將非神經(jīng)元細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法和組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中將非神經(jīng)元細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法和組 合物。
【背景技術(shù)】
[0002] 在再生醫(yī)學(xué)上，一個(gè)主要的問(wèn)題是如何獲得可定制的功能性細(xì)胞類型。近年來(lái)，直 接譜系重編程已經(jīng)作為操縱細(xì)胞命運(yùn)的新方法出現(xiàn)，這種方法很有前景，在操縱細(xì)胞命運(yùn) 上快而且直接，并且能夠繞開涉及多能干細(xì)胞操作所可能導(dǎo)致的致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)病毒介 導(dǎo)的已知的細(xì)胞命運(yùn)決定的轉(zhuǎn)錄因子或microRNA，成纖維細(xì)胞能夠被直接轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌悇e 的功能細(xì)胞類型（Davisetal.，1987;Vierbuchenetal.，2010;Xuetal.，2015;Yooet al.，2011)。這種直接重編程方法已經(jīng)被用在疾病模型上，預(yù)示在再生醫(yī)學(xué)上潛在的重要應(yīng) 用價(jià)值（Xuetal.，2015)。并且，在體內(nèi)原位直接重編程細(xì)胞命運(yùn)也預(yù)示著治療疾病的重 要前景（Xuetal.，2015)。盡管如此，但是，低效率的誘導(dǎo)，技術(shù)操作上的繁雜以及使用病 毒載體操作帶來(lái)的基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引發(fā)了對(duì)這些方法在未來(lái)實(shí)用性的擔(dān)憂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何直接將非神經(jīng)元真核細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣 細(xì)胞（即如何將非神經(jīng)元真核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞）。
[0004] 為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了可以將部分分化或完全分化的非神經(jīng)元真 核細(xì)胞重編程為（轉(zhuǎn)變?yōu)椋┥窠?jīng)元樣細(xì)胞的一組小分子，該組小分子為賦予非神經(jīng)元真核 細(xì)胞神經(jīng)元樣特性的一組化合物或誘導(dǎo)非神經(jīng)元真核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞的一組化 合物。將該組小分子命名為神經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑，簡(jiǎn)稱為CINPs。CINPs的分子量低于 2000道爾頓，如低于1500道爾頓、低于1000道爾頓、低于或等于900道爾頓或低于或等于 500道爾頓。
[0005] 本發(fā)明提供了使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物，所述組合物包括 神經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑（CINPs)，所述神經(jīng)元樣特性化學(xué)誘導(dǎo)劑包括下述1)-6)中的任 意組合：
[0006] 1)環(huán)腺苷單磷酸（CAMP)激動(dòng)劑；
[0007] 2)促神經(jīng)發(fā)生小分子（neurogenicsmallmolecules);
[0008] 3)糖原合成激酶（GSK)抑制劑（glycogensynthasekinase(GSK)inhibitors);
[0009] 4)TGF0 受體抑制劑（TGF0receptorinhibitors);
[0010] 5)BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑（BETfamilybromodomaininhibitors);
[0011] 6)選擇性Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶（selectiveinhibitorof Rh〇-associated，coiled_coilcontainingproteinkinase，ROCK)抑制劑和 / 或p38 絲 裂原活化激酶抑制劑；
[0012] 其中，所述6)是選擇性組分。
[0013] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述6)在能促進(jìn)非神 經(jīng)元真核細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變的使用量下可選擇加入。
[0014] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物可誘導(dǎo)非神經(jīng)元真核細(xì)胞 獲得神經(jīng)元樣特性，可用于制備將非神經(jīng)元真核細(xì)胞重編程為神經(jīng)元樣細(xì)胞的培養(yǎng)基。
[0015] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞 為哺乳動(dòng)物非神經(jīng)元真核細(xì)胞，所述組合物的活性成分可為下述Cl、C2、C3、C4、C5或C6 :
[0016] C1、由所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑、所述促神經(jīng)發(fā)生小分子、所述糖原合成激酶抑制 劑、和BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑組成；
[0017] C2、由所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑、所述促神經(jīng)發(fā)生小分子、所述糖原合成激酶抑制 劑、所述TGFP受體抑制劑和BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑組成；
[0018] C3、由所述環(huán)腺苷單磷酸激動(dòng)劑、所述促神經(jīng)發(fā)生小分子、所述糖原合成激酶抑制 劑、和所述TGFP受體抑制劑組成；
[0019] C4、由所述C1和所述6)組成；
[0020] C5、由所述C2和所述6)組成；
[0021] C6、由所述C3和所述6)組成。
[0022] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述環(huán)腺苷單磷酸 激動(dòng)劑（cAMP激動(dòng)劑）包括，但不限于前列腺素E2(prostaglandinE2，PGE2)，咯利普 蘭（rolipram)(例如，使用濃度可為50iiM)，金雀異黃素（genistein)、雙丁酰環(huán)腺苷單 磷酸（Dibutyryl-cAMP，DBc-AMP)(例如，使用濃度可為10yM)或8-溴-環(huán)腺苷單磷酸 (8_Brom〇-cAMP)(例如，使用濃度可為200iiM)和佛司可林（Forskolin，F(xiàn))。佛司可林的使 用濃度可為 5-500yM,如 20-300yM、20-200yM、50-100yM、20yM, 40yM, 60yM, 80yM，1 00yM, 120yM, 140yM, 160yM, 180yM或 200yM〇
[0023] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述促神經(jīng)發(fā)生小分子 可為N-環(huán)丙基 _5_ (2-噻吩基）_3_ 異惡挫甲酰胺（N-Cyclopropyl-5- (2-thienyl) _3_is oxazolecarboxamide，ISX9,I)。ISX9 的使用濃度可為 5-100yM,如 10-40yM、10-20yM、 5yM, 10yM, 15yM, 20yM, 25yM, 30yM, 35yM，40yM，45yM或 50yM〇
[0024] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述糖原合成 激酶抑制劑可為下述四種物質(zhì)中的至少一種：6_ [2- [4- (2, 4-二氯苯基）-5- (4-甲 基-1H-咪唑-2-基）嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈（6-[[2-[[4-(2,4-Di chlorophenyl)-5- (5-methyl-lH-imidazo1-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl] amino]-3-pyridinecarbonitrile，CHIR99021，C) ;CHIR99021 三鹽酸鹽（CHIR99021 trihydrochlo;ride)3-(2,4-二氯苯基）-4_(l-甲基-1H-H引噪-3-基）_1H_P比 略-2,5_ 二酮（3-(2,4-Dichlorophenyl)-4-(l-methyl-lH-indol-3-yl)-lH-pyr;role -2, 5-dione，SB216763);GSK31 抑制劑XV(GSK31inhibitorXV) ;GSK-3 抑制劑IX [((2Z,3E)-6' -bromo-3-(hydroxyimino)-[2,3' -biindolinylidene]-2' -one];GSK3 IX[6-Bromoindirubin-3'-oxime] ;GSK-30InhibitorXII[3- [ [6- (3-Aminophenyl)-7H-pyrrolo[2, 3-d]pyrimidin-4-yl]oxy]phenol] ;GSK_3 抑制劑XVI[6-(2-(4_(2, 4-dichlo rophenyl)-5_(4-methyl-lH-imidazol_2-yl)-pyrimidin-2-ylamino)ethyl-amino)-nic otinonitrile] ；SB-415286[3-[ (3-chlor0-4-hydroxyphenyl)amino]~4~(2-nitroph enyl)-lH-pyrrole-2,5-dione]；andBio[(2'Z, 3'E)-6-bromoindirubin-3'-oxime] 和（2'Z, 3'E)_6_ 溴館玉紅-3' -丙酮月虧（（2'Z, 3'E)-6-Bromoindirubin-3'-acetox ime，Bio-acetoxime)。CHIR99021 的使用濃度可為 2-100yM,如 5-50yM、10-20yM、 2-10yM、2yM、5yM、10yM、15yM、20yM、25yM、30yM、35yM、40yM、45yM或 50yM〇 Bio-acetoxime的使用濃度可為lyM。GSK31XV的使用濃度可為0.4yM。SB216763的使 用濃度可為10yM。
[0025] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述TGF0受體抑制 劑包括但不限于（4-[4-(1，3-苯并二唑-5-基）-5-(2_吡啶基）-lH-咪唑-2-基]-苯 酰胺水合物）（4-[4-(l，3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-lH-imidazol-2-yl] benzamide, SB431542, S) ；E-616452[2-(3-(6-Methylpyridin-2-yl)-lH-pyrazol-4-yl)-1, 5-naphthyridine] ；A 83-01[3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl) -lH-pyrazole-1-carbothioamide] ；SB 505124[2-[4_(1, 3-Benzodioxol_5-yl)-2-(l，l_d imethylethyl)-lH-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine]；Gff788388[4-[4-[3-(2-Pyri dinyl)-lH-pyrazol-4-yl]-2-pyridinyl]-N-(tetrahydr〇-2H-pyran_4-yl)-benzamide]; SB 525334[6-[2-(1, 1-Dimethylethyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-lH-imidazol-4-yl] quinoxaline],和 dorsomorphine。SB431542 的使用濃度可為 l_50iiM，如 2_40iiM 或 2-10yM或 10yM〇
[0026] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述BET家族溴 結(jié)構(gòu)域抑制劑為下述物質(zhì)中的至少一種：7_(3, 5-二甲基異噁唑-4-基）_8_甲氧 基-l-((R)-l-(吡啶-2-基）乙基）-lH-咪唑并[4,5-C]喹啉-2(3H)_ 酮（7-(3,5-dime thylisoxazol-4-yl)-8-methoxy-l-((R)-1-(pyridin-2-yl)ethyl)-lH-imidazo[4, 5_c] quinolin-2(3H)_one，I-BET151，B) ;I-BET151 的氫氯化物（I-BET151hydrochloride); ((63)-(4-(4-氯苯基）-2,3,9-三甲基-611-噻吩并[3,2-幻[1，2,4]三唑并[4,3- &][1，4] 二氮雜卓-6-基）乙酸叔丁酯）（(6S)-4-(4-Chlorophenyl)-2,3,9-trimethyl-6H-thien 〇[3, 2-f][1, 2, 4]triazolo[4, 3-a][1, 4]diazepine-6-aceticacid1, 1-dimethylethyl ester,JQ1)；PFI1[2-methoxy-N-(3_methyl-2-0x0-l, 2, 3, 4-tetrahydroquinazolin_6-丫1)匕611261168111；1^0仙1111(16];131'01]108卩01'；[116和1-[ 7-(3,4-二甲氧基苯基）-9-[[(33)-1-甲 基哌啶-3-基]甲氧基]-2, 3, 4, 5-四氫-1，4-苯并氧氮雜卓-4-基]丙烷-1-酮 (1- [7_ (3, 4-Dimethoxyphenyl) _9_ [ [ (3S) -l-methylpiperidin-3-yl]methoxy] _2, 3, 4, 5_ tetrahydr〇-l, 4-ben zoxazepin-4-yl]propan-1-〇ne,I-CBP112)；
[0027] 和/或，所述6)為下述四種物質(zhì)中的至少一種：（+)-(R)_反式-4_(1-氨基乙 基）-N- (4-吡啶基）環(huán)己燒甲酰胺二鹽酸鹽（(+) - (R) -trans-4- (1-aminoethy 1) -N- (4-pyr idyl) cyclohexanecarboxamidedihydrochloride，Y27632)，法舒地爾，達(dá)馬莫德（BIRB796) 和（4_(4,-氟苯基）-2-(4' -甲基亞磺?；交?5-(4' -吡啶基）-咪唑）（SB203580)。 I-BET 151 的使用濃度可為 2-100 yM,如 5-50 yM、5-20 yM、2-10 yM、2 yM、5 yM、10 yM、 15 yM、20 yM、25 yM、30 yM、35 yM、40 yM、45yM或 50 yiLPFI 1 的使用濃度可為 5yM，JQ1 的使用濃度可為1 yM，Bromosporine的使用濃度可為1 yM, I-CBP112的使用濃度可為 10yM〇
[0028] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述組合物可為C1、C2、 C3 或C4 ;
[0029] 所述Cl由所述F、所述I、所述C和所述B組成；所述Cl中，所述F、所述I、所述C 和所述B的摩爾比可為（50-100): (10-20) : (10-20) : (0.5-10)或 100: (10-20) : (10-20): (0? 5-2)或 100 :20 :20 : (0? 5-2)或 100 :20 :20 :2 ;
[0030] 所述C2由所述F、所述I、所述C、所述S和所述B組成；所述C2中，所述F、所述 I、所述C、所述S和所述B的摩爾比可為（50-100): (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0.5-10)或 100 : (10-20) : (10-20) : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 : (2-10) : (0? 5-2)或 100 :20 :20 : 10 ：2 ；
[0031] 所述C3由所述F、所述I、所述C和所述S組成；所述C3中，所述F、所述I、所述 C和所述S的摩爾比可為（50-100) : (10-20) : (10-20) : (2-10)或 100 : (10-20) : (10-20): (2-10)或 100 :20 :20 : (2-10)或 100 :20 :20 :10 ;
[0032] 所述C4由所述C1和所述6)組成組成，所述6)為下述四種物質(zhì)中的一種：所述 Y27632、法舒地爾、達(dá)馬莫德和所述SB203580 ;所述C4中，所述C1以F計(jì)和所述6)的摩爾 比可為（50-100) :2 或 100 :2。
[0033] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述神經(jīng)元樣特性可為 下述P1、P2和P3中的至少一種：
[0034] P1、具有神經(jīng)元形態(tài)；
[0035] P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種： TUJ1 (神經(jīng)特異III類0 -微管蛋白），MAP2 (微管相關(guān)蛋白2)，NF-H(神經(jīng)絲H、重鏈神經(jīng)絲 蛋白），NeuN(神經(jīng)元核蛋白），vGlut(囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）和Gad67 (谷氨酸脫羧酶67);
[0036] P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。
[0037] 上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物中，所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞 可為下述任一種細(xì)胞：成纖維細(xì)胞，多能干細(xì)胞，血液來(lái)源細(xì)胞，胚胎來(lái)源細(xì)胞，皮膚來(lái)源細(xì) 胞，脂肪組織來(lái)源細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞，小腸上皮細(xì) 胞和結(jié)締組織細(xì)胞。
[0038] 含有上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍，所述產(chǎn)品使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性；所述神經(jīng)元樣特性為下述 P1、P2和P3中的至少一種：
[0039] P1、具有神經(jīng)元形態(tài)；
[0040] P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種： TUJ1 (神經(jīng)特異III類0 -微管蛋白），MAP2 (微管相關(guān)蛋白2)，NF-H(神經(jīng)絲H、重鏈神經(jīng)絲 蛋白），NeuN(神經(jīng)元核蛋白），vGlut(囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）和Gad67 (谷氨酸脫羧酶67);
[0041] P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。
[0042] 含有上述使非神經(jīng)元真核細(xì)胞獲得神經(jīng)元樣特性的組合物的產(chǎn)品具體可為R1或 R2 ；
[0043] R1、含有所述組合物的成套真核細(xì)胞培養(yǎng)基；
[0044] R2、含有所述組合物的試劑盒。
[0045] 上述試劑盒還可以包括用于添加所述組合物的真核細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0046]上述組合物或上述產(chǎn)品在將非神經(jīng)元真核細(xì)胞重編程（轉(zhuǎn)變）為神經(jīng)元樣細(xì)胞中 的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，所述神經(jīng)元樣細(xì)胞為具有神經(jīng)元樣特性的細(xì)胞，所述神 經(jīng)元樣特性為下述PI、P2和P3中的至少一種：
[0047] P1、具有神經(jīng)元形態(tài)；
[0048] P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種： TUJ1，MAP2,NF-H，NeuN，vGlut和Gad67 ;
[0049] P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。
[0050] 本發(fā)明還提供了將非神經(jīng)元真核細(xì)胞重編程（轉(zhuǎn)變）為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法。
[0051] 本發(fā)明所提供的將非神經(jīng)元真核細(xì)胞重編程（轉(zhuǎn)變）為神經(jīng)元樣細(xì)胞的方法，包 括將離體的非神經(jīng)元真核細(xì)胞（待重編程細(xì)胞或起始細(xì)胞）在含有所述組合物的神經(jīng)元誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)使所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞；所述神經(jīng)元樣細(xì)胞為具有 神經(jīng)元樣特性的細(xì)胞，所述神經(jīng)元樣特性為下述PI、P2和P3中的至少一種：
[0052] P1、具有神經(jīng)元形態(tài)；
[0053] P2、表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，所述神經(jīng)元標(biāo)記蛋白為如下六種蛋白中的至少一種： TUJ1，MAP2,NF-H，NeuN，vGlut和Gad67 ;
[0054] P3、由膜片鉗檢測(cè)到膜去極化。
[0055] 上述應(yīng)用或方法中，所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞可為下述任一種細(xì)胞：成纖維細(xì)胞，多 能干細(xì)胞，血液來(lái)源細(xì)胞，胚胎來(lái)源細(xì)胞，皮膚來(lái)源細(xì)胞，脂肪組織來(lái)源細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，上 皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞，實(shí)質(zhì)細(xì)胞，小腸上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞。
[0056] 上述應(yīng)用或方法中，所述非神經(jīng)元真核細(xì)胞可為沒(méi)有被轉(zhuǎn)染編碼具有促神經(jīng)發(fā)生 功能蛋白質(zhì)的核酸和/或沒(méi)有轉(zhuǎn)染小分子RNA;所述具有促神經(jīng)發(fā)生功能蛋白質(zhì)為