌株,所述經(jīng)修飾的Tohama菌株能夠表達相對于僅具有一個ptx操縱子的菌株水平增強的去毒的百日咳毒素。
[0022]所述方法可以進一步包括使用載體PSS4245將編碼百日咳桿菌粘附素的prn基因的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株染色體的非功能區(qū)的步驟，由此生產(chǎn)的經(jīng)修飾的Tohama菌株具有兩個分開定位在所述Tohama染色體中的prn基因而未整合抗生素抗性基因，所述經(jīng)修飾的Tohama菌株能夠表達相對于僅具有一個prn基因的菌株水平增強的百日咳桿菌粘附素。
[0023]多于一個所述經(jīng)修飾的ptx操縱子和/或所述prn基因的拷貝可以插入到所述Tohama菌株的染色體中。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的第三實施方式，提供了一種生產(chǎn)百日咳博德特氏菌抗原的方法，其包括以下步驟:
[0025]在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上所述的經(jīng)遺傳修飾的百日咳博德特氏菌Tohama菌株而實現(xiàn)所述抗原的表達，其中所述抗原包括通過所述菌株中存在的基因編碼的去毒的百日咳毒素(rPT)、百日咳桿菌粘附素和絲狀血凝素(Filamentous Hemagglutinin) (FHA);和回收所述抗原。
[0026]所述PT和FHA抗原可以從培養(yǎng)基中回收，而同時所述PRN抗原可通過提取方法如高溫處理而部分從培養(yǎng)基中和部分從細胞中回收。
[0027]凝集原2和/或3也可以進行表達并回收。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的第四實施方式，提供了一種由上述方法制備的抗原。
[0029]所述抗原可以用于受試者中預(yù)防百日咳感染，具體而言，用于生產(chǎn)預(yù)防百日咳感染的無細胞疫苗(acellular vaccine)。
[0030]根據(jù)本發(fā)明的第四實施方式，提供了一種包含如上所述制備的抗原的無細胞疫苗。所述抗原可以是去毒的百日咳毒素和/或百日咳桿菌粘附素。所述疫苗可以進一步包括用于預(yù)防或治療其它疾病(包括白喉、破傷風、乙型肝炎、脊髓灰質(zhì)炎和b型流感嗜血桿菌中的一種或多種)的FHA、凝集原2和/或凝集原3和/或抗原。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1:等位基因交換載體pSS4245的示意性結(jié)構(gòu)。
[0032]圖2:用于將經(jīng)修飾的SI基因構(gòu)建于所述等位基因交換載體pSS4245中的載體。A:用于通過氯霉素抗性盒(cassette)替換所述SI基因并插入于所述SI側(cè)翼區(qū)(Slflanging regions)之間的等位基因交換元件。B:用于將所述經(jīng)修飾的SI基因恢復到其在所述ptx-ptl操縱子中精確位置的等位基因交換元件。為了獲得所述等位基因交換，這些載體經(jīng)過線性化而插入到PSS4245中，其隨后通過從大腸桿菌SMlO接合轉(zhuǎn)移(conjugative transfer)而引入到百日咳博德特氏菌中。
[0033]圖3:等位基因交換過程。A:通過氯霉素抗性標記導致SI基因替換的雙重組(double recombination)事件。B:導致其原始位置重新插入所述經(jīng)修飾的SI基因的雙重組事件。
[0034]圖4:將所述ptx操縱子的第二拷貝插入到所述百日咳博德特氏菌染色體中的載體。A:所述ptx操縱子的第二拷貝的插入位點選擇于兩個分別攜帶兩個移碼突變的遺棄基因(abandoned gene)之間。B:用于將氯霉素標記插入到所選擇的位點的等位基因交換元件。C:所述具有其原始啟動子的ptx操縱子的示意性結(jié)構(gòu)。所述ptx-ptl終止子經(jīng)過克隆插入于所述S3基因之后。這個簇(cluster)最終整合到所述SS4245衍生物中而替換所述氯霉素標記并產(chǎn)生插入所述PT結(jié)構(gòu)基因的第二拷貝的所述第二等位基因交換事件。
[0035]圖5:所述R9K和E129G突變在Bp-WffC和Bp-WffD中的識別。對于菌株Bp-WffD顯示了圍繞所述突變的原始序列數(shù)據(jù)，其具有兩個PT結(jié)構(gòu)簇的拷貝。對于百日咳博德特氏菌Tohama(共有序列)及衍生物Bp-WffC和Bp-WffD顯示了所述相應(yīng)的序列比對。
[0036]圖6:將所述prn基因的第二拷貝插入百日咳博德特氏菌染色體中的載體。A:所述prn基因的第二拷貝的所述插入位點選擇于兩個攜帶移碼突變和缺失的遺棄基因之間。B:受控于fha啟動子之下并側(cè)接靶整合位點的所述prn基因的示意結(jié)構(gòu)。C:受控于自身的啟動子之下并側(cè)接祀整合位點的所述prn基因的示意結(jié)構(gòu)。
[0037]圖7:CH0細胞簇聚(cell clustering)測試。所述細胞生長至接近匯合然后加入PT稀釋液并在2天之后對所述簇聚評分。A:800ng PT (菌株Βρ-ffffC)。B:對照物，未加PT。C:2.6pg wt PT (菌株Tohama)對應(yīng)于所述檢測閾值。D:43pg wt PT (菌株Tohama)。
【具體實施方式】
[0038]本文中描述了衍生于標識為Tohama的母株的重組百日咳博德特氏菌菌株。所述新菌株通過同源重組使用等位基因交換載體PSS4245而獲得[41]。這種載體容許替換部分細菌染色體而不會留下任何附屬突變(accessory mutation)。
[0039]對PT、FHA和百日咳桿菌粘附素(PRN)的基因已經(jīng)進行了克隆和測序[35_39]。百日咳毒素是一種包含6個多肽亞基，通過5個由單個啟動子表達的不同結(jié)構(gòu)基因編碼的復雜蛋白。其酶促和其大部分的毒性活性都是由其亞基SI介導的，而其細胞結(jié)合和促有絲分裂性質(zhì)是由于其它的亞基所致，這形成B亞基。
[0040]在第一實施方式中，編碼PT亞基的SI的片段經(jīng)過置換而引入兩個引起毒性活性失活的突變。在第二實施方式中，具有其啟動子和所述Ptl終止子的所述ptx-ptl操縱子并含有上述突變的所述五個PT結(jié)構(gòu)基因的所述ptx簇的所述第二拷貝插入到所述染色體上的其他位置。所述ptx-ptl操縱子中存在的Ptl輔助基因(auxiliary gene)的組織并未修改。這種菌株產(chǎn)生增量的rPT。在第三實施方式中，所述prn基因的第二拷貝插入到所述染色體上。 在這兩種情況下，遺棄基因位點選擇作為插入位點而避免引入不良遺傳改變，并且所述抗原表達通過自身啟動子驅(qū)動，因而受到所述母本(parent) Tohama菌株中相同的調(diào)節(jié)。
[0041]PT和更是這樣的PRN在高密度培養(yǎng)基中是限制性抗原(limiting antigen),而FHA由百日咳博德特氏菌在這些條件下自然過量生產(chǎn)。然而，PRN能夠由重組大腸桿菌(E.coli)或畢赤酵母(Pichiapastoris)高收率獲得[14，15]，而僅PT亞基能夠表達于大腸桿菌中，但未能組裝成成熟毒素，且免疫原性不足以視為潛在候選疫苗[16]?，F(xiàn)在應(yīng)該理解的是，成熟毒素的組裝和分泌需要幾個在稍后階段發(fā)現(xiàn)的輔助基因，其是所述ptx-ptl操縱子的ptl部分的部件(part) [17]。
[0042]雖然已經(jīng)報道通過操縱基因拷貝數(shù)增強生產(chǎn)而提高細菌毒素的生產(chǎn)[18，19]，具體而言是PT[20]，但是這主要用于多拷貝質(zhì)粒載體或基因是串聯(lián)重復的。這可能具有關(guān)于菌株遺傳穩(wěn)定性(特別是在生產(chǎn)環(huán)境中)的后果。例如，使用多拷貝質(zhì)粒載體通過文獻Leeet al.[40]產(chǎn)生的所述百日咳博德特氏菌菌株并沒有顯示出PT生產(chǎn)的任何提高，而所述質(zhì)粒卻進行了重排，所述PT操縱子刪除或所述轉(zhuǎn)移接合子(transconjugant)發(fā)生了向無毒相的轉(zhuǎn)化。
[0043]與前面在百日咳博德特氏菌中使用的等位基因交換載體相反，PSS4245在所述染色體上不需要或留下附屬突變，特別是由早期等位基因交換方法中所需要的自發(fā)鏈霉素抗性突變體的選擇所導致的影響rpsL的所述突變[22]。這種影響看家(housekeeping)基因的突變可能會傷及毒力而因此危及毒力因子包括PT、FHA和PRN的表達。本發(fā)明的菌株會產(chǎn)生恒定水平的其它抗原，特別是FHA，并能夠用于生產(chǎn)不太昂貴的(承擔得起的)無細胞百日咳疫苗。
[0044]結(jié)果
[0045]百日咳博德特氏菌染色體中SI基因的突變
[0046]為了將所述兩個突變R9K和E129G引入亞基SI中，使用了兩步法，以避免所述兩個突變之間的區(qū)域內(nèi)重組的可能性,這種重組會導致所述突變之一丟失。這種方法還允許通過選擇性培養(yǎng)基上的簡單復制平板培養(yǎng)選擇所述所需的菌落。首先兩個大腸桿菌載體構(gòu)建于氯霉素抗性基因(CmK)取代了野生型SI基因(圖2A)或由包括所需突變的經(jīng)修飾的SI基因取代了野生型SI基因(圖2B)的pBluescript II SK+中，兩者側(cè)接1.2-1.5kB所述SI上游和下游區(qū)域。這 些載體隨后經(jīng)過加工處理而將其插入物引入到PSS4245中。這些衍生物轉(zhuǎn)移到大腸桿菌SMlO中進行接合轉(zhuǎn)移并等位基因交換到百日咳博德特氏菌菌株Tohama中。所述質(zhì)粒pSS5Cm3通過所述0]/標記產(chǎn)生了所述SI基因替代(圖3A)。質(zhì)粒pSS5S13-9K-129G將所述SI基因恢復至其原始位置，現(xiàn)在具有所述兩個所需的突變(圖3B)。在選擇性培養(yǎng)基上選擇分離物之后，所述CmK和經(jīng)修飾的SI基因在預(yù)期位置的整合通過PCR擴增(數(shù)據(jù)未顯示)進行驗證。所述突變的SI基因在預(yù)期位置的整合，正如通過PCR采用能夠結(jié)合所述SI基因上游5’和3’下游側(cè)翼區(qū)和內(nèi)部(數(shù)據(jù)未示出)的特異性引物進行驗證，是顯而易見的。在選擇用于進一步闡述的所述克隆的所述SI基因中的突變通過DNA測序驗證。所述新菌株標識為Bp-ffffC。
[0047]第二組PT結(jié)構(gòu)基因的第二整合位點的插入
[0048]最初試圖通過在與百日咳博德特氏菌相容的多拷貝質(zhì)粒上插入整個ptx-ptl操縱子而提高PT表達，卻未能提供有用的菌株，這間接表明PT過度表達有潛在的毒性，并必須保持在一定限度內(nèi)才能獲得能存活的菌株。為了增加所述PT毒素產(chǎn)率，第二組PT結(jié)構(gòu)基因引入到Bp-WffC染色體中。為了識別插入靶位點，所述百日咳博德特氏菌Tohama基因組的序列經(jīng)過掃描而識別了許多假基因。假定的銨轉(zhuǎn)運子基因和假定的自主轉(zhuǎn)運子基因之間的所述 DNA 序列選擇用于插入(posn.2，903，988-2，905，228 和 2，905，291-2，908，277)。這些基因每一個都攜帶會斷送其功能的移碼突變(圖4A)。遵照以上部分中列出的通用策略。首先，所述大腸桿菌載體pSKPD5Cm3通過將所述CmK基因插入到側(cè)接所選整合位點的區(qū)域內(nèi)進行構(gòu)建(圖4B)。在將所關(guān)注的序列插入到PSS4245中后，等位基因交換通過所述CmK#記進行選擇。所述CmK基因在所設(shè)計的位置的整合通過PCR(數(shù)據(jù)未顯示)進行驗證。在所述第二載體中所述5個PT結(jié)構(gòu)基因S1...S3與ptx啟動子和所述ptl終止子一起繼S3基因之后插入到相同的側(cè)翼區(qū)而產(chǎn)生在SI中包含所述兩個突變的載體pSKptxter(圖4C)。等位基因交換進入靶整合位點將所述PT結(jié)構(gòu)基因的功能簇的第二拷貝插入到Bp-WffC菌株中。所述新菌株標識為Bp-WffD。整合的結(jié)果使用結(jié)合到ptx操縱子上游或下游區(qū)域及內(nèi)部的引物進行擴增而驗證，這證實了預(yù)期的整合而未干擾發(fā)生重組的所述區(qū)域。
[0049]所述SI基因的測序和所述R9K和E129G突變的識別
[0050]應(yīng)用自動測序驗證所需突變的存在。在具有所述SI基因的兩個整合拷貝的菌株Bp-WffD的情況下，原則上PCR擴增會產(chǎn)生所述兩個基因的拷貝的混合物。在所述插入之一中一個意想不到的點突變將會作為對應(yīng)位置的雙核苷酸分配(assignment)出現(xiàn)。在R9K和E129G位置的熒光信號的單峰指示Bp-WffC上的正確序列并指示Bp-WffD中SI的兩個拷貝具有相同的突變。圍繞兩個所需突變的序列報道于圖5中，該圖顯示了菌株Bp-WffD的測序記錄和所述wt Tohama> Βρ-ffffC和Bp-WffD的序列比對。
[0051]所述PRN基因的第二拷貝插入到Bp-WWD菌株中
[0052]由于PRN生產(chǎn)的限制，受控于所述fha啟動子和其自身終止子之下的prn結(jié)構(gòu)基因的第二拷貝引入到假定的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶的兩個假基因之間的Bp-WffD染色體中(圖6A)。所述pSKPD2Cm3大腸桿菌載體構(gòu)建于所述CmK基因插入所述側(cè)接所選插入位點的上游和下游區(qū)域之間。另一載體使用所述相同側(cè)翼區(qū)和所述受控于所述FHA啟動子的prn基因進行構(gòu)建(圖6B)。在將所述CmK標記插入所需位置后，所述CmK基因使用通常的等位基因交換選擇和篩選程序替換成所述prn功能塊(functionalblock,功能元件)。
[0053]從這種構(gòu)建體中分離出來的所述百日咳博德特氏菌菌株并不表達PRN而其它抗原的水平最終無法檢測。據(jù)初步結(jié)論，如果在所述較強的FHA啟動子控制下過度生產(chǎn)，則所述PRN產(chǎn)物是有毒的并僅僅逃逸已失去生產(chǎn)PRN能力的突變體或所有毒力因子是可行的。因此，決定引入所述天然的prn啟動子代替所述fha啟動子。pSKPD25FpPRN3用于用所述原始的PRN啟動子代替所述FHA啟動子而產(chǎn)生具有其自身的天然啟動子和終止子的功能塊(圖6C)。這個功能塊通過通常的等位基因交換程序插入到所選擇的位點而獲得具有在其自身啟動子控制之下的所述prn基因的第二非串聯(lián)重復拷貝的菌株。所述預(yù)期的插入通過使用結(jié)合于所述prn基因側(cè)接區(qū)域和內(nèi)部的引物的PCR擴增進行驗證。這種菌株通常是可行的，并標識為Bp-WffE。
[0054]PT和PRN構(gòu)建體的遺傳穩(wěn)定性
[0055]所述菌株Bp-WffE經(jīng)過培養(yǎng)，并連續(xù)繼代培養(yǎng)于MSS培養(yǎng)基中而達到共計約50代。最后一個培養(yǎng)物經(jīng)過稀釋并接種于MSS-瓊脂。三十個分離的菌落隨機挑出。三十個菌落對其SI和prn基因通過PCR(數(shù)據(jù)未示出)進行分析。所述結(jié)果表明，所有的菌落在預(yù)期的位置上都含有SI和prn基因的兩個拷貝。
[0056]PT和FHA在搖瓶中的表達
[0057]PT和FHA在搖瓶培養(yǎng)中的生產(chǎn)通過ELISA進行分析。搖瓶培養(yǎng)物都處于含七(2，6-0-二甲基)-β-環(huán)糊精的改良的斯坦納-斯科爾特(Stainer-Scholte)培養(yǎng)基(MSS)中[23，24]。菌株Bp-WffC和Bp-WffD的結(jié)果列于表1和表2中。菌株Bp-WffD中PT的產(chǎn)量相比于Bp-WffC和wt.Tohama大約加倍，表明了所述結(jié)構(gòu)基因簇的表達水平和拷貝數(shù)的預(yù)期相關(guān)性。
[0058]表1:通過菌株Tohama、Bp-WWC和Bp-WffD的PT生產(chǎn)。細胞在MSS培養(yǎng)基中生長于搖瓶中48小時(實驗#1)或20-24小時(實驗#2)。兩獨立瓶的結(jié)果都對實驗#2進行顯示。經(jīng)離心收獲后，所述上清液通過直接ELISA采用兔多克隆抗體(實驗#1)或通過夾心ELISA使用兔多克隆抗體作為捕獲試劑和檢測用的S2特異性單克隆(Abcam)進行檢測分析。
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種經(jīng)遺傳修飾的百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)Tohama菌株,其中所述Tohama菌株的ATCC登記號為BAA-589的百日咳毒素SI基因具有Arg9 — Ly s9和Glul29-Glyl29突變并且由于所述突變而不包括整合的抗生素抗性基因，其中所述經(jīng)修飾的菌株能夠表達去毒的百日咳毒素(rPT)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株，其中載體pSS4245用于引入所述SI突變而不整合抗生素抗性基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株，其標識為Bp-WffC并具有.........登記號.........0
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其已通過使用載體PSS4245將ptx操縱子的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株的染色體的非功能區(qū)而進一步修飾，其中所述整合的ptx操縱子包含一組S2-S5基因和經(jīng)修飾而包括所述突變Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因，所述經(jīng)修飾的菌株由此具有兩個分開定位于所述Tohama染色體中而無整合的抗生素抗性基因的ptx操縱子，并能夠表達相對于僅具有一個ptx操縱子的菌株水平增強的去毒百日咳毒素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株，其中所述ptx操縱子的拷貝整合于非功能假基因之內(nèi)或之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株，其中所述ptx操縱子的拷貝整合于假定的銨轉(zhuǎn)運子假基因amtB和假定的自主轉(zhuǎn)運子假基因之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求4~6中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其中所述ptx操縱子的整合的拷貝受控于ptx-ptl操縱子啟動子。
8.根據(jù)權(quán)利要求4~7中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其不包含所述ptl操縱子的其它拷貝。
9.根據(jù)權(quán)利要求4~8中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其包含多于一個的所述經(jīng)修飾的Ptx操縱子的插入拷貝。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其已通過使用載體PSS4245將編碼百日咳桿菌粘附素的prn基因的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株的染色體的非功能區(qū)中而進一步修飾，所述經(jīng)修飾的Tohama菌株由此具有兩個分開定位在所述Tohama染色體中而未整合抗生素抗性基因的prn基因，而所述經(jīng)修飾的Tohama菌株能夠表達相對于僅具有一個prn基因的菌株水平增強的百日咳桿菌粘附素。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株，其中所述插入的prn基因位于非功能假基因之內(nèi)或之間。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其中所述prn基因的拷貝整合于假定的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求10~12中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其中所述prn基因的拷貝受控于prn啟動子。
14.根據(jù)權(quán)利要求10~13中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其包含多于一個的所述prn基因的插入拷貝。
15.根據(jù)權(quán)利要求10~14中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其包含至少兩個經(jīng)修飾的ptx操縱子和至少兩個prn基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求1~15中任一項所述的經(jīng)修飾的Tohama菌株,其中野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替換或失活。
17.—種生產(chǎn)經(jīng)修飾的百日咳博德特氏菌菌株的方法，所述方法包括用包含突變Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因替代標識為Tohama的百日咳博德特氏菌菌株中ATCC登記號為BAA-589的催化亞基SI基因的步驟，其中載體pSS4245用于使用所述經(jīng)修飾的SI基因代替未經(jīng)修飾的SI基因，由此導致所述經(jīng)修飾的基因的整合而未整合抗生素抗性基因，并且產(chǎn)生能夠表達去毒的百日咳毒素(rPT)的菌株。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其進一步包括使用載體PSS4245將ptx操縱子的拷貝整合到所述經(jīng)修飾的Tohama菌株染色體的非功能區(qū)中的步驟,其中所述整合的ptx操縱子包含一組S2-S5基因和經(jīng)修飾而包括所述突變Arg9 — Lys9和Glul29 — Glyl29的SI基因，由此生產(chǎn)經(jīng)修飾的Tohama菌株,所述經(jīng)修飾的Tohama菌株具有兩個分開定位在所述Tohama染色體中而未整合抗生素抗性基因的ptx操縱子,所述經(jīng)修飾的Tohama菌株能夠表達相對于僅具有一個Ptx操縱子的菌株水平增強的去毒百日咳毒素。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18中任一項所述的方法，其進一步包括使用載體PSS4245將編碼百日咳桿菌粘附素的prn基因的拷貝整合至所述經(jīng)修飾的Tohama菌株染色體的非功能區(qū)中的步驟，由此生產(chǎn)經(jīng)修飾的Tohama菌株,所述經(jīng)修飾的Tohama菌株具有兩個分開定位于所述Tohama染色體中而未整合抗生素抗性基因的prn基因，所述經(jīng)修飾的Tohama菌株能夠表達相對于僅具有一個prn基因的菌株水平增強的百日咳桿菌粘附素。
20.根據(jù)權(quán)利要求17~19中任一項所述的方法，其不包括將所述ptl操縱子的拷貝整合至所述經(jīng)修飾的Tohama菌株的染色體中的步驟,使得所述經(jīng)修飾的Tohama菌株僅含有單個ptl操縱子。
21.根據(jù)權(quán)利要求17~20中任一項所述的方法，其中野生型Tohama菌株的功能基因并未移除、替換或失活。
22.根據(jù)權(quán)利要求18~21中任一項所述的方法，其中所述ptx操縱子和/或所述prn基因整合于非功能假基因之內(nèi)或之間。
23.根據(jù)權(quán)利要求18~22中任一項所述的方法，其中所述ptx操縱子的拷貝整合于假定的銨轉(zhuǎn)運子假基因amtB和假定的自主轉(zhuǎn)運子假基因之間。
24.根據(jù)權(quán)利要求18~23中任一項所述的方法，其中整合的所述ptx操縱子的拷貝受控于ptx-ptl操縱子啟動子。
25.根據(jù)權(quán)利要求19~24中任一項所述的方法，其中所述prn基因的拷貝整合于假定的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶假基因和假定的天冬氨酸消旋酶假基因之間。
26.根據(jù)權(quán)利要求19~25中任一項所述的方法，其中整合的所述prn基因的拷貝受控于所述prn啟動子。
27.根據(jù)權(quán)利要求19~26中任一項所述的方法，其中所述經(jīng)修飾的ptx操縱子的拷貝和所述prn基因的拷貝插入到所述Tohama菌株的染色體中。
28.根據(jù)權(quán)利要求18~27中任一項所述的方法，其中多于一個的所述經(jīng)修飾的ptx操縱子的拷貝插入至所述Tohama菌株的染色體之中。
29.根據(jù)權(quán)利要求19~28中任一項所述的方法，其中多于一個的所述prn基因的拷貝插入至所述Tohama菌株的染色體之中。
30.一種生產(chǎn)百日咳博德特氏菌抗原的方法，其包括以下步驟: (i)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1~16中任一項所述的或根據(jù)權(quán)利要求17~29中任一項所述的方法生產(chǎn)的經(jīng)遺傳修飾的百日咳博德特氏菌Tohama菌株而實現(xiàn)所述抗原的表達，其中所述抗原包括通過所述菌株中存在的基因所編碼的去毒百日咳毒素(rPT)、百日咳桿菌粘附素和絲狀血凝素(FHA);和(?)回收所述抗原。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中從所述培養(yǎng)基中回收至少一些所述抗原。
32.根據(jù)權(quán)利要求30或31中任一項所述的方法，其中凝集原2和/或3也被表達和回收。
33.通過權(quán)利要求30~32中任一項所述的方法而生產(chǎn)的抗原。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的抗原，用于預(yù)防受試者的百日咳感染。
35.通過權(quán)利要求30~32中任一項所述的方法生產(chǎn)的抗原在生產(chǎn)用于預(yù)防受試者百日咳感染的無細胞疫苗的方法中的用途。
36.一種無細胞疫苗，包含根據(jù)權(quán)利要求30~32中任一項所述的方法生產(chǎn)的抗原。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所 述的疫苗，其中所述抗原是去毒的百日咳毒素和/或百日咳桿菌粘附素。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的疫苗，其進一步包括FHA、凝集原2和/或凝集原3。
39.根據(jù)權(quán)利要求36~38中任一項所述的疫苗，其進一步包括用于預(yù)防或治療其它疾病的抗原，包括白喉、破傷風、乙型肝炎、脊髓灰質(zhì)炎和b型流感嗜血桿菌中的一種或多種。
【文檔編號】A61P31/00GK104024400SQ201280064062
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月21日
【發(fā)明者】臣集·漢奇, 瓦辛·播西, 瓦達那萊·潘班雷德, 吉恩·彼得 申請人:亞洲生物網(wǎng)有限公司