專利名稱：：包特氏菌減毒活菌株作為抗百日咳的單劑量疫苗的制作方法包特氏菌減毒活菌抹作為抗百日咳的單劑量疫苗發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及包特氏菌()突變菌株，其至少含有突變的/fcC基因、缺失或突變的^7Z基因以及異源的ampG基因。包特氏菌減毒突變菌林可以用于產(chǎn)生免疫性的組合物或疫苗用于治療或防止包特氏菌感染。本發(fā)明還涉及包特氏菌減毒菌抹用于制備疫苗或產(chǎn)生免疫性的組合物的應(yīng)用，以及用于保護(hù)哺乳動(dòng)物免受包特氏菌感染的方法。技術(shù)背景百日咳(尸eww^)仍是全球死亡的主要原因，并且即使在疫苗高度覆蓋的國家，其發(fā)病率也在逐漸提高。盡管所有年齡群都是易感染的，但其在嬰兒中是最嚴(yán)重的，因?yàn)閶雰禾贻p而不能受到目前可以利用的疫苗保護(hù)。在20世紀(jì)后半葉引入有效疫苗之前，百日咳(whoopingcough)或百曰咳(尸em^&)是引起高死亡率的嚴(yán)重兒童疾病。這些疫苗的成功引發(fā)關(guān)于該疾病被基本上得到控制的觀點(diǎn)，然而據(jù)報(bào)道每年仍有200,000~400，000例百日咳相關(guān)的死亡，并且該疾病仍在由于傳染性物質(zhì)所引起死亡的病因中排第6位[l]。盡管主要在發(fā)展中國家流行，但在包括美國的發(fā)達(dá)國家，該疾病又重新出現(xiàn)了[2,3]，在過'去的20年中，美國的發(fā)病率已經(jīng)提高了5倍[4]。出乎意料的，在高疫苗覆蓋的國家，百日咳的流行病學(xué)已經(jīng)改變，在這些國家青少年和成年人的百日咳日益頻繁[5]。這可能是因?yàn)樵谇嗌倌昶谌找鏈p弱的疫苗介導(dǎo)的免疫。百日咳通常是非典型因此難以診斷的，并且通常在成年人中不是威脅生命的，因此，在許多病例中百日咳仍被忽視。然而，被感染的成年人構(gòu)成了重要的儲(chǔ)存宿主把該疾病傳播到非常年輕的兒童，這些兒童太年輕而未被接種疫苗，因此有發(fā)展成具有高死亡率的嚴(yán)重疾病的風(fēng)險(xiǎn)。百日咳接種疫苗通常在2個(gè)月大時(shí)開始，而完全的保護(hù)需要以1~2個(gè)月為間隔的至少3次免疫接種。因此，在6個(gè)月大之前，使用目前可以利用的疫苗，嬰兒不能完全被保護(hù)。為了降低非常年輕和大部分容易受到攻擊的年齡組中百日咳的發(fā)病率，早期的免疫接種，可能在出生時(shí)，將是高度期望的。然而，在人類和動(dòng)物模型中的大量研究顯示，新生兒的免疫系統(tǒng)太不成熟，而不能有效地誘導(dǎo)疫苗介導(dǎo)的保護(hù)性免疫[6，7]。與較大的兒童或成人相比，對(duì)于產(chǎn)生對(duì)百日咳的保護(hù)性免疫很重要的Thl應(yīng)答的指示[8],特別是IFN-Y的產(chǎn)生，似乎在人新生兒中顯著降低[9]。這一點(diǎn)也通過以下事實(shí)得以反映，即，在兒童中使用百日咳疫苗，特別是非細(xì)胞疫苗(aPV)進(jìn)行接種疫苗，僅能夠在幾個(gè)月(S6個(gè)月)后產(chǎn)生顯著量的抗原特異性IFN-Y[IO]。包特氏百日咳桿菌(SorafefeZ/ai^m^/j)的自然感染長期以來被認(rèn)為誘導(dǎo)長期的強(qiáng)免疫性，其衰退比疫苗誘導(dǎo)的免疫性要晚得多[5，ll]。而且，包特氏百日咳桿菌的感染即使在非常年輕的兒童中(l個(gè)月大)也誘導(dǎo)了可檢測的抗原特異性Thl型免疫應(yīng)答[12]。這些觀察結(jié)果暗示，可以通過經(jīng)鼻途徑以便盡可能模擬自然感染來施加的活疫苗，可以是比可利用的疫苗更吸引人的替代?，F(xiàn)有技術(shù)中已知有許多進(jìn)行接種疫苗的組合物用于治療包特氏菌感染。然于需要流行性的和快速保護(hù)性的免疫的病例中。因此法國專利FR0206666公開了缺失選自PTX、DNT、AC和TCT中至少兩種毒素的包特氏菌菌株。該專利公開了通過加入強(qiáng)啟動(dòng)子，以及加入來自大腸桿菌(￡.co//)am/G基因的11個(gè)末端氨基酸，從而過表達(dá)內(nèi)源性ampG基因。Mielcarek等人在Kcc/"e(2006;24S2:S2/54-S2-55)中公開了一種PTX.，DTN-和TCr包特氏百日咳桿菌減毒菌林，用于小鼠的免疫接種。該參考文獻(xiàn)公開了，為了降低氣管細(xì)胞毒素的產(chǎn)生，am/G基因需要被過表達(dá)。然而，通過進(jìn)一步評(píng)測，作者認(rèn)識(shí)到通過過表達(dá)ampG基因，氣管細(xì)胞毒素有提高，而不是一開始認(rèn)為的降低。Mielcarek等人在Wva"ceZ>wg￡)e//ve^y51(2001)pgs.55-69中公開了，活疫苗在通過口服或經(jīng)過經(jīng)鼻途徑給藥時(shí)，能夠誘導(dǎo)系統(tǒng)性和粘膜應(yīng)答。Roduit等人在/"/e"/ow/mww"^(2002Jul;70(7):3521-8)中描述了使用具有DTP組合物的包特氏菌突變菌抹對(duì)新生兒和嬰兒進(jìn)行疫苗接種。Mattoo等人在6，el68-el86(2001)中表示，使用大腸桿菌基因替代包特氏菌中的內(nèi)源基因，其結(jié)果是降低了所產(chǎn)生的TCT的量。因此，盡管現(xiàn)有技術(shù)公開了多種類型的接種疫苗組合物，但其都不能解決提供能夠?yàn)?個(gè)月以前的新生兒提供保護(hù)的疫苗或免疫原組合物的問題。而且，現(xiàn)有技術(shù)沒有公開提供抗包特氏菌感染的保護(hù)性免疫的免疫原組合物或疫苗?，F(xiàn)有技術(shù)沒有公開提供抗包特氏菌感染的保護(hù)性免疫的免疫原組合物或疫苗，所述保護(hù)性免疫在接種疫苗后至少2個(gè)月內(nèi)持續(xù)提高。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種減毒的活疫苗候選物或免疫原組合物，其通過對(duì)包特氏菌菌抹例如包特氏百日咳桿菌(A尸eWzm/s)或副百日咳包特氏菌(5.;ara尸em^&)進(jìn)行遺傳減毒，以減少致病性，而維持繁殖和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的能力。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種疫苗或免疫原組合物，其在新生兒中單次鼻腔給藥后誘導(dǎo)保護(hù)，這優(yōu)于目前aPV所提供的保護(hù)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抗副百日咳包特氏菌以及包特氏百日咳桿菌感染的保護(hù)，這是在使用aPV接種疫苗后未觀察到的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在新生兒中誘導(dǎo)抗包特氏菌感染的強(qiáng)保護(hù)性免疫。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供誘導(dǎo)黏膜和系統(tǒng)性免疫的疫苗或免疫原組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的是生產(chǎn)減毒的包特氏百日咳桿菌活菌抹，其被作為在生命早期的單劑量鼻腔疫苗，其被稱作BPZE1。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供疫苗，其不僅能夠用于為新生兒進(jìn)行接種疫苗，而且可以用于在流行百日咳時(shí)對(duì)任何年齡的所有動(dòng)物進(jìn)行接種疫苗。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供抗包特氏菌感染的疫苗，其誘導(dǎo)快速的保護(hù)性免疫和/或在接種疫苗之后至少2個(gè)月內(nèi)提高的保護(hù)性免疫。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供以相對(duì)低的生產(chǎn)成本提供抗包特氏菌感染的防止或治療。正如本發(fā)明的
發(fā)明內(nèi)容、優(yōu)選實(shí)施方式和權(quán)利要求的描述，本發(fā)明完成了這些和其他的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種包特氏菌突變菌抹，其至少含有突變的百日咳毒素(ptoc)基因、缺失的或突變的皮膚壞死毒素(^0基因以及異源"w/G基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及免疫原組合物，其含有包特氏菌突變菌抹，所述包特氏菌突變菌林至少含有突變的百日咳毒素(;7ftc)基因，缺失的或突變的皮膚壞死毒素(d""基因以及異源awpG基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種疫苗，其含有包特氏菌減毒菌抹，所述包特氏菌減毒菌抹至少含有突變的百日咳毒素(pfcc)基因、缺失的或突變的皮膚壞死毒素(基因以及異源am;C基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包特氏菌減毒菌林用于制備防止包特氏菌感染的疫苗的應(yīng)用，所述包特氏菌減毒菌林至少含有突變的；7"基因、缺失的或突變的^7f基因以及異源awpG基因。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包特氏菌減毒菌抹用于制備疫苗的應(yīng)用，所述包特氏菌減毒菌抹至少含有突變的pfcc基因，缺失的或突變的d"/基因以及異源am/G基因，所述疫苗用于誘導(dǎo)抗所述減毒的包特氏菌的優(yōu)先通過Thl通路的免疫應(yīng)答。還提供了保護(hù)哺乳動(dòng)物免于包特氏百日咳桿菌(^0^^^/^尸6^^^)以及副百日咳包特氏菌(5orafefe〃apara尸eW"M/s)感染所引起的疾病的方法，其包括將包特氏菌突變菌抹給藥于需要這種治療的哺乳動(dòng)物，所述包特氏菌突變菌抹至少含有突變的；tt基因、缺失的或突變的dw基因以及異源ampG基因。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，一種提供抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的方法，其包括將至少含有突變的j^c基因、缺失的或突變的^^基因以及異源ampG基因的包特氏菌突變菌林給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，一種提供抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的方法，其包括將至少含有突變的/^基因、缺失的或突變的^7,基因以及異源am/G基因的包特氏菌突變菌林給予需要這種治療的哺乳動(dòng)物，其中所述包特氏菌突變菌林，其中所述方法進(jìn)一步在接種疫苗后至少2個(gè)月內(nèi)提供了所述保護(hù)性免疫的提高。本發(fā)明的另一方面是，包特氏菌突變菌抹用于制備治療呼吸疾病的多價(jià)疫苗(即用于防止或治療多種病原體所引起感染的疫苗)的方法，其中所述包特氏菌突變菌抹至少含有突變的/7fcC基因、缺失的或突變的JW基因以及異源呻G基因。本發(fā)明的另一方面是，發(fā)明的減毒包特氏菌菌抹通過給藥于需要抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的哺乳動(dòng)物的應(yīng)用，其中所述保護(hù)性免疫在給藥后至少2個(gè)月內(nèi)提高。本發(fā)明的另一個(gè)方面是，提供哺乳動(dòng)物中用于治療或避免包特氏菌感染的粘膜應(yīng)答和系統(tǒng)應(yīng)答的方法。圖1是表示在BPSM和BPZE1培養(yǎng)物上清中所存在TCT的柱狀圖，其表示為每種菌抹3份獨(dú)立培養(yǎng)物的nM/OD54Gnm平均值(土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。圖2是BPSM(泳道l)和BPZE1(泳道2)培養(yǎng)物上清中PTX產(chǎn)量的免疫印跡分析。在左側(cè)空白處給出kDa為單位表達(dá)的Mr標(biāo)記物的分子大小。圖3是BPSM(泳道l)和BPZE1(泳道2)中t/"f基因座的Southern印跡分析。如左側(cè)空白處所顯示的，分子大小標(biāo)記物的長度是堿基對(duì)(bp)為單位表示的。圖4是表示液體培養(yǎng)中BPSM(黑線)和BPZE1(虛線)生長速率的圖表。圖5是在液體培養(yǎng)基中生長24小時(shí)的BPSM(左)和BPZE1(右)的電子顯微鏡圖片代表。圖6是表示BPSM(黑柱)和BPZE1(白柱)與人肺上皮細(xì)胞A549(左)和鼠巨噬細(xì)胞類J774細(xì)胞(右)的體外恭附的圖。結(jié)果表示為來自3組不同實(shí)驗(yàn)的相對(duì)于在接種物中所存在細(xì)菌的結(jié)合細(xì)菌百分比的平均值。，圖7是表示鼻腔感染106CFU的BPZE1或BPSM的成年小鼠肺部形成BPSM菌落(黑線)和BPZE1菌落(虛線)的圖表。數(shù)據(jù)表達(dá)為每組3~4只小鼠的CFU平均值(士標(biāo)準(zhǔn)誤差)，并代表兩組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。*，尸=0.004。圖8是來自BPZE1感染(上圖)或BPSM感染(中圖)成年小鼠與被提供PBS的對(duì)照(下圖)的肺組織分析圖。在感染1周后，無菌地取出肺，并在曱醛中固定。使用蘇木精和曙紅對(duì)切片進(jìn)行染色并通過光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢測。圖9是表示針對(duì)在(a)成年小鼠和(b)幼鼠中包特氏百日咳桿菌或在幼鼠中副百日咳包特氏菌(d)保護(hù)的圖表。使用BPSM(a和b)或副百日咳包特氏菌(d)對(duì)BPZEl、aPV或PBS(未進(jìn)行處理的)免疫的小鼠進(jìn)行激發(fā)，并在3小時(shí)后(白色柱)和7天后(黑色柱)對(duì)肺CFU數(shù)目進(jìn)行確定。結(jié)果表示為來自每組34只小鼠的CFU平均值(士標(biāo)準(zhǔn)誤差)，并代表2組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。(b,*，尸=0.009;d，*，P=0.007)(c)與對(duì)照相比，在BPZE1或aPV接種疫苗的成年小鼠中BPSM激發(fā)3小時(shí)后CFU數(shù)目。結(jié)果來自3組獨(dú)立的實(shí)^^，并表達(dá)為每只小鼠CFU相對(duì)于相同實(shí)驗(yàn)中未免疫組平均值的百分比。圖10是表示BPZE1或aPV免疫所誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的柱狀圖。在BPZEl或aPV免疫的小鼠中BPSM激發(fā)之前(白色柱)和激發(fā)之后1周(黑色柱)，(a)抗FHAIgG(H+L)的滴度和(b)IgGl/IgG2a的比例。(c)與對(duì)照(灰色柱)相比，在使用BPZE1(黑色柱)或aPV(白色柱)進(jìn)行免疫之前2個(gè)月，F(xiàn)HA-、PTX-或ConA-刺激的小鼠脾細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-y:IL-5比例。對(duì)于三次測試的每組4只小鼠，在每只小鼠中檢測抗體和細(xì)胞因子，并將結(jié)果表達(dá)為平均值(土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。圖ll是百日咳毒素的氨基酸序列(SEQIDNO:l)(胰島激活蛋白Sl)。最開始的34個(gè)氨基酸是信號(hào)肽序列，而35-269是成熟鏈。圖12是皮膚壞死毒素的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。圖13是包特氏百曰咳桿菌AmpG的氨基酸序列(SEQIDNO:3)。圖14是大腸桿菌AmpG的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式的描述這里所使用的縮寫"PTX"是指百日咳毒素，其合成和分泌一種ADP-核糖基化毒素。PTX由六條多肽S1S5構(gòu)成，酶活性部分被稱作S1。PTX具有一段34個(gè)氛基酸的信號(hào)肽序列，而成熟的肽鏈則由氨基酸35~269構(gòu)成。PTX是包特氏百日咳桿菌所表達(dá)的主要毒性因子。這些毒素的A部分表現(xiàn)出ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，B部分介導(dǎo)毒素與寄主細(xì)胞受體的結(jié)合以及將A轉(zhuǎn)移到其作用位點(diǎn)上(57)。這里所使用的縮寫"DNT，，是指百日咳皮膚壞死毒素，是一種熱不穩(wěn)定毒素，如果經(jīng)皮內(nèi)注射，DNT誘導(dǎo)小鼠以及其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的局部損傷。在以低劑量靜脈注射時(shí)(5861),DNT對(duì)小鼠是致命的。DNT被認(rèn)為是豬萎縮性鼻炎中發(fā)生鼻曱萎縮的毒性因子(62,63)。這里所使用的縮寫"TCT，，是指氣管細(xì)胞毒素，其是包特氏菌所合成的毒性因子。TCT是肽聚糖片斷，并且具有誘導(dǎo)產(chǎn)生白介素-1和一氧化氮合成酶的能力。TCT具有引起纖毛郁積的能力，并對(duì)呼吸上皮細(xì)胞具有致命效應(yīng)。術(shù)語"哺乳動(dòng)物"包括任何哺乳類溫血脊推動(dòng)物包括人，其特征在于皮膚上覆蓋有毛，并且雌性動(dòng)物具有產(chǎn)生乳汁的乳腺用于撫養(yǎng)幼崽。術(shù)語"減毒"的意思是弱化的，毒性差的包特氏菌菌林，其能夠刺激免疫應(yīng)答，并形成保護(hù)性免疫，但不會(huì)引起任何疾病。術(shù)語"快速保護(hù)性免疫"的意思是在本發(fā)明包特氏菌減毒突變菌林給藥之后短時(shí)間內(nèi)提供針對(duì)包特氏菌的免疫性。"短時(shí)間"是指在接種疫苗和激發(fā)之后l周。更具體的，現(xiàn)有病原體特異性的外周淋巴細(xì)胞、CD8+細(xì)胞毒性效應(yīng)分子(CTL)和CD4+輔助細(xì)胞快速擴(kuò)張。CD4+輔助細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟和抗體產(chǎn)生。因此，記憶庫內(nèi)的淋巴細(xì)胞準(zhǔn)備好在后續(xù)感染時(shí)快速增殖。術(shù)語"包特氏菌菌抹"包括選自包特氏百日咳桿菌(Bwrfefe//"/^"^^^),副百曰咳包特氏菌(iBorafefe//a/ara尸eWww;s)和支氣管敗血性包特氏菌(5orafefe〃a6ra"c/2/化/"ca)的菌林。用語"包特氏菌感染"的意思是下列三種菌株中至少一種所引起的感染包特氏百日咳桿菌、副百日咳包特氏菌和支氣管敗血性包特氏菌。"兒童"的意思是年齡在6個(gè)月12歲之間的人或哺乳動(dòng)物。術(shù)語"新生兒"的意思是年齡在1天24周之間的人或哺乳動(dòng)物。這里所使用的術(shù)語"治療"不限于治愈疾病和除去病因，而是特別地覆蓋治愈、緩解、除去或減輕所感興趣疾病相關(guān)的癥狀，或者防止或降低寄主身體感染任何疾病或機(jī)能失常的可能。術(shù)語"保護(hù)"和"防止"這里被可以交換使用，并且意思是阻止包特氏菌的感染。"預(yù)防疫苗"的意思是防止將來暴露所引起的包特氏菌感染。"優(yōu)先通過Thl途徑"是表示Thl途徑優(yōu)先于Th2途徑。術(shù)語"免疫原組合物"的意思是該組合物能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，并且因此是抗原。"免疫應(yīng)答"的意思是免疫系統(tǒng)的任何反應(yīng)。這些反應(yīng)包括響應(yīng)抗原的生物體免疫系統(tǒng)活性的變化，并且可以包括例如抗體產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、補(bǔ)體激活或免疫耐受性的產(chǎn)生。更具體的，本發(fā)明提供了至少一種三突變包特氏菌菌株(triplemutatedstrain)，其能夠被用作免疫原組合物或疫苗。能夠理解的是，所述至少三突變包特氏菌菌抹含有突變的；fcc基因、缺失的或突變的^f基因以及異源"mpG基因。所述異源am/G基因產(chǎn)物大量降低了所產(chǎn)生的氣管細(xì)胞毒素的量。本發(fā)明不僅限于上述的三突變體?？梢圆扇∑渌硗獾耐蛔儯缦佘账岘h(huán)化酶(AC)缺陷突變體(64)、脂多糖(LPS)缺陷突變體(65)、絲狀血凝素(FHA)(66)以及任何bvg調(diào)節(jié)的組分(67)。突變的起始菌林可以是任何包特氏菌菌株，包括包特氏百日咳桿菌、副百日咳包特氏菌和支氣管敗血性包特氏菌。在一個(gè)方式中，被用于獲得包特氏菌突變菌抹的起始菌林是包特氏百曰咳桿菌。構(gòu)建包特氏菌突變菌抹是從將菌抹中的包特氏菌基因替換為異源ampG基因開始的。在本發(fā)明中，可以使用任何異源am/7G基因。這些包括所有釋放非常少量肽聚糖進(jìn)入每代培養(yǎng)基中的革蘭氏陰性細(xì)菌。革蘭氏陰性細(xì)菌的例子包括但不限于大腸桿菌、沙門氏菌()、腸桿菌(五"tera6flcte"'aceae)、假單胞菌(尸化wfifomow"s)、莫拉氏菌(Moraxe〃a)、蟲累桿菌(//e〃coZ)flcter)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(iSfewc^rap/zomowos)、軍團(tuán)菌(丄eg/owe〃a)等。通過將包特氏菌mw/7G基因替換為異源am;G基因，所得到菌林中產(chǎn)生的氣管細(xì)胞毒素(TCT)的量低于殘余TCT活性的1%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所得到菌抹所表達(dá)的TCT毒素的量在殘余TCT活性的0.6%~1%，或者殘余TCT活性的0.4%~3%，或者殘余TCT活性的0.3%~5%。PTX是對(duì)應(yīng)包特氏百日咳桿菌感染系統(tǒng)性效應(yīng)的主要毒性因子，以及主要保護(hù)性藥物之一。由于其性能，自然;^c基因被突變版本所替換，以得到酶活部分S1編碼無酶活的毒素，但是百日咳毒素的免疫原性能不受到影響。這可以通過將序列第9位的賴氨酸(Lys)替換為精氨酸(Arg)所達(dá)到。此外，第129位的谷氨酸(Glu)替換為甘氨酸(Gly)。也可以作出其他突變，例如在美國專利6，713，072中所描述的，此處將美國專利6,713,072引入作為參考，以及任何已知的或其他能夠?qū)⒍舅鼗钚訮條低到無法檢測水平的突變。等位基因交換被用于首先缺失pfcc操縱子，接著插入突變版本。最后，接著通過使用等位基因交換從包特氏菌菌抹除去^f基因。除了完全除去外，還能夠通過點(diǎn)突變抑制酶活性。因?yàn)镈NT是由N末端的受體結(jié)合區(qū)和C末端部分的催化區(qū)所構(gòu)成的，因此將Cys-1305替換為Ala-1305的dw基因中的點(diǎn)突變會(huì)抑制DNT的酶活性(68)。DNT已經(jīng)被鑒定為支氣管敗血性包特氏菌中的重要毒素，并且通過注射極少量而顯示致命活性(26)。除了通過使用等位基因交換插入突變的；7fcc基因，以及被抑制或缺失的d"/基因外，還可以通過插入基因序列或質(zhì)粒破壞基因的開放閱讀框。在本發(fā)明中也可以應(yīng)用該方法。本發(fā)明的三突變菌抹被稱作BPZE1菌抹，并已經(jīng)于2006年3月9日被保藏在法國巴黎的法國微生物保藏中心(CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganismes,CNCM)，其保藏號(hào)為CNCM1-3585。在BPZEl中所引入的突變導(dǎo)致強(qiáng)烈的減毒，但允許細(xì)菌形成菌落并保持。因此，在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了BPZE1，其能夠在給藥時(shí)誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)免疫。在另一個(gè)方面，BPZEl被鼻腔給藥。本發(fā)明的包特氏菌突變菌抹可以用于免疫原組合物。這些免疫原組合物可以用于在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抗體應(yīng)答和或優(yōu)選T細(xì)胞應(yīng)答。有利的，T細(xì)胞應(yīng)答是其保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗包特氏菌感染或抵抗其后續(xù)疾病。本發(fā)明的包特氏菌突變菌株可以在疫苗或免疫原組合物中作為活菌抹使用，或者化學(xué)或熱滅活菌株使用。在一個(gè)方面中，活菌株被用于經(jīng)鼻給藥，而化學(xué)或熱滅活的菌抹可以用于系統(tǒng)或粘膜給藥。在用于系統(tǒng)或局部給藥時(shí)，免疫原組合物還可以含有藥物上適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體和/或介質(zhì)(vehicle)。所述藥物上可以接受的介質(zhì)包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽溶液、蒸餾水、乳液如油/水乳液、各種類型的濕潤劑無菌溶液等。本發(fā)明的免疫原組合物也可以含有佐劑(adjuvants)即任何能夠促進(jìn)或提高T細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答的物質(zhì)或化合物，特別是針對(duì)本發(fā)明有效成分的CD4、介導(dǎo)或CD8、介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。賦形劑例如胞壁肽如MDP、IL-12、磷酸鋁、氬氧化鋁、Alum和/或Montanide可以用于本發(fā)明免疫原組合物中。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如果在疫苗或免疫原組合物中使用化學(xué)或熱處理的包特氏菌突變菌抹時(shí)，在免疫原組合物中使用賦形劑和乳液。本發(fā)明的免疫原組合物至少含有一種具有針對(duì)包特氏菌感染或包特氏菌感染毒害作用的預(yù)防效果的分子，例如核酸、蛋白質(zhì)、多肽、載體或藥物。本發(fā)明的免疫原組合物用于在被給于該組合物的寄主中引發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。上面所述的所有免疫原組合物可以被通過各種途徑給藥皮下注射(s.c.)、皮內(nèi)注射(i.d.)、肌肉注射(i.m.)或靜脈注射(i.v.)，口服給藥和鼻腔給藥或吸入。在為皮下注射而進(jìn)行配制時(shí)，本發(fā)明的免疫原組合物或疫苗每注射劑量優(yōu)選含有10嗎~100嗎的該包特氏菌菌株，更優(yōu)選20嗎60嗎/劑量，特別是在一次注射中大約50(Lig/劑量。在為鼻腔給藥而進(jìn)行配制時(shí)，以大約1xio3~lxio6個(gè)細(xì)菌的劑量給藥該包特氏菌菌林，這依賴于接受包特氏菌菌林的哺乳動(dòng)物的體重和年齡。在另一個(gè)方式中，可以使用1xio4~5x106的劑量。本發(fā)明的包特氏菌突變菌林可以用作減毒疫苗以保護(hù)免于未來的包特氏菌感染。關(guān)于這一點(diǎn)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以單劑量對(duì)哺乳動(dòng)物給藥，而保護(hù)可以持續(xù)超過2個(gè)月的時(shí)間，特別是超過6個(gè)月?？梢詫⒈景l(fā)明的疫苗被給于新生兒，并保護(hù)免于百日咳的感染。這是特別關(guān)鍵的，因?yàn)閷?duì)于低于l個(gè)月的嬰兒，包特氏百日咳桿菌的死亡率是大約1.3%。而且，本發(fā)明的疫苗能夠在流行的地方用于成年哺乳動(dòng)物中或者超過60歲的老年人中，因?yàn)檫@些老年人的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)可能比稍大的兒童或健康成年人要大?？梢允褂迷诿庖咴M合物中所列出的生理賦形劑配制疫苗。例如，藥物上可以接受的介質(zhì)包括但不限于磷酸鹽緩沖鹽溶液、蒸餾水、乳液如油/水乳液、各種類型的濕潤劑無菌溶液等。在疫苗中可以使用賦形劑例如胞壁肽如MDP、IL-12、石壽酸鋁、氬fU匕鋁、Alum和/或Montanide。本發(fā)明的疫苗能夠誘導(dǎo)針對(duì)FHA的高滴度血清IgG?？乖禺愋约?xì)胞因子特征分析顯示給藥本發(fā)明包特氏菌減毒突變菌抹引起強(qiáng)TH1應(yīng)答。本發(fā)明的疫苗提供了針對(duì)包特氏菌感染的高水平保護(hù)，即高于90%的保護(hù)水平，特別是高于95%,更特別是高于99%(如實(shí)施例9詳細(xì)描述，注射7天后所計(jì)算的)。接種疫苗后至少2個(gè)月，，與未接種疫苗的(未進(jìn)行處理的)小鼠相比，含有BPZE1菌抹的疫苗的保護(hù)水平達(dá)到了99.999%。可以通過皮下注射(s.c.)、皮內(nèi)注射(i.d.)、肌肉注射(i.m.)或靜脈注射(i.v.)、口服給藥和鼻腔給藥或吸入給藥疫苗。通常，給藥疫苗是單劑量?；蛘撸景l(fā)明疫苗給藥是首次進(jìn)行的(起始接種疫苗)，接著是最后使用相同菌林、組合物或疫苗或非細(xì)胞疫苗或其組合的一次回憶(后續(xù)給藥)。在一個(gè)方面，完成疫苗的鼻腔給藥或者吸入給藥，這種給藥類型成本低并且能夠使本發(fā)明的減毒菌抹在呼吸道形成菌落上呼吸道(鼻子和鼻道、鼻竇和咽喉或咽部)和/或呼吸氣道(喉嚨或喉頭、氣管、支氣管和細(xì)支氣管)和/或肺(呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡嚢和肺泡)。以液體溶液、懸浮液、乳液、脂質(zhì)體、霜?jiǎng)?、凝膠等多相組合物的形式完成免疫原組合物或疫苗的鼻腔給藥。溶液和懸浮液以滴劑給藥。也可以作為來自鼻噴瓶或從鼻吸入器的細(xì)薄霧給藥溶液。將凝膠分配在含有所需劑量的小注射器中用于一次施加。溶液、懸浮液和粉末形式下的免疫原組合物或疫苗形成吸入劑；通過氣霧劑或干粉吸入器給藥這些制劑。使用吹入器或噴射器給藥化合物粉末。本發(fā)明的另一方面是包特氏菌突變菌抹用于制備治療呼吸疾病的多價(jià)疫苗的應(yīng)用，所述包特氏菌突變菌抹至少含有突變的/^基因、缺失的或突變的dW基因以及異源am/G基因。關(guān)于這一點(diǎn)，上述的包特氏菌減毒突變菌抹可以用作將異源抗原提供給呼吸粘膜的異源表達(dá)平臺(tái)。因此，這些呼吸性病原體例如奈瑟氏菌(A/ezhen》)、肺炎玉求菌(尸wewwop/zz7")、耶爾森氏菌(j^ra/m'a)、假單胞菌、分枝桿菌(m_yco&cfen'a)、流感等能夠使用BPZE1作為載體防止感染。本發(fā)明還包括這里所描述的包特氏菌減毒突變活菌林用于制備治療或防止包特氏菌感染的疫苗的應(yīng)用。關(guān)于這一點(diǎn)，所述疫苗可以用于同時(shí)治療或防止包特氏百日咳桿菌和副百日咳包特氏菌的感染。本發(fā)明還包括疫苗用于在百日咳流行時(shí)提供快速保護(hù)性免疫的應(yīng)用。本發(fā)明還包括疫苗用于提供快速保護(hù)性免疫的應(yīng)用，所述免疫在接種疫苗后至少兩個(gè)月內(nèi)持續(xù)提高。還將疫苗或免疫原組合物提供在試劑盒中。該試劑盒含有疫苗或免疫原組合物和說明書用于提供免疫接種指導(dǎo)的說明書(leaflet)。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，特別是CD4、介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或008+-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，該方法包括在非人類哺乳動(dòng)物或人中給藥包特氏菌減毒活菌4朱。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是一種保護(hù)哺乳動(dòng)物免于包特氏菌感染所引起疾病的方法，其包括將包特氏菌突變菌林給藥于所述需要這樣治療的哺乳動(dòng)物，所述包特氏菌突變菌抹至少含有突變的/^c基因、缺失的或突變的dW基因以及異源ampG基因。該方法包括治療或防止感染包特氏百日咳桿菌和/或副百曰咳包特氏菌。在一個(gè)方式中，在該方法中使用BPZE1菌林。本發(fā)明還包括一種提供抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的方法，其包括將包特氏菌突變菌抹給藥于需要治療的所述哺乳動(dòng)物，所述包特氏菌突變菌林至少含有突變的pfcc基因、缺失的或突變的dW基因以及異源"m/G基因。在一個(gè)方式中，在該方法中使用BPZE1菌林。而且，本發(fā)明的包特氏菌減毒突變活菌抹誘導(dǎo)教膜免疫以及系統(tǒng)性免疫。因此，在另一個(gè)方式中，本發(fā)明還涉及一種誘導(dǎo)粘膜免疫和系統(tǒng)性免疫的方法，其通過將包特氏菌減毒突變活菌林給藥于需要該治療的哺乳動(dòng)物給藥本發(fā)明的來進(jìn)行誘導(dǎo)。在一個(gè)方式中，在該方法中使用BPZE1菌抹。除了在防止和/或治療包特氏菌感染中的作用外，本發(fā)明的突變菌抹可以用作載體以攜帶至少另一種編碼感興趣的RNA(例如反義RNA)或蛋白質(zhì)的異源核酸序列。這意味著所述突變菌林除了異源ampG基因以外，還攜帶至少另一種異源核酸序列。在一個(gè)方式中，所述至少另一種異源核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)是期望在呼吸道中表達(dá)的蛋白質(zhì)。另一方式中，所感興趣的蛋白質(zhì)是抗原例如病毒、細(xì)菌或肺瘤抗原，針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答是期望的。因此，所述攜帶至少另一種異源核酸序列的包特氏菌突變菌抹可以用作疫苗。上述為給藥疫苗或免疫原組合物所提供的定義也應(yīng)用于含有攜帶至少另一種異源核酸序列的包特氏菌突變菌林的疫苗。異源蛋白的例子是病原體的抗原，其中所述病原體造成與呼吸道相關(guān)的疾病感染小兒麻痹癥、流行性感冒(正粘病毒(CWAowyxoWn'cbe)家族的流感病毒(/"y/we"zav/n^))或者肺炎J求菌的抗原(例如肺炎鏈球菌(5^，oeoccws/we,OM/ae))。已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的許多實(shí)施方式進(jìn)行了描述。然而，應(yīng)該理解的是，可以進(jìn)行各種修改而不離開本發(fā)明的主旨和范圍。實(shí)施例材泮+和方法實(shí)施例1-包特氏菌菌抹和生長條件在本發(fā)明中所使用的包特氏百日咳桿菌菌抹全部衍生自包特氏百日咳桿菌BPSM[13]，副百日咳包特氏菌是菌抹12822的抗鏈霉素衍生物(由法國巴黎InstitutPasteur的Dr.N.Guiso惠贈(zèng))。所有的包特氏菌菌林都生長在鮑-金(Bordet-Gengou)(BG)瓊脂培養(yǎng)基上(Difco，Detroit,Mich.)，其補(bǔ)充了1%甘油、20%去纖維蛋白的羊血和100jLig/ml鏈霉素。為了進(jìn)行細(xì)胞黏附檢驗(yàn)，將指數(shù)生長的包特氏百日咳桿菌接種在600nm光密度為0.15的2.5ml改進(jìn)Stainer-Scholte培養(yǎng)液中[14]，其含有l(wèi)g/1七(2,6-二鄰曱基)13-環(huán)糊精(Sigma公司)并補(bǔ)充65pCi/mlL-[35S]曱硫氨酸和L-卩5s]半胱氨酸(NEN,Boston,Mass.)，并在37。C下生長24小時(shí)。接著通過離心收獲細(xì)菌，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中清洗三次，并以期望的密度重懸浮在RPMI1640中(Gibco,GrandIsland,N.Y.)實(shí)施例2構(gòu)建包特氏百日咳桿菌BPZE1為了構(gòu)建包特氏百日咳桿菌BPZE1，通過等位基因交換將包特氏百日咳桿菌aw/7G基因替換為大腸桿菌flw/G。使用寡聚核苷酸A:5'-TATAAATCGATATTCCTGCTGGTTTCGTTCTC-3，(SEQIDNo:5)和B:5'-TATAGCTAGCAAGTTGGGAAACGACACCAC-3，(SEQIDNo:6),以及包特氏百日咳桿菌BPSM[13]基因組DNA作為模板，擴(kuò)增命名為w"的PCR片斷，其定位于包特氏百日咳桿菌ampG基因上游的49,149位49，990位。將該634-bp片斷插入到TopoPCRII(InVitrogenLifeTechnology公司，格羅寧根(Groningen)，荷蘭)中，接著作為C/al-M2el片斷切出，并插入到C7al-和A^el-消化的一種含有大腸桿菌ampG基因的自殺載體pBP23中[50],在大腸桿菌flm/(7基因的5'和3，末端分別是618bp的包特氏百日咳桿菌DNA(包特氏百日咳桿菌基因組的50，474~51，092位)和379bp的包特氏百日咳桿菌DNA(包特氏百日咳桿菌基因組的52,581-52,960位)。將所得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌SM10[51]，接著將大腸桿菌SM10與BPSM接合，并根據(jù)描述，對(duì)兩次連續(xù)的同源重組事件進(jìn)行選擇[52]。通過下面的PCR篩選10個(gè)單獨(dú)的菌落。將菌落懸浮在100plH2O中，95。C下加熱20分鐘，并在15,000xg下離心5分鐘。接著，將1^U懸浮液作為模板進(jìn)行PCR,該P(yáng)CR中使用寡聚核苷酸A和C:5，-TAAGAAGCAAAATAAGCCAGGCATT-3，(SEQIDNo:7),確定大腸桿菌am;G的存在，并使用寡聚核苷酸D:5，-TATACCATGGCGCCGCTGCTGGTGCTGGGC-3，(SEQIDNo:8)和E:5，-TATATCTAGACGCTGGCCGTAACCTTAGCA-3，(SEQIDNo:9)用于確認(rèn)包特氏百日咳桿菌flw/G的缺失。接著選擇含有大腸桿菌aw/G并缺少包特氏百日咳桿菌ampG的菌抹，并對(duì)整個(gè)ampG基因座進(jìn)行測序。接著將該菌林用于進(jìn)一步改造。根據(jù)[21]所描述的，從該菌抹染色體中去除pfcc基因，接著使用編碼無活性PTX的突變進(jìn)行替換。將來自pPT-RE含有突變pfcc基因座的五coRI片斷[16]插入到pJQ200mpl8rpsl的五coRI位點(diǎn)[53]。4妄著在通過與大腸桿菌SM10接合后利用同源重組，將所得到的質(zhì)粒整合到包特氏百日咳桿菌染色體的；fcc基因座中。對(duì)所得到包特氏百日咳桿菌菌抹染色體中的；fcc基因座進(jìn)行測序，確認(rèn)期望的突變的存在。通過免疫印跡分析毒素的產(chǎn)生，其使用對(duì)PTX的亞基Sl特異性的單克隆抗體IB7[54]和對(duì)PTX的亞基S2和S3特異性的11E6[55]。最后，在使用BPSM基因組DNA作為模板，寡聚核苷酸F:5,-TATAGAATTCGCTCGGTTCGCTGGTCAAGG-3，(SEQIDNo:10)和G:5'國TATATCTAGAGCAATGCCGATTCATCTTTA-3，(SEQIDNo:11)作為d"f上游區(qū)引物，H:5，-TATATCTAGAGCGGCCTTTATTGCTTTTCC-3，(SEQIDNo:12)和I:5'陽TATAAAGCTTCTCATGCACGCCGGCTTCTC-3,(SEQIDNo:13)作為dw下游區(qū)引物擴(kuò)增兩側(cè)區(qū)時(shí)，從所得到的包特氏百日咳桿菌中除去基因。分別使用五coRIAYJal和jaal/77/"din對(duì)所得到的799-bp和712-bpDNA片斷進(jìn)行消化，并使用FastLink試劑盒(EpicentreBiotechnologies公司，Madison,WI)連接起來。通過PCR使用寡聚核苷酸F和I擴(kuò)增所連接的片斷，并將1505-bp的PCR片斷插入到pCR2.1-Topo中(英杰(Invitrogen)公司)，從所得到的質(zhì)粒中重新分離為五coRI片斷并插入到pJQmp200rpsL18唯一的五coRI位點(diǎn)。通過大腸桿菌SM10的結(jié)合，將所得到的質(zhì)粒引入到包特氏百日咳桿菌中。使用對(duì)應(yīng)d"/上游區(qū)的PCR片段作為探針，通過對(duì)戶vwII-消化的包特氏百日咳桿菌基因組DNA進(jìn)行Southern印跡，確認(rèn)成功除去c^基因。使用DIGEasyHyb標(biāo)記試劑盒(Roche,Meylan，法國)對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記。通過Dig-標(biāo)記的DNA分子標(biāo)記物III(Roche)的遷移距離確定雜交帶的大小。對(duì)該最終菌抹中的基因座(命名為BPZE1)進(jìn)行測序。實(shí)施例3分析TCT的產(chǎn)生為了對(duì)TCT的產(chǎn)生進(jìn)行靈敏的定量，收集包特氏百日咳桿菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)上清液，并進(jìn)行固相提取[15]，并使用異硫氰酸苯酯(PITC,Pierce)進(jìn)行衍生。通過使用C8柱的反相HPLC(PerkinElmer)分離所得到的硫氰酸苯酯(PTC)衍生物，并在254nm處進(jìn)行檢測。通過將峰值面積和洗脫時(shí)間與相同處理的TCT標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，確定每個(gè)樣品中包特氏百日咳桿菌PTC-TCT的量。實(shí)施例4細(xì)胞黏附檢驗(yàn)為了分析包特氏百日咳桿菌菌抹的黏附性能，根據(jù)之前所描述的[16],檢測它們與人上皮細(xì)胞系A(chǔ)549(ATCCn°CCL-185)和鼠巨噬細(xì)胞系J774(ATCCn。TIB-67)的結(jié)合速率。實(shí)施例5透射電子顯微鏡根據(jù)之前所描述的[17],通過下列修飾使用單滴負(fù)染色程序。將20pl大約1()9個(gè)細(xì)菌/ml的懸浮液吸附到涂碳鎳網(wǎng)格2分鐘(400mesh;ElectronMicrosc叩ySciences公司(EMS),華盛頓，PA)。該網(wǎng)格空氣干燥30秒后，使用20^12。/。的磷鴒酸(pH7;EMS)對(duì)網(wǎng)格進(jìn)行染色2分鐘，并在空氣干燥后在透射電子顯微鏡(Hitachi7500,日本)下以60千伏和高分辨率進(jìn)行檢測。2實(shí)施例6鼻腔感染和接種疫苗將3周和8周大的雌性Balb/C小鼠保持在沒有特異性病原體的條件下，并在InstitutPasteurdeLill動(dòng)物研究委員會(huì)的指導(dǎo)下進(jìn)行所有的實(shí)驗(yàn)。為小鼠鼻腔感染20plPBS內(nèi)的大約4x106的細(xì)菌，并根據(jù)之前的描述[18]，檢測肺中的CFU動(dòng)力學(xué)。為了進(jìn)行aPV(Tetravac;Aventis-Pasteur，法國)的疫苗接種，對(duì)小鼠腹膜注射(i.p.)20%的人劑量進(jìn)行免疫，并在一個(gè)月后使用相同的劑量進(jìn)行增強(qiáng)。實(shí)施例7抗體確定收集血清，并且根據(jù)之前所述[18]，通過酶聯(lián)免疫吸附^r驗(yàn)(ELISA)確定抗體滴度。實(shí)施例8細(xì)胞因子檢-瞼在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)來自個(gè)體小鼠的脾細(xì)胞檢驗(yàn)體外細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于熱滅活包特氏百日咳桿菌BPSM(106cells/ml)(106個(gè)細(xì)胞/ml)、5.0pg/mlPTX(根據(jù)之前所述[20]從包特氏百日咳桿菌BPGR4所純化的[19]，并在80。C下熱失活20分鐘)、5.0)ig絲狀血凝素(FHA，根據(jù)之前所述[22]從包特氏百日咳桿菌BPRA純化的pi])、5ng/ml刀豆球蛋白A(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,Mo.)或者作為對(duì)照的培養(yǎng)液。在37。C和5%C02中孵育72小時(shí)后，從三批培養(yǎng)物中除去上清，并通過免疫檢驗(yàn)確定IFN-y和IL-5含量(BDOptEIAset,Pharmingen公司)。實(shí)施例9鼻腔感染和接種疫苗在第1、2、3和4周激發(fā)幼鼠(3周齡)模型[29]用于將使用BPZE1的接種疫苗的效率與非細(xì)胞百日咳疫苗(aPv)的接種疫苗的效率進(jìn)行比較。使用20plPBS內(nèi)大約lx106BPZE1菌抹鼻腔感染雌性Balb/C小鼠。為了使用aPv(Tetravac;Aventis-Pasteur,法國)進(jìn)行接種疫苗，對(duì)小鼠腹膜注射人劑量的20%來進(jìn)行免疫。在使用BPZE1或aPv接種疫苗后，1、2、3、或4周，使用毒性包特氏百日咳桿菌BPSM/bctA-lacZ菌抹進(jìn)行鼻腔激發(fā)[53]。該菌抹是衍生自BPSM的慶大霉素抗性菌抹，在含有l(wèi)Opg/ml慶大霉素和10(Hig/ml鏈霉素(BGg)的鮑-金(Bordet-Gengou)(BG)瓊脂平板上，其能夠與BPZE1(慶大霉素敏感)區(qū)別。對(duì)照組對(duì)應(yīng)于使用BPSM/bctA-lacZ激發(fā)的空白小鼠。激發(fā)感染后一星期，將肺無菌取出，勻漿并鋪在BGg平板上，根據(jù)之前所述的進(jìn)行CFU確定[18]。使用BPZE1或aPv對(duì)小鼠進(jìn)行疫苗接種，并在接種疫苗1、2、3或4周后使用毒性包特氏百日咳桿菌進(jìn)行激發(fā)。在3小時(shí)或7天后，確定肺CFU計(jì)數(shù)。結(jié)果表示為來自每組35只小鼠的CFU平均值(土標(biāo)準(zhǔn)誤差)。將每次激發(fā)感染的保護(hù)水平計(jì)算為激發(fā)感染后7天，每組CFU相對(duì)于非免疫組CFU平均數(shù)的平均百分比(表25)。實(shí)施例10統(tǒng)計(jì)分析使用非成對(duì)學(xué)生f檢驗(yàn)(impairedStudent'sftest)和克魯斯凱-沃利斯檢驗(yàn)(Kruskal-Wallistest),如果適當(dāng)?shù)脑捊又M(jìn)行Dunn試驗(yàn)后檢驗(yàn)(Dunn'spost-test)(GraphPadPrism程序)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。如果P^0.05，則認(rèn)為差異顯著。結(jié)果構(gòu)建包特氏菌BPZEl遺傳定位三個(gè)毒性因子氣管細(xì)胞毒素(TCT)、百日咳毒素(PTX)和皮膚壞死毒素(DNT).。TCT引起被感染寄主氣管中纖毛細(xì)胞的破壞[24，25]，并可能因此參與咳嗽綜合癥。TCT是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的分解產(chǎn)物，其中通常細(xì)菌通過^m/G轉(zhuǎn)運(yùn)子將TCT內(nèi)化到細(xì)胞質(zhì)中以在細(xì)胞壁的生物合成中重新利用。包特氏百日咳桿菌」m/G在內(nèi)化肽聚糖分解產(chǎn)物中效率低。因此，我們將包特氏百日咳桿菌^mpG替換為大腸桿菌ampG。所得到的菌抹表達(dá)低于1%的殘余TCT活性(圖1)。PTX是對(duì)應(yīng)包特氏百日咳桿菌感染的主要毒性因子，其由被稱作SI的酶活性部分以及負(fù)責(zé)與靶細(xì)胞受體結(jié)合的部分構(gòu)成(綜述，參見26)。然而，其還是主要的保護(hù)性抗原之一，這促使我們將天然的pfic基因替換為編碼無酶活毒素的突變版本。這通過將SI中的Lys-9替換為Arg,Glu-129替換為Gly來實(shí)現(xiàn)，其中這兩個(gè)關(guān)鍵的殘基分別參與底物結(jié)合以及催化。等位基因交換被用于首先除去;^c操縱子，接著加入突變的版本。通過免疫印跡分析評(píng)估在包特氏百日咳桿菌培養(yǎng)物上清中的相關(guān)毒素類似物的存在(圖2)。最后，等位基因交換被用于除去^^基因(圖3)。盡管DNT在包特氏百日咳桿菌毒性中的作用還不確定，但其已經(jīng)被鑒定為緊密相關(guān)的物種支氣管敗血性包特氏菌中的重要毒素，并且顯示了通過注射極少量后的致命活性(綜述，參見26)。體外鑒定包特氏百日咳桿菌BPZE1由于BPZE1中的某些基因改變可能會(huì)潛在地影響細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，因此將BPZE1的大小和形狀以及體外生長速率與親代菌抹BPSM進(jìn)行比較。BPZE1的生長速率與BPSM沒有不同(圖4)，并且通過電子顯^:鏡分析明確了，在BPZE1和BPSM之間沒有監(jiān)測到細(xì)菌形狀或大小上的區(qū)別(圖5)。然而，BPZE1的細(xì)胞壁一直比BPSM的細(xì)胞壁薄一些。為了確定是否任何在BPZE1中目標(biāo)毒素的缺失或改變會(huì)影響包特氏百曰咳桿菌的黏附性能，將BPZE1的附著速率與BPSM的附著速率進(jìn)行比較，使用人肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549和鼠巨噬細(xì)胞系J774作為兩種細(xì)胞模型，其通常用于研究包特氏百日咳桿菌的黏附。在兩種菌抹之間沒有觀察到與任何一種細(xì)胞系黏附的顯著差異(圖6)。包特氏百曰咳桿菌BPZE1的減毒為了確定是否在包特氏百日咳桿菌BPZE1中引入突變導(dǎo)致減毒，而仍允許生物體在呼吸道中形成菌落，使用BPZE1或BPSM對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行經(jīng)鼻感染，之后隨著時(shí)間形成菌落。BPZE1與BPSM—樣，能夠形成菌落，并保持在小鼠的肺中(圖7)。然而，在使用BPSM感染7天后觀察到的繁殖峰一直在使用BPZE1感染的小鼠中沒有觀察到。使用單種毒素基因突變的菌抹進(jìn)行的研究顯示這是由于pfcc基因座的突變引起的(數(shù)據(jù)未提供)。如果對(duì)肺檢測組織病理學(xué)變化和炎癥滲透，則在感染7天后，發(fā)現(xiàn)BPSM感染誘導(dǎo)強(qiáng)支氣管周圍血管滲透以及炎癥細(xì)胞聚集，這與支氣管上皮細(xì)胞的強(qiáng)過度生長有關(guān)(圖8)。相反，在BPZE1感染的動(dòng)物中沒有觀察到這些變化，BPZE1感染的動(dòng)物地組織學(xué)與接受PBS而不是細(xì)菌的對(duì)照小鼠的組織學(xué)類似。BPSM感染誘導(dǎo)的炎癥持續(xù)至少2個(gè)月(數(shù)據(jù)未提供)。這些結(jié)果說明引入到BPZE1的突變導(dǎo)致了強(qiáng)烈的減毒，但使細(xì)菌在肺部形成菌落并持續(xù)。使用BPZE1對(duì)成年小鼠進(jìn)行鼻腔接種疫苗后的抗包特氏百日咳桿菌激發(fā)的保護(hù)為了評(píng)估BPZE1所提供的保護(hù)，將為8周齡Balb/C小鼠鼻腔單次給藥該菌抹對(duì)后續(xù)野生型激發(fā)菌林BPSM的形成菌落的影響與使用1/5人類劑量的aPV進(jìn)行的兩次腹腔注射免疫的影響進(jìn)行比較。該aPV免疫方案已經(jīng)被充分描述，最好與人臨床樣品中的百日咳疫苗效力相關(guān)[27，28]。如通過激發(fā)感染7天后肺中細(xì)菌菌落數(shù)目的全部清除所顯示的，鼻腔單次給藥BPZE1和通過兩次腹腔注射aPV的免疫都提供了類似水平的保護(hù)(圖9a)。在接受兩次PBS注射而不是疫苗的對(duì)照小鼠中發(fā)現(xiàn)了高細(xì)菌負(fù)載。在為幼鼠使用BPZE1鼻腔免疫后針對(duì)包特氏百日咳桿菌的保護(hù)由于新型百日咳疫苗的主要目標(biāo)是目前使用可利用疫苗不能被保護(hù)的幼嬰，因此開發(fā)了幼鼠模型(3周齡)[29],并用于將使用BPZE1接種疫苗的效力與使用aPV接種疫苗的效力進(jìn)行比較。單次經(jīng)鼻給藥BPZE1完全保護(hù)幼鼠抵抗激發(fā)感染(圖9b)，因?yàn)樵诩ぐl(fā)后一周觀察到肺中細(xì)菌的完全清除。相對(duì)地，激發(fā)感染后l周，在aPV接種疫苗的動(dòng)物中仍殘余實(shí)質(zhì)量的細(xì)菌。BPZE-1接種疫苗的和aPV-接種疫苗的小鼠之間細(xì)菌負(fù)載的差別是統(tǒng)計(jì)上顯著的，這說明在幼鼠模型中，使用BPZE1的單次鼻腔給藥提供了比兩次系統(tǒng)性給藥aPV好的保護(hù)。另外，與aPV-接種疫苗動(dòng)物相比，如果小鼠已經(jīng)被使用BPZE1進(jìn)行免疫，則穩(wěn)定觀察到給藥后3小時(shí)激發(fā)菌抹細(xì)菌負(fù)載的大量下降(圖9c),這說明使用BPZE1進(jìn)行接種疫苗降低了對(duì)激發(fā)菌抹感染的易感性。在8周的小鼠和幼鼠中都觀察到了該效果。相反，與對(duì)照小鼠相比，aPV在感染3小時(shí)后對(duì)細(xì)菌數(shù)目沒有影響。在鼻腔接種疫苗BPZE1后的抗包特氏百日咳桿菌的保護(hù)關(guān)于兒童中包特氏百日咳桿菌感染有越來越多的關(guān)注，特別是在免疫的人群中[30,31]。副百日咳包特氏菌引起了更輕微的百日咳類綜合癥，其頻率可能被大大低估。而且，副百日咳包特氏菌感染的發(fā)病率在過去幾十年已經(jīng)持續(xù)提高，可能是因?yàn)橐阎陌偃湛纫呙鐚?duì)副百日咳包特氏菌具有非常低或者沒有保護(hù)性效力[32,33]。相反，最近已經(jīng)報(bào)道包特氏百日咳桿菌感染會(huì)進(jìn)行保護(hù)抗副百日咳包特氏菌的感染[34]。還使用幼鼠4企驗(yàn)BPZE1的抗副百日咳包特氏菌的保護(hù)。然而，正如之前所報(bào)道的，兩次給藥aPV不提供針對(duì)副百日咳包特氏菌的任何保護(hù)，根據(jù)激發(fā)后1周接種疫苗的小鼠肺中副百日咳包特氏菌的低數(shù)目所檢測的，單次鼻腔給藥BPZE1提供了強(qiáng)保護(hù)(圖9d)。BPZE1疫苗接種誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答盡管抗包特氏百日咳桿菌(5.尸eWww^)感染的保護(hù)性免疫的機(jī)制還未完全了解，但是在小鼠中已經(jīng)證明了B細(xì)胞與IFN-Y作用的明確證據(jù)[28]。使用一次鼻腔劑量的BPZE1或兩次腹腔注射給藥aPV誘導(dǎo)了高滴度抗FHA的血清，包特氏百日咳桿菌的主要表面抗原[35]，這同樣在aPV中出現(xiàn)(圖10a)。在包特氏百日咳桿菌激發(fā)之后，在BPZEl-接種疫苗的動(dòng)物和aPV-接種疫苗的動(dòng)物中檢測陽性回憶應(yīng)答，表現(xiàn)為與包特氏百日咳桿菌感染之前初次應(yīng)答相比，抗FHAIgG滴度的提高。抗FHAIgGl/IgG2a比例的檢測顯示這些比例在給藥aPV之后比BPZE1接種疫苗之后高，其中抗FHAIgGl/IgG2a比例是Th2型應(yīng)答的特征(圖10b)。盡管在aPV接種疫苗的小鼠中激發(fā)后抗FHA-IgGl/IgG2a降低，但它仍保持了比BPZE1接種疫苗的動(dòng)物在包特氏百日咳桿菌(5.尸eWMMz;s)激發(fā)后實(shí)質(zhì)高的水平。BPZE1或aPV接種疫苗所誘導(dǎo)的包特氏百日咳桿菌抗原特異性細(xì)胞因子特征的分析確認(rèn)BPZE1給藥促進(jìn)比aPV接種疫苗強(qiáng)的Thl型應(yīng)答。這是由使用PHA或PT或使用多克隆激活劑ConA刺激的脾細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-y與IL-5的比例，在BPZE1接種疫苗的小鼠中比在aPV接種疫苗的小鼠中藥顯著得高(圖10c)。一段時(shí)間內(nèi)BPZE1的保護(hù)性免疫(1周~4周)如下表1~5中所示，盡管給藥aPV提供了抗包特氏百日咳桿菌的有限保護(hù)(與第一周的未接種疫苗小鼠相比，細(xì)菌負(fù)載降低75%)，但針對(duì)在接種疫苗一周后進(jìn)行的包特氏百日咳桿菌激發(fā)感染，單次鼻腔給藥BPZE1也提供了高水平的保護(hù)(細(xì)菌負(fù)載降低97.64%)。如果激發(fā)感染出現(xiàn)在接種疫苗后2周，與未接種疫苗的小鼠相比，則BPZE1誘導(dǎo)的保護(hù)水平達(dá)到了99.99%以上，并且顯著優(yōu)于aPV疫苗所誘導(dǎo)的保護(hù)(與未接種疫苗的小鼠相比，92%大約)。因此，BPZE1的抗包特氏百日咳桿菌激發(fā)的疫苗效率在接種疫苗1周后仍顯著，并且在接下來的2個(gè)月中持續(xù)提高。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表1:在幼鼠中抗包特氏百日咳桿菌激發(fā)的疫苗效力的動(dòng)力學(xué)表2:在第1周，與未接種疫苗的小鼠相比，aPv接種疫苗和BPZE接種疫苗的小鼠的保護(hù)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>〉殘余細(xì)菌的百分比=每只4爭定小鼠的細(xì)菌的數(shù)目/所有未接種疫苗的小鼠的細(xì)菌的平均數(shù)目200780008568.6勢溫*被22/37到<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表4:在第3周，與未接種疫苗的小鼠相比，aPv接種疫苗和BPZE接種疫苗的小鼠的保護(hù)水平<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>(1)殘余細(xì)菌的百分比=每只特定小鼠細(xì)菌的數(shù)目/所有未接種疫苗的小鼠的細(xì)菌的平均數(shù)目200780008568.6轉(zhuǎn)溢齒被25/3755百日咳是第一個(gè)傳染性疾病，其發(fā)病率在高疫苗覆蓋的國家持續(xù)增加。這種自相矛盾的狀況可能與因?yàn)榇罅恳敫叨扔行У囊呙缍^察到的流行病學(xué)改變有關(guān)。與接種疫苗之前的時(shí)代不同，目前青少年和成人百日咳的病理越來越頻繁。盡管在該年齡組通常不威脅生命，但包特氏百日咳桿菌感染的成人對(duì)于非常年輕的兒童的感染是非常重要的貯主，這些非常年輕的兒童太小而不能通過接種疫苗而得到保護(hù)。因此，特別期望早期，可能是在出生時(shí)接種疫苗，但會(huì)受到新生兒和嬰兒不成熟的免疫系統(tǒng)的限制。然而，天然包特氏百日咳桿菌感染即使在生命早期也能夠誘導(dǎo)嬰兒中強(qiáng)Thl應(yīng)答[12]的事實(shí)促使我們開發(fā)通過經(jīng)鼻途徑給藥的包特氏百日咳桿菌減毒疫苗活菌抹，從而作為目前可以利用的疫苗的替代?；陟`長類動(dòng)物的感染實(shí)驗(yàn)，Huang等人已經(jīng)在1962年得到結(jié)論抗百曰咳的最終保護(hù)可能最好是遵循接種活包特氏百日咳桿菌[36]。在獸醫(yī)學(xué)中，包特氏菌減毒菌抹已經(jīng)被用于針對(duì)狗和小豬中博德桿菌病(bordetellosis)進(jìn)行接種疫苗。支氣管敗血性包特氏菌減毒活菌林已經(jīng)顯示在經(jīng)鼻給藥后在狗中提供針對(duì)犬窩咳(KennelCough)的強(qiáng)保護(hù)[37]。早在接種疫苗后48小時(shí)就觀察到這種保護(hù)。使用支氣管敗血性包特氏菌減毒活菌株進(jìn)行鼻腔接種疫苗也已經(jīng)顯示在兩天大的小豬中提供抗萎縮性鼻炎的保護(hù)[38]，這說明減毒形式的包特氏菌活疫苗在新生動(dòng)物中可以是高度活性的。之前將包特氏百日咳桿菌遺傳減毒為活疫苗候選物的努力得到了非常有限的成功。根據(jù)用于對(duì)沙門氏菌(fe/mo"e〃a)疫苗菌株成功減毒的策略[39]，Roberts等人已經(jīng)去除了包特氏百日咳桿菌的基因[40]。突變體的確是高度減毒的，但也喪失了在鼻腔接種疫苗的動(dòng)物的呼吸道內(nèi)形成菌落的能力，并只有在重復(fù)高劑量給藥才能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫。我們利用關(guān)于包特氏百曰咳桿菌毒性分子機(jī)理的知識(shí)，開發(fā)了高度減毒的BPZE1菌抹。該菌林含有遺傳改變，這導(dǎo)致三種主要毒素PTX、TCT和DNT的缺失或失活。與ara^突變體相反，該菌抹能夠在小鼠呼吸道內(nèi)形成菌落，并在單次鼻腔給藥后提供完全保護(hù)。在成年小鼠中的保護(hù)與通過兩次給藥1/5人劑量的aPV所誘導(dǎo)的保護(hù)沒有區(qū)別。然而，在幼鼠中觀察到了顯著的區(qū)別，其中單次給藥BPZE1完全保護(hù)，而aPV僅提供了部分保護(hù)。在難以使用目前可以利用的疫苗在生命早期誘導(dǎo)嬰兒中的保護(hù)的前提下，這些結(jié)果為開發(fā)新型接種疫苗策略提供了希望，其可以用于非常年輕的兒童，甚至可能是在出生時(shí)。另外，BPZE1保護(hù)抵抗副百日咳包特氏菌，而aPV則不能。因此，使用BPZE1也應(yīng)該對(duì)由副百曰咳包特氏菌在嬰兒中造成的百日咳發(fā)病率有影響。盡管最近在很多國家使用新型的aPV替換最早開發(fā)的全細(xì)胞疫苗已經(jīng)顯著降低了使用全細(xì)胞疫苗所觀察到的系統(tǒng)性副作用，但重復(fù)接種疫苗以獲得保護(hù)的需要仍沒有消除。這導(dǎo)致不能夠在非常年輕的兒童(<6個(gè)月)獲得保護(hù)，這提供了產(chǎn)生炎癥疾病的最大風(fēng)險(xiǎn)。另外，廣泛使用aPV已經(jīng)顯示了新的未預(yù)見的問題。重復(fù)給藥aPV可能造成在注射點(diǎn)大范圍的腫脹[41]，這是用全細(xì)胞疫苗則沒有發(fā)現(xiàn)。在大約5%的案例中，這種胂脹會(huì)影響整個(gè)肢體，并持續(xù)l周以上。盡管該肺脹的機(jī)理還沒有被確定，但是已經(jīng)認(rèn)為是由于初次免疫所誘導(dǎo)的高抗體水平所造成的Arthus超敏反應(yīng)[42]。然而，其也可能與Th2免疫應(yīng)答的傾斜有關(guān)，因?yàn)榕c全細(xì)胞疫苗相比，aPV給藥在接種疫苗的兒童中誘導(dǎo)更多的Th2型細(xì)胞因子[IO]，并造成Thl產(chǎn)生的延遲(Mascart等人，準(zhǔn)備中)。[33]。這兩個(gè)機(jī)理不是相互排斥的。與aPV相比，對(duì)BPZE1給藥的免疫應(yīng)答會(huì)更不偏向于Th2—邊，并且由于BPZE1被經(jīng)粘膜給藥，因此不會(huì)發(fā)生腫脹反應(yīng)。使用減毒的活細(xì)菌作為疫苗提高了它們的生物安全性。因此，它們滿足了基因修飾的生物適于釋放到環(huán)境的規(guī)定和指導(dǎo)。這些規(guī)定和指導(dǎo)描述了許多需要滿足的條款，包括危害鑒定和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[44]。潛在的病原性需要被認(rèn)真考慮，特別是在免疫損傷的個(gè)體中，例如感染HIV的個(gè)體。包特氏百日咳桿菌的自然生物性是在這一點(diǎn)上特別令人感興趣的。盡管HIV感染的對(duì)象中百日咳已經(jīng)被偶爾描述，但是在AIDS患者中還是相當(dāng)少見的[45]。因此，包特氏百日咳桿菌以它遺傳減毒的形式被認(rèn)為不會(huì)在感染HIV的兒童中造成重大問題，特別是如同對(duì)于許多疫苗，如果嚴(yán)重的AIDS是被排除的標(biāo)準(zhǔn)。包特氏百曰咳桿菌形成菌落是特別限于呼吸上皮，而沒有肺外細(xì)菌分布，這自然不包括BPZE1疫苗菌抹的系統(tǒng)性菌血癥。然而，如果發(fā)生了未預(yù)料的安全問題，也能夠通過大環(huán)內(nèi)酯抗生素例如紅霉素消除該疫苗菌林，幾乎所有的包特氏百日咳桿菌分離物都對(duì)紅霉素高度敏感。與所有活疫苗一樣，其它的考慮是可能將疫苗菌抹釋放到環(huán)境中，以及釋放之后的事情。包特氏百曰咳桿菌是嚴(yán)格的病原體，并且沒有動(dòng)物載體或貯主。而且，與支氣管敗血性包特氏菌不同，環(huán)境中野生型包特氏百日咳桿菌的存活是非常受到限制的[46]。百日咳僅能夠由咳嗽的個(gè)體傳播，并且似乎沒有無癥狀的帶菌者[47]。在本研究中所使用的小鼠模型中不能檢驗(yàn)咳嗽。然而，由于BPZE1中基因改變的特征，特別是TCT的大大降低以及PTX的遺傳失活，該菌林被認(rèn)為不誘導(dǎo)咳嗽。已經(jīng)顯示活性的PTX在咳嗽大鼠模型中對(duì)于咳嗽是必須的，盡管其機(jī)理還不知道[48]。然而，如果疫苗菌抹被傳遞給未接種疫苗的小鼠個(gè)體，最差也是將導(dǎo)致疫苗覆蓋面的提高。因此，這些潛在危害的結(jié)果能夠被認(rèn)為可以忽略的，并且能夠簡單快速的被抗生素處理(如果必要的話)而控制。使用BPZE1的優(yōu)點(diǎn)包括相對(duì)低的生產(chǎn)成本，使其對(duì)于發(fā)展中國家特別有吸引力，其不使用針的簡單安全的給藥模式以及其除了系統(tǒng)性免疫以外誘導(dǎo)粘膜免疫的潛力。盡管令人吃驚的是，抗百日咳的粘膜免疫還沒有被大量研究，但是包特氏百日咳桿菌是嚴(yán)格粘膜病原體的事實(shí)，導(dǎo)致很可能粘膜免疫應(yīng)答可以顯著促進(jìn)保護(hù)。目前還沒有任何可以利用的疫苗誘導(dǎo)顯著的粘膜應(yīng)答。在接種疫苗中使用BPZE1的其他優(yōu)點(diǎn)是-在單次鼻腔給藥BPZE1之后獲得快速的保護(hù)性免疫應(yīng)答，因此在接種疫苗后1周可以檢測到誘導(dǎo)疫苗；-在接種疫苗后至少兩個(gè)月內(nèi)保護(hù)性疫苗持續(xù)提高；以及-完全的保護(hù)性免疫，因?yàn)樵诮臃N疫苗后2周獲得了超過99.999%的保護(hù)水平。使用包特氏百日咳桿菌減毒活菌抹進(jìn)行粘膜接種疫苗提供了另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。包特氏百日咳桿菌能夠用于對(duì)呼吸粘膜的異源抗原的表達(dá)(綜述，參見49)。因此，使用BPZE1作為異源表達(dá)平臺(tái)可以有助于產(chǎn)生針對(duì)多種呼吸道病原體的多價(jià)疫苗。然而，由于鼻腔給藥BPZE1還誘導(dǎo)強(qiáng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答，如這里通過高水平的抗FHA抗體和抗原特異性IFN-y產(chǎn)生所示，其還可以用于產(chǎn)生期望系統(tǒng)免疫應(yīng)答期望的抗原。盡管本發(fā)明已經(jīng)對(duì)各種優(yōu)選的實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠接受可以進(jìn)行各種修飾、替換、省略和改變，而不離開本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的范圍是由后面的權(quán)利要求包括其等同物所限定的。參考文獻(xiàn)1.WHO(2004)世界健康報(bào)告2004-改變的歷史(Theworldhealthreport2004-changinghistory)，Geneva,WHO.2.DasP(2002)百日咳4吏世界后退(Whoopingcoughmakesglobalcomeback).Lancetii:322.3.TanT，TrindadeE,SkowronskiD(2005)百日咳的流行病學(xué)(Epidemiologyof尸W證^).PediatrInfectDisJ24:S10-S18.4.CentersforDiseaseControlandPrevention.尸eWMS5^.可以乂人網(wǎng)絡(luò)上獲4尋http:〃www.cdc.gov/nip/publications/pink/pert.pdf.5.WirsingvonK5nigCH，HalperinS，RiffelmannM,GuisoN(2002)成年人和嬰兒的百曰咳(尸e"扁'sofadultsandinfants).LancetInfectDis2:744-750.6.LewisDB，YuCC,MeyerJ，EnglishBK,KahnSJ，等人(1991)新生兒T細(xì)胞降低白介素-4和干擾素-Y的細(xì)胞和分子機(jī)理(Cellularandmolecularmechanismsforreducedinterleukin-4andinterferon-YproductionbyneonatalTcells).JClinInvest87:194-202,7.SiegristCA(2001)新生兒和早期生命接種疫苗(Neonatalandearlylifevaccinology).Vaccine.19:3331-3346.8.MillsKHG(2001)對(duì)包特氏百日咳桿菌(及尸eWwM/s)的免疫(Immunityto5on^efe〃a尸eWwsw's).MicrobesInfect3:655-677.9.LewisDB，LarsenA,WilsonCB(1986)人新生兒中降低的干擾素-Y水平(Reducedinterferon-YmRNAlevelsinhumanneonates).JExpMed163:1018-1023.10.AusielloCM,UrbaniF，LaSalaA,LandeR，CassoneA(1997)使用全細(xì)胞或無細(xì)胞百日咳疫苗進(jìn)行初次接種疫苗之后疫苗和抗原依賴性I型和II型細(xì)月包因子i秀導(dǎo)(Vaccine-andantigen-dependenttype1andtype2cytokineinductionafterprimaryvaccinationininfantswithwhole-celloracellular尸eWw肌Svaccines).InfectImmun65:2168-2174.11.WirsingvonK5nigCH，Postels陽MultaniS，BockHL，SchmittHJ(1995)成人中的百日咳家庭暴露后的傳4番頻率(尸em/M^inadults:frequencyoftransmissionafterhouseholdexposure).Lancet346:1326-1329.12.MascartF,VerscheureV，MalfrootA，HainautM,Pi6rardD,等人(2003)2月大嬰兒中包特氏百日咳桿菌(及尸ewus^)感染促進(jìn)I型T細(xì)胞應(yīng)答(5orafete〃a尸erft^wiinfectionin2-months-oldinfantspromotesType1Tcellresponses).JImmunol170:1504-1509.13.MenozziFD，MutomboR，RenauldGGantiezC，HannahJH，等人(1994)包特氏百日咳桿菌(及尸eWw^)絲狀紅血球凝集素黏附素的可以肝素抑制的植物凝集素活性(Heparin-inhibitablelectinactivityofthefilamentoushemagglutininadhesinof5onie&〃a尸e/tw^/s).InfectImmun62:769-778.14.ImaizumiA,SuzukiY,OnoS，SatoH,SatoY(1983)七(2,6-0-二曱基)P環(huán)糊精對(duì)包特氏百日咳桿菌(及)產(chǎn)生百日咳毒素的影響(Effectofheptakis(2，6隱0-dimethyl)-beta-cyclodextrinontheproductionof尸eWim7'stoxinby5oni故〃a尸抓認(rèn)&).InfectImmun41:1138-1143.15.CooksonBT,ChoH-L,HerwaldtLA,GoldmanWE(1989)包特氏百日咳桿菌(及尸eWwM/s)純化的氣管細(xì)胞毒素的生物學(xué)活性和化學(xué)組成(Biologicalactivitiesandchemicalcompositionofpurifiedtrachealcytotoxinof萬orafete〃a尸eW認(rèn)k).InfectImmun57:2223-2229.,16.AlonsoS，PetheK,MielcarekN,RazeD，LochtC(2001)百日咳毒素的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶在包特氏百日咳桿菌(及)感染過程中與絲狀紅血球凝集素黏附素結(jié)合中的作用(RoleofADP-ribosyltransferaseactivityof尸e怖肌^toxinintoxin-adhesinredundancywithfilamentoushemagglutininduring5o/rfefe〃aPeWMss/sinfection).InfectImmun69:6038-6043.17.CollynF，LetyMA,NairS,EscuyerV，BenYounesA,等人(2002)耶爾森氏菌假結(jié)核病具有IV型纖毛基因，其促進(jìn)致病性(YersiniapseudotuberculosisharborsatypeIVpilusgeneclusterthatcontributestopathogenicity).InfectImmun70:619-620.3518.MielcarekN，CornetteJ,SchachtAM,PierceRJ，LochtC，等人(1997)使用重組包特氏百日咳桿菌(及尸emw^)進(jìn)行鼻腔致每丈用于降低針對(duì)異源抗原的系統(tǒng)性免疫(Intranasalprimingwithrecombinant5orafe&〃a尸eWw^/sfortheinductionofasystemicimmuneresponseagainstaheterologousantigen).InfectImmun65:544-550.19.LochtC,GeoffroyMC,RenauldG(1992)包特氏百日咳桿菌(及尸eWwM^)絲狀紅血球凝集素和穗緣的共同輔助基因與papC和papD基因家族具有序歹'J相似性(Commonaccessorygenesforthe5oWefe〃a戶eWzrn^filamentoushemagglutininandfimbriaesharesequencesimilaritieswiththepapCandpapDgenefamilies).EMBOJ11:3175-3183.20.SekuraRD,FishF，ManclarkCR，MeadeB，ZhangYL(1983)新型ADP誦核糖基轉(zhuǎn)移酶的親和純化(PeWw^/stoxin.AffinitypurificationofanewADP-ribosytransferase).JBiolChem258:14647-14651.21.AntoineR，LochtC(1990)SI亞基的二硫鍵和羧基末端在組裝和生物合成百日咳毒素中的作用(Rolesofthedisulfidebondandthecarboxy-terminalregionoftheS1subunitintheassemblyandbiosynthesisof尸eW證/stoxin).InfectImmun58:1518-1526,22.MenozziFD，GantiezC,LochtC(1991)包特氏百日咳桿菌(5.絲狀紅血球凝集素與肝素的相互作用(Interactionofthe5oWefe〃a尸eWw^/sfilamentoushaemagglutininwithheparin).FEMSMicrobiolLett62:59-64.23.LochtC,AntoineR，Jacob-DubuissonF(2001)包特氏百日咳桿菌(5.尸eWw5^/s),多方面的分子致病性(5on^efe〃a尸eWMMz》,molecularpathogenesisundermultipleaspects).CurrOpinMicrobiol4:82-89.24.HeissLN,FlakTA，LancasterJR，McDanielML,GoldmanWE(1993)一氧化氮介導(dǎo)包特氏百日咳桿菌(及)對(duì)呼吸上皮的氣管細(xì)胞毒性損傷(Nitricoxidemediates5oniete〃ai^Ww^/strachealcytotoxindamagetotherespiratoryepithelium).InfectAgentsDis2:173-177.25.GoldmanWE，CooksonBT(1988)包特氏菌氣管細(xì)胞毒素的結(jié)構(gòu)和功能(StructureandfunctionsoftheBordetellatrachealcytotoxin).TokaiJExpClinMedl3Suppl:187-191.26.LochtC，AntoineR(1999)5oniete〃(3尸eW薦/sproteintoxins.In:AloufJE,FreerJH，editors.細(xì)菌蛋白毒素的綜合原始資料(Comprehensivesourcebookofbacterialproteintoxins).AcademicPress,pp.130-146.27.GuisoN，CapiauC,CarlettiQPoolmanJ，HauserP(1999)包特氏百日咳桿菌(及尸eWzm^)感染的鼻腔小鼠模型.預(yù)測通過無細(xì)胞疫苗在人類嬰兒中6勺j呆護(hù)(Intranasalmurinemodelof5oniete〃a尸eWw^^infection.I.Predictionofprotectioninhumaninfantsbyacellularvaccines).Vaccine17:2366-2376.28.MillsKH，RyanM,RyanE，MahonBP(1998)—種小鼠模型，其中使用百日咳疫苗在兒童中的效率進(jìn)行的校正顯示激素和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在保護(hù)抵抗包特氏百日咳桿菌(及尸eWw^z;s)中的補(bǔ)充作用(Amurinemodelinwhichprotectioncorrelateswithvaccineefficacyinchildrenrevealscomplementaryrolesforhumoralandcell-mediatedimmunityinprotectionagainst5orafefe〃<a_PeWzm7,s).InfectImmun66:594-602.29.RoduitC，BozzottiP，MielcarekN，LambertPH,DelGiudiceG等人(2002)在小鼠模型中新生兒免疫對(duì)包特氏百日咳桿菌(5.尸emm^)的免疫和4呆護(hù)步丈力早期4空制百日咳的i正才居(Immunogenicityandprotectiveefficacyofneonatalimmunizationagainst5oT^fe&〃a尸eWwsw^inamurinemodel:Evidenceforearlycontrolof尸eW脂/s).InfectImmun70:3521-3528.30.HeQ，ViljanenMK，ArvilommiH,AittanenB,MertsolaJ(1998)包特氏百日咳桿菌(及尸em^&)和副百日咳包特氏菌(5oWete〃apara/e^^s/)在免疫人群中所造成的百日咳(WhoopingcoughcausedbyBora故〃aPer加^and5orafete〃a戸ra尸eWw肌iinanimmunizedpopulation).JAMA280:635-637.31.WatanabeM,NagaiM(2004)副百日咳包特氏菌(萬orafefe〃az')引起的百日咳未解決的問題(Whoopingcoughdueto5orafefe〃a戸ra尸eWw肌S:anunresolvedproblem).ExpertRevAntiInfectTher2:447-454.32.MastrantonioP,StefanelliP，GiulianoM,HerreraRojasY,CiofidegliAttiM,等人(1998)兒童中副百日咳包特氏菌(5oWefe〃a/^rapeWi^/)的感染分離物的流行病學(xué)、臨床癥狀和分子特征(5orafete〃apamPem^/sinfectioninchildren:epidemiology,clinicalsymptoms,andmolecularcharacteristicsofisolates).JClinMicrobiol36:999-1002.33.LieseJQRennerC，StojanovS，BelohradskyBH,MunichVaccineStudyGroup.(2003)在引入非細(xì)胞疫苗后，包特氏百日咳桿菌(及尸eWw^^)和副百)感染的臨床和流行病特征(Clinicalandepidemiologicalpictureof5.戶eWwsw,sandB.paraPeWz/w/sinfectionsafterintroductionofacellular尸eWw肌ivaccines).ArchDisChild88:684-687.34.WatanabeM,NagaiM(2001)在呼吸感染的鼠模型中包特氏百日咳桿菌(5.尸^tw^&)和副百日咳包特氏菌(5onfefe〃a/arapeWw^/)的相互保護(hù)'I"生免疫(Reciprocalprotectiveimmunityagainst5or<iefe〃a戶eWwswiand5orafefe〃a/a^xPeWw^57.51inamurinemodelofrespiratoryinfection).InfectImmun69:6981-6986.35.LochtC，BertinP,MenozziFD,RenauldG(1993)毒性包特氏菌所產(chǎn)生的絲狀血細(xì)胞凝集素，多方面的點(diǎn)附素(Thefilamentoushaemagglutinin，amultifacetedadhesinproducedbyvirulentBordetellaspp).MolMicrobiol9:653-660.36.HuangCC,ChenPM，KuoJK，ChuiWH,LinST,等人(1962)實(shí)驗(yàn)百日咳(Experimentalwhoopingcough).NEnglJMed266:105-111.37.BeyRF,ShadeFJ,GoodnowRA,JohnsonRC(1981)使用無毒支氣管敗血性包特氏菌進(jìn)行狗的鼻腔疫苗接種(IntranasalvaccinationofdogswithliveavirulentBordetellabronchiseptica:correlationofserumaggutinationtiterandtheformationofsecretoryIgAwithprotectionagainstexperimentallyinducedinfectioustracheobronchitis).AmJVetRes42:1130-1132.38.DeJongMF(1987)通過鼻腔給藥活的非AR-致病性支氣管敗血性包特氏菌疫苗防止小豬的萎縮性鼻炎(Preventionofatrophicrhinitisinpigletsbymeansofintranasaladministrationofalivenon-AR國pathogenicBordetellabronchisepticavaccine).VetQ9:123-133.39.HoisethSK,StockerBAD(1981)依賴芳香化合物的Salmonellatyphimurium作為活疫苗是無毒的(Aromatic-dependentSalmonellatyphimuriumarenon-virulentandeffectiveaslivevaccines).Nature291:238-239.40.RobertsM,MaskellD,NovotnyP,DouganG(1990)體內(nèi)構(gòu)建和鑒定包凈爭氏百日咳4干菌(尸eWw^/s)aroA突變體(Constructionandcharacterizationinvivoof3orafefe〃a戶e^w肌^aroAmutants).InfectImmun58:732-739.41.RennelsMB(2003)在增強(qiáng)劑量白喉-破傷風(fēng)-非細(xì)胞百日咳疫苗后擴(kuò)大的月中月長反應(yīng)(Extensiveswellingreactionsoccurringafterboosterdosesofdiphtheria-tetanus-acellulari^Wz^s/svaccines).SeminPediatrInfectDis14:196-198.42.RobbinsJB,SchneersonR，TrollforsB，SatoH,SatoY，等人(2005)白喉-破傷風(fēng)類毒素-百日咳疫苗的白喉和百日咳組分需要是遺傳滅活的突變毒素(Thediphtheriaand尸eWz^s/scomponentsofdiphtheria-tetanustoxoids-尸eWi^57svaccineshouldbegeneticallyinactivatedmutanttoxins).JInfectDis191:81-88.43.HoltPGCloughJB,HoltBJ，Baron-HayMJU，RoseAH，等人(1992)遺傳性過敏癥的遺傳"風(fēng)險(xiǎn)"與出生后T細(xì)胞能力成熟化的延遲有關(guān)(Genetic"risk"foratopyisassociatedwithdelayedpostnatalmaturationofT誦cellcompetence).ClinExpAllergy22:1093-1099.44.FavreD,ViretJF(2006)在歐洲法規(guī)的條件下，口服重組活細(xì)菌疫苗的生物安全性評(píng)估(BiosafetyevaluationofrecombinantliveoralbacterialvaccinesinthecontextofEuropeanregulation).Vaccine.May1;24(18):3856-64.45.CohnSE，KnorrKL,GilliganPH,SmileyML，WeberDJ(1993)在人類免疫缺陷性病毒疾病中百日咳罕見(israreinhumanimmunodeficiencyvirusdisease).AmRevRespirDis147:411-413.46.PorterJF，WardlawAC(1993)在湖水和緩沖鹽水中不加入營養(yǎng)物，支氣管敗血性包特氏菌的長期存活(Long-termsurvivalofBordetellabronchisepticainlakewaterandinbufferedsalinewithoutaddednutrients).FEMSMicrobiolLett110:33-36.47.LinnemannCCJr,BassJW，Sm池MHD(1968)百日咳的載體狀態(tài)(Thecarrierstatein尸eWi^s^).AmJEpidemiol88:422-427.48.PartonR,HallE，WardlawAC(1994)對(duì)包特氏百曰咳桿菌(5.尸em/咖;s)突變菌株的應(yīng)答以及對(duì)百日咳咳嗽大鼠模型中接種疫苗的應(yīng)答(Responsesto5orafete〃a尸er加57'smutantstrainsandtovaccinationinthecoughingratmodelof尸eWw肌i).JMedMicrobiol40:307-312.49.MielcarekN，AlonsoS,LochtC(2001)使用活細(xì)菌載體的經(jīng)鼻接種疫苗(Nasalvaccinationusinglivebacterialvectors).AdvDrugDelRev51:55-69.50.LyonRS，EngleJT，GoldmanWE.手稿，準(zhǔn)備中(Manuscriptinpreparation)51.SimonR，PrieferU,PllhlerA(1983)用于體內(nèi)遺傳工程的寬記住范圍動(dòng)員革蘭氏陰性細(xì)菌中的轉(zhuǎn)位子突變(Abroadhostrangemobilizationsystemforinvivogeneticengineering:transposonmutagenesisinGram-negativebacteria).Bio/Technology1:784-791.52.StibitzS(1994)使用傳統(tǒng)的相互選擇的自殺載體用于等位基因交換(Useofconditionallycounterselectablesuicidevectorsforallelicexchange.)MethodsEnzymol235:458-465.53.AntoineR,HuventI，ChemlalK,DemyI，RazeD，等人(2005)TTT的外周纟吉合區(qū)參與"f言號(hào)4專導(dǎo)(Theperiplasmicbindingproteinoftripartitetricarboxylatetransporterisinvolvedinsignaltransduction).JMolBiol351:799-809.54.SatoH,ItoA,ChibaJ,SatoY(1984)針對(duì)百日咳毒素的單克隆抗體對(duì)毒素活性和百日咳感染的影響(Monoclonalantibodiesagainst尸eWw^^toxin:effectontoxinactivityand尸eW脂ziinfections).InfectImmun46:422-428.55.SatoH，SatoY，ItoA,OhishiI(1987)單克隆抗體對(duì)百日咳毒素毒素活性的影響(Effectofmonoclonalantibodyto尸eW脂/stoxinontoxinactivity).InfectImmun55:909-915.56.Tuomanen,E.和WeissA.(1985)包特氏百日咳桿菌(及PeWw^/s)與人類纖毛呼吸道上皮細(xì)胞的兩種黏附的鑒定(Characterizationoftwoadhesionsof5orafete〃a尸eWim7'sforhumanciliatedrespiratoryepithelialcells).J.Infect.Dis.152:118-125.57.Locht，C.，Antoine,R"VeithenA.和RazeD.2000.百日咳毒素結(jié)構(gòu)國功能關(guān)系(尸e^w^/sToxin:Structure-Function-Relationship).InAktoriesK.JustIeditors.HandbookofExperimentalPharmacology,BacterialProteinToxins,Springer,vol145，pp.167-185.58.HoriguchiY，Matsuda,H.KoyamaH，NakaiT和KumeK.(1992)支氣管敗血性包特氏菌(Bordetellabronchiseptica)皮膚壞死因子體內(nèi)抑制小鼠的抗體應(yīng)答(Bordetellabronchisepticadermonecrotizingtoxinsuppreesesinvivoantibodyresponsesinmice).FEMSMicrobiol.Lett.69:229-234.59.BordetetGenysa(1909)L，endotoxinecoquelucheuse;Ann.Inst.Pasteur23:415-419.60.Iida&Okonogi(1971)小鼠中包特氏百曰咳桿菌(5.尸eW脂^)中的Lieno毒'l"生(Lienotoxicityof5ofefe〃a尸eWws^s^inmice);J.Med.Microbiol.4:51-61.61.R.Parton(l985)小鼠中強(qiáng)的松對(duì)包特氏百曰咳桿菌(及尸eWw肌i)毒性的影響(EffectofprednisoneonthetoxicityofBordetela戶eWw肌Sinmice)，J.Med.Microbiol.19:391-400.62.Magyar等人(1988)支氣管敗血性包特氏菌所造成的豬鼻甲萎縮癥致病(ThepathogenesisofturbinateatrophyinpigscausedbyBordetellabronchiseptica),Vet.Microbiol.3:1719-1728.63.Roop等人(1987)支氣管敗血性包特氏菌的毒性因子與傳染性鼻咽的產(chǎn)生和實(shí)驗(yàn)中感染的新生小豬的肺炎有關(guān)(VirulencefactorsofBordetellabronchisepticaassociatedwiththeproductionofinfectiousatropicrhinitisandpneumoniainexperimentallyinfectedneonatalswine),Infect.Immun.55:217-222.64.Weiss&Goodman(1989)包特氏百日咳桿菌(5.Pem/肌's)在幼鼠模型中的致命感染(Lethalinfectionby5oWe&〃ai^Wz^s/smutantsintheinfantmousemodel),Infect.Immun.57:3757-3764.65.Allan&Maskell(1996)在包特氏百日咳桿菌(及)中生物合成脂多糖所需的遺傳基因座的鑒定、克隆和突變(Theidentification,cloningandmutagenesisofageneticlocusrequiredforlipopacysaccharidebiosynthesisin5orafefe〃a尸eWw^/s),Mol.Microbiol.19:37-52.66.Alonso等人(2002)包特氏百日咳桿菌(及)絲狀紅血球凝聚素的80KdN末端部分黏附、免疫原性和保護(hù)作用(EightykilodaltonN-terminalmoietyof5orafete〃a尸e吋wM/sfilamentoushemagglutinin:adherence,immunogenicity，andprotectiverole)，Infection&Immunity,70,4142-4147.67.Cummings,C.A.，Bootsma，H丄，RelmanD.A.和MillerJ.F.(2006)復(fù)雜柔性調(diào)節(jié)子的包特氏菌種和4朱特異性控制Species-andStrain-specificControlofaComplex,FlexibleRegulonbyBordetellaBvgAS丄Bacteriol.188:1775-1785.68.KashimotoT"KatahiraJ，CornejoWR,MasudaM，F(xiàn)ukuohA,MatsuzawaT,OhnishiT,HoriguchiY.(1999)鑒定包特氏菌皮膚壞死毒素的功能區(qū)(IdentificationoffunctionaldomainsofBordetelladermonecrotizingtoxin).Infect.Immun.67(8)3727-32.權(quán)利要求1.一種包特氏菌突變菌株，其至少含有突變的百日咳毒素(ptx)基因、缺失的或突變的皮膚壞死毒素(dnt)基因以及異源ampG基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包特氏菌突變菌抹，其為包特氏百日咳桿菌菌林。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的包特氏菌突變菌抹，其中所述包特氏菌am/G基因被大腸桿菌am/G基因所替代。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌抹，其中所得到的菌林表達(dá)低于5%的TCT殘余活性。5.根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌林，其中所得到的菌林表達(dá)低于1%的TCT殘余活性。6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌株，其中所述的/fcc基因的突變由參與底物結(jié)合的一個(gè)氨基酸取代物和/或參與催化的一個(gè)氨基酸取代物構(gòu)成。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的包特氏菌突變菌抹，其為包特氏百日咳桿菌，其中參與底物結(jié)合的氨基酸取代物是K9R,參與催化的氨基酸取代物是E129G。8.根據(jù)權(quán)利要求17中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌林，其為三突變菌抹。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的包特氏菌三突變菌林，其為2006年3月9曰保藏在法國微生物保藏中心(C.N.C.M.)的BPZE1菌林，其保藏號(hào)為1-3585。10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌抹，其被減毒。11.一種免疫原組合物，其含有權(quán)利要求110中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌才朱。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的免疫原組合物，其還包含藥物上可以接受的賦形劑、介質(zhì)和/或載體。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的免疫原組合物，其還包含佐劑。14.根據(jù)權(quán)利要求11~13中任一項(xiàng)所述的免疫原組合物，其還包含針對(duì)包特氏菌感染或包特氏菌感染毒害作用具有預(yù)防效果的分子。15.根據(jù)權(quán)利要求11~14中任一項(xiàng)所述的免疫原組合物，其中所述包特氏菌突變菌抹是BPZE1。16.—種疫苗，其含有權(quán)利要求IO所述的包特氏菌減毒菌抹。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的疫苗，其被配制成用于鼻腔給藥。18.—種試劑盒，其含有權(quán)利要求16或17所述的疫苗以及說明書。19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的包特氏菌減毒菌林，其用作為抗包特氏菌菌種所引起感染的疫苗。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的包特氏菌減毒菌抹，其用作抗包特氏菌菌種所引起感染的預(yù)防性疫苗。21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的包特氏菌減毒菌抹，其中所述包特氏菌菌種是包特氏百曰咳桿菌或副百曰咳包特氏菌。22.根據(jù)權(quán)利要求IO、19~21中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌林，其中所述包特氏菌突變菌抹是BPZE1。23.權(quán)利要求10所述包特氏菌減毒菌抹用于制備防止包特氏菌感染的疫苗的應(yīng)用。24.權(quán)利要求10所述包特氏菌減毒菌抹用于制備同時(shí)防止包特氏百日咳桿菌感染和副百日咳包特氏菌感染的疫苗的應(yīng)用。25.權(quán)利要求10所述包特氏菌減毒菌抹用于制備疫苗的應(yīng)用，所述疫苗誘導(dǎo)抗所述包特氏菌減毒菌抹的優(yōu)先通過Thl途徑的免疫應(yīng)答。26.根據(jù)權(quán)利要求2325中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌林的應(yīng)用，其中，所述疫苗通過注射或吸入經(jīng)皮下(s.c.)、皮內(nèi)(i.d.)、肌肉(i.m.)、靜脈(i.v.)、口服或鼻腔來進(jìn)行給藥。27.根據(jù)權(quán)利要求2325中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌株的應(yīng)用，其中所述疫苗被鼻腔給藥。28.根據(jù)權(quán)利要求2325中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌株的應(yīng)用，其中，所述疫苗被給藥于需要抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的哺乳動(dòng)物。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的包特氏菌減毒菌抹的應(yīng)用，其中，所述疫苗被給藥于新生兒。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的包特氏菌減毒菌林的應(yīng)用，其中，所述疫苗被給藥于兒童。31.根據(jù)權(quán)利要求2830中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌抹的應(yīng)用，其中，所述疫苗被鼻腔給藥。32.根據(jù)權(quán)利要求2831中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌抹的應(yīng)用，其中，所述疫苗以單劑量給藥一次。33.根據(jù)權(quán)利要求2327中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌林的應(yīng)用，其包括a)給藥權(quán)利要求10、19~22中任一項(xiàng)所述的包特氏菌減毒菌林；以及b)使用相同的菌株或無細(xì)胞疫苗或二者的結(jié)合進(jìn)行至少一次回憶。34.根據(jù)權(quán)利要求23所述的包特氏菌減毒菌林的應(yīng)用，其中，所述疫苗被給藥于需要抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的哺乳動(dòng)物，所述保護(hù)性免疫在接種疫苗后至少兩個(gè)月內(nèi)提高。35.包特氏菌突變菌株用于制備治療呼吸疾病的多價(jià)疫苗的應(yīng)用，其中所述包特氏菌突變菌抹至少含有突變的/^基因、缺失的或突變的^7f基因以及異源am/G基因。36.根據(jù)權(quán)利要求2335中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，所述的包特氏菌突變菌抹是BPZE1。37.根據(jù)權(quán)利要求2336中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中，抗包特氏菌感染的保護(hù)水平超過95%,特別是超過99%。38.才艮據(jù)權(quán)利要求37所述的應(yīng)用，其中，抗包特氏菌感染的保護(hù)水平超過99.999%。39.—種保護(hù)哺乳動(dòng)物免于包特氏菌感染所造成疾病的方法，其包括將包特氏菌突變菌抹給藥于需要該治療的所述哺乳動(dòng)物，所述包特氏菌突變菌抹至少含有突變的基因、缺失的或突變的dw基因以及異源am/G基因。40.—種提供抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的方法，其包括將包特氏菌突變菌林給藥于需要該治療的所述哺乳動(dòng)物，所述包特氏菌突變菌林至少含有突變的；tt基因、缺失的或突變的d"Z基因以及異源awpG基因。41.根據(jù)權(quán)利要求39或40所述的方法，其中，所述包特氏菌感染是由包特氏百日咳桿菌和副百日咳包特氏菌引起的。42.根據(jù)權(quán)利要求3941中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是新生兒。43.根據(jù)權(quán)利要求3941中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物是兒童。44.根據(jù)權(quán)利要求3943中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述包特氏菌突變菌抹通過注射或吸入經(jīng)皮下(s.c.)、皮內(nèi)(i.d.)、肌肉(i.m.)、靜脈(i.v.)、口服和鼻腔來進(jìn)行給藥。45.根據(jù)權(quán)利要求3943中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述包特氏菌突變菌抹經(jīng)鼻腔給藥。46.—種提供粘膜應(yīng)答和系統(tǒng)性應(yīng)答以治療哺乳動(dòng)物中的包特氏菌感染的方法，所述方法包括將權(quán)利要求IO所述的包特氏菌減毒菌抹給藥于需要這種治療的哺乳動(dòng)物。47.—種提供抗包特氏菌感染的快速保護(hù)性免疫的方法，其包括將包特氏菌突變菌抹給藥于所述需要這種治療的所述哺乳動(dòng)物，所述包特氏菌突變菌株至少含有突變的pfcc基因、缺失的或突變的dW基因以及異源ampG基因，其中所述方法還提供了在接種疫苗后至少兩個(gè)月內(nèi)提高的保護(hù)性免疫。48.根據(jù)權(quán)利要求39、40或47中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述包特氏菌突變菌林是BPZE1。49.根據(jù)權(quán)利要求3941或47中任一項(xiàng)所述的方法，其中抗包特氏菌感染的保護(hù)水平超過95%，特別是超過99°/0。50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中抗包特氏菌感染的保護(hù)水平超過99.999%。51.根據(jù)權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌株，其還包括至少一種編碼RNA或蛋白質(zhì)的異源核,列。52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的包特氏菌突變菌林，其中，所述至少一種異源核酸序列編碼抗原。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的包特氏菌突變菌抹，其中，所述至少一種異源核酸序列編碼病毒或細(xì)菌抗原。54.權(quán)利要求1~10中任一項(xiàng)所述包特氏菌突變菌抹作為表達(dá)至少一種異源抗原的載體的應(yīng)用。55.根據(jù)權(quán)利要求5153中任一項(xiàng)所述的包特氏菌突變菌抹，其用作疫苗。全文摘要本發(fā)明提供了一種包特氏菌突變菌株，其至少含有突變的ptx基因，缺失的或突變的dnt基因以及異源ampG基因。該包特氏菌減毒突變菌株可以用于治療或防止包特氏菌感染的免疫原組合物或疫苗。還提供了所述包特氏菌減毒突變菌株用于制備疫苗或免疫原組合物的應(yīng)用，以及保護(hù)哺乳動(dòng)物抵抗包特氏菌感染的方法。文檔編號(hào)A61K39/10GK101400783SQ200780008568公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年3月7日優(yōu)先權(quán)日2006年3月10日發(fā)明者卡米爾·洛赫特,多米尼克·拉茲,朱利·貝爾圖,納塔利·米耶爾卡雷克,阿內(nèi)-索菲·德布里申請(qǐng)人:巴斯德研究院里爾分院;法國國家健康與醫(yī)學(xué)研究院