專利名稱：：神經(jīng)元前體細(xì)胞用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的用途的制作方法
背景技術(shù)：
：發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，特別是治療中風(fēng)。相關(guān)領(lǐng)域描述有許多原因造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)(“CNS”)組織損傷。CNS損傷的一個(gè)主要原因是中風(fēng)。中風(fēng)的特征是大腦某區(qū)域的血循環(huán)突然喪失，導(dǎo)致神經(jīng)功能的相應(yīng)喪失。也稱為腦血管突發(fā)綜合征或中風(fēng)綜合征。中風(fēng)是包含異源病理生理原因的非專用術(shù)語，包括血栓形成、栓塞和出血。近年的報(bào)導(dǎo)表明每年各型新的中風(fēng)患者的發(fā)病率超過50萬。中風(fēng)是主要的致死和致殘?jiān)?。綜合所有類型的中風(fēng)，它是第三致死原因和第一致殘?jiān)?。近年的傾向是，到2050年此病發(fā)病將躍升到每年一百萬。綜合考慮中風(fēng)的直接化費(fèi)(護(hù)理和治療)和間接化費(fèi)(勞動(dòng)力喪失)，美國社會(huì)每年因中風(fēng)將喪失433億美元。目前將中風(fēng)分類為出血型和局部缺血型。急性局部缺血型中風(fēng)指血栓或栓塞引起的中風(fēng)，占所有中風(fēng)的80％。四種主要的神經(jīng)解剖學(xué)局部缺血性中風(fēng)綜合征是由它們各自腦血供遭破壞所致。前腦動(dòng)脈堵塞主要影響前額葉功能，導(dǎo)致精神狀態(tài)改變、判斷力受損、對(duì)側(cè)下肢虛弱和感覺遲鈍，及步態(tài)失調(diào)。中腦動(dòng)脈(MCA)堵塞常產(chǎn)生對(duì)側(cè)輕度偏癱、對(duì)側(cè)感覺遲鈍、同側(cè)偏盲(視野的一半失明)和凝視力偏向損傷側(cè)。如果損傷發(fā)生在優(yōu)勢(shì)半球，常見認(rèn)知不能，并且可導(dǎo)致接受或表達(dá)性失語。因?yàn)镸CA向上肢運(yùn)動(dòng)元帶供血，手臂和面部虛弱常比下肢嚴(yán)重。后腦動(dòng)脈堵塞影響視覺和思考，產(chǎn)生同側(cè)偏盲、皮質(zhì)性失明、視覺性認(rèn)知不能、精神狀態(tài)改變和記憶力受損。脊椎基底動(dòng)脈堵塞眾所周知難以檢測(cè)，因?yàn)樗鼈兡芤鸶鞣N顱神經(jīng)、腦神經(jīng)和腦干損傷，包括眩暈、眼球震顫、復(fù)視、視野缺失、吞咽困難、構(gòu)語障礙、面部感覺遲鈍、暈厥和共濟(jì)失調(diào)。常發(fā)生同側(cè)面部和對(duì)側(cè)軀體痛覺和溫度感覺喪失。相反，前腦中風(fēng)只產(chǎn)生一側(cè)軀體癥狀。發(fā)生這些堵塞有各種原因?？梢蛐呐K、顱外動(dòng)脈，或罕見的右側(cè)血循環(huán)(感覺性栓塞)而發(fā)生栓塞。心源性栓塞的來源包括心瓣膜血栓(如左房室瓣狹窄、心內(nèi)膜炎、人造修復(fù)瓣膜中)、壁血栓(如心肌梗塞[MI]、心房纖顫、擴(kuò)張性心肌病變)和心房粘液瘤。MI與2-3％的栓塞性中風(fēng)發(fā)病相關(guān)，其中85％發(fā)生在MI后的第一個(gè)月。腦室梗塞占所有腦梗塞的13-20％，常常涉及皮質(zhì)下腦區(qū)域和腦干的小末梢血管。腦室梗塞常見于小血管疾病患者，如糖尿病和高血壓患者。認(rèn)為稱為透明栓塞(lipohyalinosis)的小栓塞或原位栓塞可引起腦室梗塞。最常見的腦室梗塞綜合征包括單純運(yùn)動(dòng)、單純感覺輕度偏癱中風(fēng)和共濟(jì)失調(diào)中風(fēng)。由于腦室梗塞的范圍小且限于皮層下部位，通常不導(dǎo)致認(rèn)知、記憶、語言或意識(shí)水平的損傷。血栓性梗塞最常見部位是腦動(dòng)脈分枝點(diǎn)，特別是頸內(nèi)動(dòng)脈分布區(qū)。動(dòng)脈狹窄(即血流紊亂)、動(dòng)脈粥樣硬化(即出現(xiàn)潰瘍性脂斑)和血小板粘附導(dǎo)致血凝塊形成而栓塞或堵塞動(dòng)脈。較少見的血栓形成原因包括紅細(xì)胞增多癥、鐮狀細(xì)胞貧血、蛋白C缺乏、腦動(dòng)脈的纖維肌肉發(fā)育不良、和偏頭痛病導(dǎo)致的血管收縮延長。可導(dǎo)致腦動(dòng)脈剝離的任何過程也可引起血栓性中風(fēng)(如創(chuàng)傷、胸主動(dòng)脈剝離、動(dòng)脈炎)。偶然地，向遠(yuǎn)端狹窄或堵塞動(dòng)脈的血流灌注不足，或二條腦動(dòng)脈供血區(qū)之間的脆弱分流區(qū)血流灌注不足可引起局部缺血性中風(fēng)?，F(xiàn)轉(zhuǎn)到出血性中風(fēng)，術(shù)語腦內(nèi)出血(ICH)與出血性中風(fēng)本文中可互換使用，分別指從出血轉(zhuǎn)到局部缺血性中風(fēng)。ICH占所有中風(fēng)的約20％，死亡率高于腦梗塞。出血性中風(fēng)患者存在類似的局灶性神經(jīng)缺損，而傾向于比局部缺血性中風(fēng)的病情更重。腦內(nèi)出血患者更可能患有頭痛、精神狀態(tài)改變、癲癇、惡心和嘔吐、和/或顯著高血壓；然而憑這些癥狀不易區(qū)分出血性與局部缺血性中風(fēng)。在ICH時(shí)，腦實(shí)質(zhì)中直接發(fā)生出血。常見機(jī)制是受慢性高血壓損傷的腦內(nèi)小動(dòng)脈滲漏所致。其它機(jī)制包括出血素質(zhì)、醫(yī)源性抗凝血治療、腦淀粉樣變和可卡因成癮。ICH傾向于發(fā)生在某些腦內(nèi)部位，包括丘腦、豆?fàn)詈恕⑿∧X和腦干。除了出血損傷的腦區(qū)域外，由于血腫塊質(zhì)量效應(yīng)產(chǎn)生的壓力也會(huì)損傷周圍腦區(qū)域?？砂l(fā)生顱內(nèi)壓升高。出血性中風(fēng)的30天死亡率為40-80％。所有死亡中約50％發(fā)生在最初的48小時(shí)。通常所知的CNS損傷的其它原因包括創(chuàng)傷和各種CNS疾病。治療CNS損傷涉及神經(jīng)發(fā)生，即在患者的感興趣組織區(qū)域中再生神經(jīng)原，包括但不限于置換中樞神經(jīng)系統(tǒng)病損中的受損神經(jīng)元。不幸的是，眾所周知神經(jīng)元(CNS)組織的修復(fù)/再生能力有限。成人中新神經(jīng)元的產(chǎn)生主要限于二個(gè)區(qū)域側(cè)腦室的SVZ和齒狀腦回的顆粒下區(qū)(subgranularzone)。已證明可通過從SVZ遷移的內(nèi)源性前體干細(xì)胞實(shí)現(xiàn)有限的神經(jīng)元置換。關(guān)于特定神經(jīng)元產(chǎn)生的方法已有某些初步成功的報(bào)導(dǎo)，但這些方法在臨床上并不成功。因此，需要能克服本領(lǐng)域上述問題用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的方法和組合物。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)的方法，該方法包括提供神經(jīng)元前體細(xì)胞，和給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者足夠量的所述神經(jīng)元前體細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明涉及一種移植物形成單元，該單元包含神經(jīng)元前體細(xì)胞神經(jīng)元前體細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體，所述神經(jīng)元前體細(xì)胞存在的量足以在給予患者所述神經(jīng)元前體細(xì)胞后促進(jìn)患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)。還有一方面，本發(fā)明涉及促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)的方法，該方法包括提供骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞(neuronalcell)，和給予患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者足夠量的所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞。再有一方面，本發(fā)明涉及一種移植物形成單元，該單元包含骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體，所述神經(jīng)元細(xì)胞存在的量足以在給予患者所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞后促進(jìn)患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者神經(jīng)功能恢復(fù)。附圖的簡要說明圖1.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖2.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖3.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖4.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖5.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖6.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖7.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖8.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖9.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖10.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖11.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖12.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖13.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖14.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖15.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖16.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖17.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖18.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖19.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖20.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖22.顯示TGI方法的結(jié)果。圖23.顯示TGI方法的結(jié)果。圖24.顯示TGI方法的結(jié)果。圖25.顯示TGI方法的結(jié)果。圖26.顯示TGI方法的結(jié)果。圖27.顯示TGI方法的結(jié)果。圖28.顯示TGI方法的結(jié)果。圖29.顯示實(shí)施例的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果。圖30.顯示實(shí)施例的組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果。圖31.闡述了神經(jīng)功能的恢復(fù)和移植物的存活。圖32.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖33.顯示MCAo方法的結(jié)果。圖34.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖35.顯示MCAI方法的結(jié)果。圖36.顯示TGI方法的結(jié)果。圖37.顯示TGI方法的結(jié)果。圖38.闡述了移植物的存活。圖39.闡述了移植物的存活。圖40.顯示杠桿平衡試驗(yàn)(beambalancetest)的結(jié)果。移植后第28天，與MASC組和對(duì)照組相比，MNC組的平均評(píng)分顯示有顯著改進(jìn)。*P＜0.05，**P＜0.01。圖41.顯示肢體定位試驗(yàn)的結(jié)果。第21天和28天時(shí)MNC組和MASC組的平均評(píng)分顯著不同于對(duì)照組。MNC與MASC組之間無顯著差異*P＜0.05，**P＜0.01。圖42.顯示Morris水迷宮試驗(yàn)的結(jié)果。對(duì)最后一組，MNC組的平均潛伏時(shí)間與MASC和對(duì)照組的平均潛伏時(shí)間有顯著差異。圖43.顯示水迷宮“空間探索試驗(yàn)”的結(jié)果。三組中，MNC組獲得了最佳結(jié)果，MNC組與其它組之間具有顯著性差異，*P＜0.05，**P＜0.01。圖44.顯示實(shí)施例9中進(jìn)行的Bederson試驗(yàn)結(jié)果。圖45.顯示實(shí)施例9中進(jìn)行的EBST結(jié)果。圖46.說明實(shí)施例9的移植物存活。圖47.顯示實(shí)施例9的移植物存活。圖48.顯示實(shí)施例9的Nissi染色結(jié)果。發(fā)明詳述A.前言本發(fā)明人出乎意料和令人驚喜地發(fā)現(xiàn)上述問題和限制可通過實(shí)施本文所述的發(fā)明而克服。具體說，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)可通過提供NPC和MNC，和給予患中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的患者足夠量的這些NPC和/或MNC來促進(jìn)該患者的神經(jīng)功能恢復(fù)。本文公開的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。首先，提供了一種劑量依賴性關(guān)系，使醫(yī)生能根據(jù)患者個(gè)體確定外科手術(shù)方案以修補(bǔ)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。其次，提供了一種同種異體移植方法，可用此法特征鑒定NPC和/或MNC和/或移植物形成單元，和提供與細(xì)胞批次及移植方法相一致的GFU到GFU(或NPC到NPC，或MNC到MNC)。另外，采用NPC能夠比采用其它多能細(xì)胞更精確地重建中樞神經(jīng)系統(tǒng)。這是因?yàn)榉只瘯r(shí)神經(jīng)元前體細(xì)胞而不是其它類型的多能細(xì)胞明顯占大多數(shù)，因而不會(huì)分化成其它類型的細(xì)胞。這可能對(duì)試圖控制移植結(jié)局和限制植入細(xì)胞的不良生長(或未分化)時(shí)至關(guān)重要。還有，采用MNC很理想，因?yàn)樵摷?xì)胞是分化更好的多能細(xì)胞，可提供改進(jìn)的神經(jīng)功能恢復(fù)?，F(xiàn)在將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。B.定義本說明書中引用的所有出版物的內(nèi)容出于所有目的全體納入本文作為參考，如同各出版物專門和單獨(dú)納入本文作參考那樣?！敖o予”指向患者提供NPC和/或本發(fā)明的移植物?！皡^(qū)域”指范圍或確定的容積。例如，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)區(qū)域是位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一個(gè)范圍或確定的容積?！爸袠猩窠?jīng)系統(tǒng)局部缺血事件”或“CNS局部缺血事件”指患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)某區(qū)域的血流供應(yīng)發(fā)生中斷或生理上顯著減少。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，CNS局部缺血事件包括局部缺血性中風(fēng)?！爸袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷”或“CNS損傷”指由于CNS局部缺血或由于出血(如一優(yōu)選實(shí)施方式中為出血性中風(fēng))導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)某區(qū)域的神經(jīng)元組織被破壞、功能喪失或患病，或中樞神經(jīng)系統(tǒng)某區(qū)域神經(jīng)元周圍組織被破壞、功能喪失或患病。“中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織”指通常與中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)合在一起的組織。腦組織和脊髓組織是中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的非限定性例子。在涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織的本發(fā)明特定實(shí)施方式中，由于局部缺血導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織遭到破壞。發(fā)生的這種破壞通常可理解為失去了氧供應(yīng)和其它相關(guān)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，以及失去氧供應(yīng)和相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致產(chǎn)生的副產(chǎn)物?！肮δ芑謴?fù)”指通過測(cè)定神經(jīng)功能的特征性神經(jīng)生理學(xué)參數(shù)(即CBF、EEG、皮質(zhì)擴(kuò)張等)，或測(cè)定行為功能參數(shù)(如本文公開的或本領(lǐng)域已知的小鼠模型或其它模型的撫養(yǎng)幼鼠或聽聲驚跳)來確定CNS損傷區(qū)的CNS功能恢復(fù)。所檢測(cè)的變量傾向于接近正?；?qū)φ杖后w的觀察值時(shí)可確定功能恢復(fù)。通過合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢測(cè)方法，測(cè)定的參數(shù)值恢復(fù)到正?；?qū)φ杖后w觀察到的值時(shí)即為功能完全恢復(fù)。功能恢復(fù)也可能是不完全或部分的恢復(fù)。例如，某患者測(cè)定的參數(shù)可能是功能完全恢復(fù)，或恢復(fù)75％，或恢復(fù)50％等?！爸袠猩窠?jīng)系統(tǒng)功能恢復(fù)區(qū)域”指原先涉及損傷的CNS組織經(jīng)實(shí)施本發(fā)明后功能恢復(fù)的區(qū)域?！耙浦参镄纬蓡卧被颉癎FU”指一種組合物，其(1)含NPC和/或MNC及藥學(xué)上可接受的載體，(2)可將其給予患者。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，明白考慮NPC和MNC的混合物。在其它優(yōu)選實(shí)施方式中，采用NPC而基本上不用MNC。在還有其它優(yōu)選實(shí)施方式中，采用MNC而基本上不用NPC。“骨髓粘附性干細(xì)胞”指一類有絲分裂性多能細(xì)胞，它能產(chǎn)生各種類型的細(xì)胞骨細(xì)胞(成骨細(xì)胞)、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、和其它種類的結(jié)締組織細(xì)胞如肌腱中的細(xì)胞。“MASC-衍生的神經(jīng)元細(xì)胞(MNC)”指有絲分裂后的神經(jīng)元，其(1)衍生自骨髓粘附性干細(xì)胞，和(2)經(jīng)免疫組化測(cè)定表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記，在電生理分析實(shí)驗(yàn)中顯示神經(jīng)元性質(zhì)?？稍赑CT/JP03/01260中找到體外產(chǎn)生MNC的合適方法。本發(fā)明實(shí)施過程中也可采用本領(lǐng)域已知的其它產(chǎn)生MNC的方法，只要它們符合本文對(duì)MNC的定義。在一實(shí)施方式中，人MNC是MAP-2+、神經(jīng)纖絲-M+、和β微管蛋白III+(即TuJ-1+)。用PCT/JP03/01260公開的技術(shù)產(chǎn)生MNC后，可利用這些標(biāo)記以FACS分離MNC。通常知道處理MNC的合適方法，包括例如Carpenter的美國專利6,833,269中公開的那些方法?！癕CAo”指中腦動(dòng)脈堵塞。“MCAI”指中腦動(dòng)脈連通。“神經(jīng)元生成”指在患者組織的感興趣區(qū)域中產(chǎn)生(再生)神經(jīng)元和神經(jīng)組織，包括但不限于置換中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的受破壞神經(jīng)元?！吧窠?jīng)元前體細(xì)胞(NPC)”指衍生自MASC的有絲分裂性、能表達(dá)神經(jīng)元前體細(xì)胞/神經(jīng)元祖細(xì)胞特異性腦巢蛋白(nestin)和其它細(xì)胞標(biāo)記的細(xì)胞。NPC可分化成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，及任何上述細(xì)胞的前體細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，可按PCT/JP03/01260所述方法從骨髓粘附性干細(xì)胞(MASC)產(chǎn)生NPC。本發(fā)明實(shí)施過程中也可采用本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)來產(chǎn)生NPC，只要它們符合本文對(duì)NPC的定義。優(yōu)選NPC包括人NPC，雖然其它種類的哺乳動(dòng)物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一實(shí)施方式中，NPC中優(yōu)選的人NPC是CD29+、CD90+、CD105+、CD31-、CD34-和CD45-。用PCT/JP03/01260公開的技術(shù)產(chǎn)生NPC后，可利用這些標(biāo)記以FACS分離NPC，優(yōu)選分離人NPC。通常知道處理NPC的合適方法，包括例如Goldman等的美國專利申請(qǐng)20020012903中公開的那些方法?！吧窠?jīng)元”指構(gòu)成腦、脊柱和神經(jīng)的神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)細(xì)胞，它們由有核細(xì)胞體和一個(gè)或多個(gè)樹突及一條軸突組成。神經(jīng)元的生物化學(xué)特征是能與Map、神經(jīng)纖絲-M、和β微管蛋白III(即TuJ-1+)的抗體反應(yīng)。神經(jīng)元細(xì)胞另一特征是含有神經(jīng)遞質(zhì)合成酶或神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)蛋白，和能分泌神經(jīng)遞質(zhì)，如神經(jīng)肽Y和物質(zhì)P?！吧窠?jīng)元細(xì)胞(neuronal)”指神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，及它們?nèi)魏我环N的前體細(xì)胞?！盎颊摺敝感枰委熂膊』蚣不嫉膭?dòng)物，通常是哺乳動(dòng)物，更常是人?！八帉W(xué)上可接受的載體”指任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑、抗真菌劑、冷凍保護(hù)劑、等滲和吸收延緩劑等，它們應(yīng)與NPC或MNC的給藥相容。可用的介質(zhì)和藥物是該領(lǐng)域熟知的。除了迄今已知的與NPC或MNC不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或藥物外，考慮均可用于本發(fā)明的GFU中。“全身性”指患者的全身或基本上全身(給藥)?！敖M織”指生物體中一種由結(jié)構(gòu)和功能類似的細(xì)胞聚集組成的部分。本發(fā)明優(yōu)選的組織是神經(jīng)組織?！癟GI”指短暫性全腦缺血。“移植”使用時(shí)與“植入”同義，指在患者某區(qū)域中安置非內(nèi)源性細(xì)胞。移植可以是同種異體或非自身細(xì)胞的移植。移植也可以是自身或自體細(xì)胞移植，如同一患者的一處組織移到另一處。“轉(zhuǎn)分化的(transdifferentiated)”指某種細(xì)胞從其經(jīng)典相關(guān)類型沿譜系分化發(fā)育。A.NPC及其藥物組合物在一實(shí)施方式中，采用NPC作為GFU的一部分移植給患者來實(shí)施本發(fā)明。目的是使該NPC生長和分化成神經(jīng)元細(xì)胞，在患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的功能恢復(fù)中發(fā)揮作用。例如，NPC可分化為神經(jīng)元，替代受損傷的內(nèi)源神經(jīng)元。或者，NPC可分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元而分泌生長因子。這些生長因子對(duì)受損的神經(jīng)元具有營養(yǎng)活性可幫助它們恢復(fù)功能。以這種方式可治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。優(yōu)選的NPC和提供此NPC的優(yōu)選方法可參見Dezawa等的PCT/JP03/01260所述，題頭是“用轉(zhuǎn)染(transferring)Notch基因(“Dezawa”)使骨髓間質(zhì)細(xì)胞分化/誘導(dǎo)成為神經(jīng)元細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的方法”。具體說，可采用Dezawa描述的，具體是實(shí)施例7中描述的Dezawa“神經(jīng)元前體細(xì)胞”作為本發(fā)明的NPC細(xì)胞。Dezawa公開說，MASC可轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)元前體細(xì)胞，從而可用作本發(fā)明的NPC。在某些實(shí)施方式中，采用GFU來實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明GFU中所用的藥學(xué)上可接受的載體包括滅菌等滲緩沖液、FRS、isolyte、滅菌稀釋液如水、生理鹽水、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑或抗真菌劑，如抗壞血酸、硫柳汞、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲氧唑鹽、萘啶酮酸、烏洛托品馬尿酸鹽或硝化呋喃妥因粗晶鹽等；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；以及調(diào)節(jié)張力的制劑如氯化鈉或葡聚糖?？捎盟峄驂A，如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。在一實(shí)施方式中，適合用于本發(fā)明的移植物形成單元包括含NPC的滅菌組合物。對(duì)于靜脈給藥，合適的藥學(xué)上可接受的載體包括生理鹽水、normasol、isolyte、電解質(zhì)輸注液(plasma-lyte)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。所有例子中，GFU必須滅菌(除了存在的任何NPC和MNC外)并應(yīng)為液體成分而便于裝在針筒中注射(可保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，如利用卵磷脂等物質(zhì)，作為分散劑時(shí)應(yīng)維持一定的顆粒大小，和包含表面活性劑)。在如上所述的制造和貯存條件下，該GFU必須穩(wěn)定，必須防腐對(duì)抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染。某些情況下，優(yōu)選GFU中含有，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、氯化鈉、LiCl、丁酸鈉、和原釩酸鈉。通?？蓪PC結(jié)合到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和任選的上述其它成分的滅菌運(yùn)載體中來制備本發(fā)明的GFU。特別優(yōu)選將本發(fā)明的GFU配制成易于給藥和均勻給藥的移植物形成單位劑型。本文所用移植物形成單位劑型指作為一次劑量給予待治療對(duì)象的物理上分散的合適單位劑型。在一實(shí)施方式中，各GFU單位劑型含有經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的NPC和所需的藥學(xué)載體。在個(gè)體治療中，對(duì)本發(fā)明移植物形成單位劑型的規(guī)定直接取決于NPC的獨(dú)特特性、要達(dá)到的具體治療效果和制備NPC領(lǐng)域固有的局限性。每一移植物單位劑型中的NPC含量可不同，從約1000個(gè)細(xì)胞到10億個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選約10000個(gè)細(xì)胞到1億個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選約5萬個(gè)細(xì)胞到5千萬個(gè)細(xì)胞。每一移植單位劑型中的NPC濃度宜可不同，從約100個(gè)細(xì)胞/微升到10萬個(gè)細(xì)胞/微升，更優(yōu)選從約1000個(gè)細(xì)胞/微升到5萬個(gè)細(xì)胞/微升?？蓪PC裝在容器、包裝袋和分配器中，與給藥說明書一起包裝。此移植物優(yōu)選在約37℃保存。在某些實(shí)施方式中，可能需要先標(biāo)記NPC再移植。在臨床前(即除人以外的)動(dòng)物模型中可能需要追蹤移植NPC的遷移、移植NPC的分化、移植NPC的成活等等?？筛鶕?jù)臨床前環(huán)境(此環(huán)境下可閱讀標(biāo)記)采用各種標(biāo)記細(xì)胞方法。例如，可采用熒光蛋白(綠熒光蛋白、紅熒光蛋白等)，將檢測(cè)儀適當(dāng)放在植入部位附近的環(huán)境下檢測(cè)。當(dāng)要在非臨床條件下分析經(jīng)植入的腦時(shí)，可采用免疫組化分析。在一實(shí)施方式中，可用綠熒光蛋白(GFP)或其它細(xì)胞標(biāo)記β微管蛋白III、NeuN(神經(jīng)元特異性蛋白)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)或O4(一種少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白)進(jìn)行雙重免疫染色來鑒定神經(jīng)元、星形細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞情況?？砂凑誂bercrombie的校正公式估計(jì)某給定抗體陽性的細(xì)胞數(shù)和表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)?？蓽y(cè)定每5張切片中含有至少10％GFP-陽性細(xì)胞(或其它標(biāo)記陽性)的腦區(qū)面積，乘以離開腦前部含GFP-陽性(或其它標(biāo)記陽性)細(xì)胞的距離來計(jì)算GFP(或其它標(biāo)記)陽性細(xì)胞的體積和總數(shù)。在一實(shí)施方式中，用GFP標(biāo)記NPC時(shí)，以下材料是有用的材料凍存的NPC細(xì)胞，PBS(Invitrogen14190-1360)、HTS-FRS(BioLife溶液99-609-DV)、GFP-慢病毒貯存懸浮液滴度約為107/ml、溴化已脒定(聚凝胺polybrene，SigmaH-9268)-1或2支凍存等份@10mg/ml、滅菌水、USP、Opti-MEM(Invitrogen)和胎牛血清(Hyclone)?？蓮纳虡I(yè)上獲得GFP-慢病毒貯存懸浮液。或者可用商品化購得的試劑盒，如VirePower慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(得自Invitrogen，Carisbad，CA)制備。具體說，可按照制造商的說明將Plenti6/V5Gateway載體與GFP盒組合最后產(chǎn)生合適的慢病毒懸液。在一實(shí)施方式中，按照得自制造商如上述Invitrogen系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行標(biāo)記。在另一實(shí)施方式中，采用以下方法用GFP標(biāo)記NPC細(xì)胞除離心步驟外，細(xì)胞處理程序宜在2級(jí)生物安全柜中進(jìn)行。將10mg聚凝胺溶于1ml滅菌水(USP)中，過濾通過0.25微米濾膜制備聚凝胺貯備液。將得到的過濾貯備液分成等份，-20℃避光保存。病毒感染前一天，在含30ml細(xì)胞培養(yǎng)液的T225瓶中以每瓶2百萬個(gè)細(xì)胞的密度接種NPC細(xì)胞，在37℃/5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞過夜。病毒感染當(dāng)天，室溫下融化慢病毒貯存液，37℃水浴融化聚凝胺貯液。在50mlfalcon試管中加入45ml含10％FBS的預(yù)溫(37℃)αMEM培養(yǎng)液和5ml融化的病毒貯液，獲得MOI約為10的培養(yǎng)液。加入最終濃度10μg/ml(1000倍稀釋)融化的聚凝胺。去除T225瓶中的舊培養(yǎng)液，加入此病毒混合液來回輕輕搖動(dòng)3-4次。將培養(yǎng)瓶送回37℃/CO2培養(yǎng)箱中。次日，完全去除培養(yǎng)瓶中的病毒介質(zhì)。用含10％FBS的αMEM培養(yǎng)液洗滌(6×30ml)。每次洗滌取5ml進(jìn)行感染測(cè)試。加入新鮮培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶放回到培養(yǎng)箱中。次日，收獲病毒感染的細(xì)胞、計(jì)數(shù)和重懸于總體積360微升的HTS-FRS中。轉(zhuǎn)移到1.5ml無DNA酶、無RNA酶、無熱原的滅菌小離心管中。可沒置感染細(xì)胞的濃度與相應(yīng)的移植體積相比配。然后將此細(xì)胞保持在濕冰上直到用于移植。B.MNC及其藥物組合物在一實(shí)施方式中，采用MNC作為移植物的一部分移植給患者來實(shí)施本發(fā)明。目的是使該MNC在患者的感興趣組織區(qū)域功能恢復(fù)中發(fā)揮作用。以此種方式可治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。優(yōu)選的MNC和提供此MNC的優(yōu)選方法可參見Dezawa等的PCT/JP03/01260所述，題頭是“利用轉(zhuǎn)染Notch基因(“Dezawa”)使骨髓間質(zhì)細(xì)胞分化/誘導(dǎo)成為神經(jīng)細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的方法”。具體說，可采用Dezawa描述的，具體是實(shí)施例1中描述的Dezawa“神經(jīng)細(xì)胞”作為本發(fā)明的MNC細(xì)胞。Dezawa公開說，骨髓粘附性干細(xì)胞可轉(zhuǎn)分化成為神經(jīng)元細(xì)胞，從而可用作本發(fā)明的MNC。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，利用神經(jīng)營養(yǎng)制劑從NPC產(chǎn)生MNC。有用的神經(jīng)營養(yǎng)制劑包括但不限于堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)。利用神經(jīng)營養(yǎng)因子體外誘導(dǎo)NPC的合適方法可參見PCT/JP03/01260。在一些實(shí)施方式中，可用GFU來實(shí)施本發(fā)明。GFU中所用的藥學(xué)上可接受的載體包括滅菌等滲緩沖液、FRS、isolyte、滅菌稀釋液如水、生理鹽水、非揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌劑或抗真菌劑，如抗壞血酸、硫柳汞、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲氧唑鹽、萘啶酮酸、烏洛托品馬尿酸鹽或硝化呋喃妥英粗晶鹽等；抗氧化劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；以及調(diào)節(jié)張力的制劑如氯化鈉或葡聚糖。可用酸或堿，如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。在一實(shí)施方式中，適合用于本發(fā)明的移植物形成單元包括含MNC的滅菌組合物。對(duì)于靜脈給藥，合適的藥學(xué)上可接受的載體包括生理鹽水、CremophorEL.TM.(BASF；Parsippany，N，J.)、normasol、isolyte、電解質(zhì)輸注液或磷酸緩沖鹽水(PBS)。所有例子中，GFU必須滅菌(除存在的任何NPC或MNC外)并應(yīng)為液體成分而便于裝在針筒中注射(可保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，如利用卵磷脂等物質(zhì)，作為分散劑時(shí)應(yīng)維持一定的顆粒大小，和包含表面活性劑)。在如上所述的制造和貯存條件下，該GFU必須穩(wěn)定，必須防腐對(duì)抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染。某些情況下，優(yōu)選GFU中含有，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨糖醇、氯化鈉、LiCl、丁酸鈉、和原釩酸鈉。通?？蓪PC結(jié)合入到含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和任選的上述其它成分的滅菌運(yùn)載體中來制備本發(fā)明的GFU。特別優(yōu)選將本發(fā)明的GFU配制成易于給藥和均勻給藥的移植物形成單位劑型。本文所用移植物形成單位劑型指作為一次劑量給予待治療對(duì)象的物理上分散的合適單位劑型。在一實(shí)施方式中，各GFU單位劑型含有經(jīng)計(jì)算能產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的NPC和所需的藥學(xué)載體。在個(gè)體治療中，對(duì)本發(fā)明移植物形成單位劑型的規(guī)定直接取決于MNC的獨(dú)特特性、要達(dá)到的具體治療效果和制備MNC領(lǐng)域固有的局限性。每一移植物單位劑型中的MNC含量可不同，從約1000個(gè)細(xì)胞到10億個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選約10000個(gè)細(xì)胞到1億個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選約5萬個(gè)細(xì)胞到5千萬個(gè)細(xì)胞。每一移植單位劑型中的MNC濃度宜可不同，從約100個(gè)細(xì)胞/微升到10萬個(gè)細(xì)胞/微升，更優(yōu)選從約1000個(gè)細(xì)胞/微升到5萬個(gè)細(xì)胞/微升?？蓪FU裝在容器、包裝袋和分配器中，與給藥說明書一起包裝。此移植物優(yōu)選在約4℃保存。在某些非臨床實(shí)施方式中，可能需要先標(biāo)記MNC再移植?？赡苄枰粉櫼浦驳腗NC遷移、移植的MNC進(jìn)一步的變化、移植的NPC成活等等?？筛鶕?jù)閱讀標(biāo)記的環(huán)境采用各種細(xì)胞標(biāo)記方法。例如，可采用熒光蛋白(綠熒光蛋白、紅熒光蛋白等)，將檢測(cè)儀適當(dāng)放在植入部位附近的環(huán)境下檢測(cè)。當(dāng)要在非臨床條件下分析經(jīng)植入的腦時(shí)，可采用免疫組化分析。在一實(shí)施方式中，可用綠熒光蛋白(GFP)或其它細(xì)胞標(biāo)記如β微管蛋白III、NeuN(神經(jīng)元特異性蛋白)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)或O4(一種少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白)進(jìn)行雙重免疫染色來鑒定神經(jīng)元、星形細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞或少突膠質(zhì)細(xì)胞的情況?？砂凑誂bercrombie的校正公式估計(jì)某給定抗體陽性的細(xì)胞數(shù)和表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)?？蓽y(cè)定每5張切片中含有至少10％GFP-陽性(或其它標(biāo)記陽性)細(xì)胞的腦區(qū)面積，乘以離開腦前部含GFP-陽性(或其它標(biāo)記陽性)細(xì)胞的距離來計(jì)算GFP(或其它標(biāo)記)陽性細(xì)胞的體積和總數(shù)。在一實(shí)施方式中，可通過pBabeneo-GFP載體用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染來標(biāo)記MNC。M.Dezawa等“通過植入體外分化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)大鼠坐骨神經(jīng)再生”EurJNeurosci.2001.141771-6?？筛倪M(jìn)此法將其它熒光蛋白摻入此載體中。C.NPC移植在一實(shí)施方式中，可采用常規(guī)給藥方法和途徑給予本發(fā)明的NPC和/或GFU，可利用常規(guī)確定劑量范圍的技術(shù)優(yōu)化給予患者的NPC和/或GFU劑量?？蓡为?dú)或與其它藥物或組合物一起給予本發(fā)明的NPC和/或GFU。給藥途徑可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)給藥途徑。考慮可用各種方法，包括但不限于通過注射導(dǎo)管、針或旁路導(dǎo)管灌注，或包埋在運(yùn)載體如生物可降解的膠囊內(nèi)進(jìn)行移植，但其它給藥途徑也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。可全身，例如胃腸外途徑如靜脈內(nèi)(I.V)給予本發(fā)明的NPC和/或GFU，或優(yōu)選的全身給藥途徑是動(dòng)脈內(nèi)(如通過頸內(nèi)或頸外動(dòng)脈)給藥。全身給藥技術(shù)可取自通常給予前體細(xì)胞的技術(shù)，如DLu等“動(dòng)脈內(nèi)給予創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型骨髓基質(zhì)細(xì)胞”J.Neurotrauma.2001Aug，18(8)813-9所述的技術(shù)。在實(shí)施方式中，可將本發(fā)明的NPC和/或GFU給予患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過腦實(shí)質(zhì)內(nèi)途徑給予本發(fā)明的NPC和/或GFU?；颊咧袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷處局部給予本發(fā)明的NPC和/或GFU的優(yōu)點(diǎn)是可減少患者血腦屏障內(nèi)側(cè)免疫系統(tǒng)的激活。因此可降低宿主免疫排斥該NPC的機(jī)會(huì)，和(即使仍然要用免疫抑制劑)提高移植物存活的機(jī)會(huì)。局部給藥的另一優(yōu)點(diǎn)是能使NPC精確靶向CNS損傷處。當(dāng)要植入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷處時(shí)，可用立體定位外科手術(shù)進(jìn)行移植。此方法要麻醉患者。將患者的頭安置在與MRI相容的立體定位框架中，用安置在頭顱上的攜帶有顯微注射器的顯微定位儀定位?？捎醚揽沏@或其它合適的儀器在患者的顱骨上鉆孔暴露靶部位上方的硬腦膜區(qū)域。在一實(shí)施方式中，采用26號(hào)針和Hamilton顯微注射器(或其它大小合適的針筒)鉆孔，此時(shí)用MRI攝象手動(dòng)操縱引導(dǎo)注射針到植入部位以確保NPC和/或GFU的正確定位。植入部位的注射優(yōu)選推注。輸注的速度可不同，優(yōu)選的輸注體積每分鐘約0.1-10微升，更優(yōu)選每分鐘約0.5-5微升，還要優(yōu)選每分鐘約1.0-3.0微升。在一實(shí)施方式中，輸注后注射針可留置一段時(shí)間，優(yōu)選約1-10分鐘，更優(yōu)選約5分鐘。在注射針留置此段時(shí)間后可將注射針拔出一點(diǎn)，優(yōu)選約1-10mm，更優(yōu)選約2mm，然后在該位置再保持一些時(shí)間，優(yōu)選約5-30分鐘，更優(yōu)選約15分鐘。然后從患者中取出注射器，用解剖襯墊層閉合傷口部位，監(jiān)視患者從麻醉恢復(fù)。如需要，作為手術(shù)/手術(shù)后程序，給予止痛藥(如丁丙諾啡)和抗菌素(如頭孢唑啉Cephazolin，50mg/kg.肌內(nèi)，每天二次，共5天)?？咕刂委熆稍谛g(shù)后持續(xù)一段時(shí)間，優(yōu)選直到術(shù)后30天以抑制機(jī)會(huì)感染。其它植入技術(shù)可參見KSBankiewicz等“利用一種自動(dòng)化輸送系統(tǒng)在猴顱內(nèi)雙側(cè)植入細(xì)胞的技術(shù)”CellTransplantation.9(5)595-607(2000)。在某些實(shí)施方式中，可一起給予免疫抑制劑和本發(fā)明的移植物和/或NPC。這些制劑可幫助抑制患者免疫系統(tǒng)對(duì)NPC的排斥，特別是當(dāng)全身給予移植物和/或NPC時(shí)?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的免疫抑制劑的例子包括但不限于抗代謝藥如硫唑嘌呤、烷化劑如環(huán)磷酰胺、葉酸拮抗劑如甲氨蝶呤或巰基嘌呤(6-MP)、霉酚酸鹽(CellCept)、環(huán)孢菌素A和Tacrolimus(FK-506)。優(yōu)選的免疫抑制劑是CsA。CsA可獲自各種來源，包括NovartisPharmaAG，Basel，Switzeland的Novartis藥物制造公司(Novartis)，EastHanover，NJ制造的注射用可通過各種途徑，包括口服、腹腔內(nèi)和靜脈內(nèi)給予免疫抑制劑。劑量可根據(jù)免疫抑制劑的性質(zhì)和患者而不同。在一實(shí)施方式中，移植前二天給予免疫抑制劑然后以適當(dāng)間隔持續(xù)給予。在一實(shí)施方式中，移植當(dāng)天(約在術(shù)后4小時(shí))開始給予免疫抑制劑然后間隔24小時(shí)持續(xù)給予。劑量范圍優(yōu)選在每天約0.5-100mg/kg，更優(yōu)選每天約5-75mg/kg，還要優(yōu)選每天約5-50mg/kg?？伸o脈內(nèi)推注給予，速度范圍優(yōu)選每分鐘約0.005-0.100ml，更優(yōu)選每分鐘約0.050ml?？捎贸Ｒ?guī)方法和常規(guī)途徑給予本發(fā)明的NPC和/或GFU，可利用常規(guī)確定劑量范圍的技術(shù)優(yōu)化給予患者的NPC和/或GFU劑量?？蓡为?dú)或與其它藥物或組合物一起給予本發(fā)明的NPC和/或GFU。給藥途徑可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)給藥途徑。考慮可用各種方法，包括但不限于通過注射導(dǎo)管、針或旁路導(dǎo)管灌注，或包埋在運(yùn)載體如生物可降解的膠囊內(nèi)進(jìn)行移植，但其它給藥途徑也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在實(shí)施方式中，可將本發(fā)明的NPC和/或GFU給予患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過腦實(shí)質(zhì)內(nèi)途徑給予本發(fā)明的NPC和/或GFU。患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷處局部給予本發(fā)明的NPC和/或GFU的優(yōu)點(diǎn)是可減少患者血腦屏障內(nèi)側(cè)免疫系統(tǒng)的激活。因此可降低宿主免疫排斥該NPC的機(jī)會(huì)，和(即使仍然要用免疫抑制劑)提高移植物存活的機(jī)會(huì)。局部給藥的另一優(yōu)點(diǎn)是能使NPC精確靶向CNS損傷處。D.MASC驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)元細(xì)胞移植在一實(shí)施方式中，可用常規(guī)方法和常規(guī)途徑給予本發(fā)明的MNC和/或GFU，可利用常規(guī)確定劑量范圍的技術(shù)優(yōu)化給予患者的MNC和/或GFU劑量?？蓡为?dú)或與其它藥物或組合物一起給予本發(fā)明的MNC和/或GFU。給藥途徑可選自本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)給藥途徑。考慮可用各種方法，包括但不限于通過注射導(dǎo)管、針或旁路導(dǎo)管灌注，或包埋在運(yùn)載體如生物可降解的膠囊內(nèi)進(jìn)行移植，但其它給藥途徑也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。在實(shí)施方式中，可將本發(fā)明的MNC和/或GFU給予患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，可通過腦實(shí)質(zhì)內(nèi)途徑給予本發(fā)明的MNC和/或GFU?；颊咧袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷處局部給予本發(fā)明的MNC和/或GFU的優(yōu)點(diǎn)是可減少患者血腦屏障內(nèi)側(cè)免疫系統(tǒng)的激活。因此可降低宿主免疫排斥該MNC的機(jī)會(huì)，和(即使仍然要用免疫抑制劑來)提高移植物存活的機(jī)會(huì)。局部給藥的另一優(yōu)點(diǎn)是能使MNC精確靶向CNS損傷處。當(dāng)要植入到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷處時(shí)，可用立體定位外科手術(shù)進(jìn)行移植。此方法要麻醉患者。將患者的頭安置在與MRI相容的立體定位框架中，用安置在頭顱上的攜帶有顯微注射器的顯微定位儀定位。可用牙科鉆或其它合適的儀器在患者的顱骨上鉆孔以暴露靶部位上方的硬腦膜區(qū)域。在一實(shí)施方式中，采用26號(hào)針和Hamilton顯微注射器(或其它大小合適的針筒)鉆孔，此時(shí)在MRI攝象下手動(dòng)操縱引導(dǎo)注射針到植入部位以確保MNC和/或GFU的正確定位。植入部位的注射優(yōu)選推注。輸注的速度可不同，優(yōu)選的輸注體積每分鐘約0.1-10微升，更優(yōu)選每分鐘約0.5-5微升，還要優(yōu)選每分鐘約1.0-3.0微升。在一實(shí)施方式中，輸注后可留置注射針一段時(shí)間，優(yōu)選約1-10分鐘，更優(yōu)選約5分鐘。在注射針留置此段時(shí)間后可將注射針拔出一點(diǎn)，優(yōu)選約1-10mm，更優(yōu)選約2mm，然后在該位置再保持一些時(shí)間，優(yōu)選約5-30分鐘，更優(yōu)選約15分鐘。然后從患者中取出注射器，用解剖襯墊層閉合傷口部位，監(jiān)視患者從麻醉恢復(fù)。如需要，作為手術(shù)/手術(shù)后程序，可給予止痛藥(如丁丙諾啡)和抗菌素(如頭孢唑啉，50mg/kg.肌肉內(nèi)，每天二次，共5天)。術(shù)后抗菌素治療可持續(xù)一段時(shí)間，優(yōu)選直到術(shù)后30天以抑制機(jī)會(huì)感染。其它植入技術(shù)可參見KSBankiewicz等“利用自動(dòng)化輸送系統(tǒng)在猴顱內(nèi)雙側(cè)植入細(xì)胞的技術(shù)”CellTransplantation.9(5)595-607(2000)。在某些實(shí)施方式中，可一起給予免疫抑制劑和本發(fā)明的移植物和/或MNC。這些制劑可幫助抑制患者免疫系統(tǒng)對(duì)MNC的排斥?？捎糜趯?shí)施本發(fā)明的免疫抑制劑的例子包括但不限于抗代謝藥如硫唑嘌呤、烷化劑如環(huán)磷酰胺、葉酸拮抗劑如甲氨蝶呤或巰基嘌呤(6-MP)、霉酚酸鹽(CellCept)、環(huán)孢菌素A和Tacrolimus(FK-506)。優(yōu)選的免疫抑制劑是CsA。CsA可獲自各種來源，包括NovartisPharmaAG，Basel，Switzeland的Novartis藥物制造公司(Novartis)，EastHanover，NJ制造的注射用可通過各種途徑，包括口服、腹腔內(nèi)和靜脈內(nèi)給予免疫抑制劑。劑量可根據(jù)免疫抑制劑的性質(zhì)和患者而不同。在一實(shí)施方式中，移植前二天給予免疫抑制劑然后以適當(dāng)間隔持續(xù)給予。在一實(shí)施方式中，移植當(dāng)天(約在術(shù)后4小時(shí))開始給予免疫抑制劑然后間隔24小時(shí)持續(xù)給予。劑量范圍優(yōu)選每天約0.5-100mg/kg，更優(yōu)選每天約5-75mg/kg，，還要優(yōu)選每天約5-50mg/kg?？伸o脈內(nèi)推注給予，速度范圍優(yōu)選每分鐘約0.005-0.100ml，更優(yōu)選每分鐘約0.050ml。E.NPC的實(shí)驗(yàn)觀察和優(yōu)點(diǎn)雖然本發(fā)明考慮可移植自體或同種異體的NPC，包括含NPC的藥物組合物，但優(yōu)選同種異體移植(同種動(dòng)物的移植物形成單位)。在一實(shí)施方式中，同種異體移植模擬了在患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者中發(fā)生的同種異體移植NPC時(shí)的臨床狀況。本文公開了在患中腦動(dòng)脈栓塞(MCAo)、中腦動(dòng)脈結(jié)扎(MCAI)或暫時(shí)性全腦缺血(TGI)的成年雌性Sprague-Dawley大鼠腦中立體定位植入本發(fā)明NPC的結(jié)果。這些動(dòng)物模型可用于了解本發(fā)明治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的效果。這些模型的進(jìn)一步討論可參見文獻(xiàn)，具體為C.Borlongan等“移植凍存的人胚胎癌衍生的神經(jīng)元(NT2N細(xì)胞)促進(jìn)了局部缺血大鼠的功能恢復(fù)”，ExpNeurol，1998，149310-21和C.Borlongan等“褪黑激素誘導(dǎo)提高了膠質(zhì)細(xì)胞的存活對(duì)腦缺血提供了神經(jīng)保護(hù)”，F(xiàn)ASEBJ，2000，141307-17。每只中風(fēng)動(dòng)物接受含有4萬、10萬和20萬(下文中這些數(shù)量應(yīng)理解為大約數(shù)量)活NPC細(xì)胞三種劑量之一的移植物。中風(fēng)后6周進(jìn)行移植，整個(gè)移植后存活期間每天用環(huán)孢菌素A(10mg/kg，i.p)免疫抑制動(dòng)物。移植后4周內(nèi)每周分析移植大鼠的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知行為的特征，移植后12周再進(jìn)行一次。移植后5周和12周用組織學(xué)方法檢查隨機(jī)選擇的動(dòng)物腦局部缺血的程度和移植物的存活。在最后確定中風(fēng)手術(shù)和移植效果時(shí)采用了以下試驗(yàn)以更詳細(xì)描述。進(jìn)行這些試驗(yàn)的方法見本文中所述，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的。表1.NPC移植效果的參數(shù)檢測(cè)目的EBST揭示中風(fēng)后的運(yùn)動(dòng)缺陷和移植后的恢復(fù)神經(jīng)學(xué)檢查揭示中風(fēng)后的感覺-運(yùn)動(dòng)異常和移植后的恢復(fù)Morris水迷宮揭示中風(fēng)后的認(rèn)知缺陷和移植后的恢復(fù)TTC組織學(xué)檢查揭示腦梗塞程度GFAP揭示腦梗塞程度和對(duì)移植物的宿主免疫應(yīng)答GFP病毒載體提示移植的NPC細(xì)胞的存活與遷移Neu-N提示移植的NPC細(xì)胞表達(dá)的神經(jīng)元表型EBST提高身體轉(zhuǎn)向試驗(yàn)；TTC氯化三苯四唑；GFAP膠質(zhì)細(xì)胞纖原酸性蛋白。以下實(shí)施例中獲得的數(shù)據(jù)顯示在所研究的模型中，移植了NPC的動(dòng)物顯示運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知行為與移植前基線行為相比有顯著改善。二種較高劑量(約10萬個(gè)和約20萬個(gè)細(xì)胞)比較低劑量(約4萬細(xì)胞)顯示行為效果更加改善，提示劑量-效應(yīng)有關(guān)。觀察到早至移植后一周中風(fēng)導(dǎo)致的行為缺陷已有實(shí)質(zhì)性恢復(fù)并持續(xù)超過移植后4周。觀察到所有三種類型的中風(fēng)中運(yùn)動(dòng)行為都有顯著改善(用提高身體轉(zhuǎn)向試驗(yàn)和Bederson試驗(yàn)評(píng)價(jià))。相對(duì)地，與MCAI移植動(dòng)物相比，MCAo和TGI移植動(dòng)物認(rèn)知行為的顯著改善更顯著更穩(wěn)定(用Morris水迷宮檢測(cè))。研究期間所有中風(fēng)動(dòng)物移植后看起來健康，沒發(fā)現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。中風(fēng)的類型看來是影響功能恢復(fù)的一種因素，即雖然所有的中風(fēng)動(dòng)物顯示運(yùn)動(dòng)行為有顯著改善，但MCAo和TGI移植動(dòng)物的認(rèn)知行為比MCAI移植動(dòng)物恢復(fù)得更好。MCAo和TGI移植動(dòng)物中運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能顯著恢復(fù)的現(xiàn)象提示，分別產(chǎn)生基底神經(jīng)節(jié)和海馬損傷的這二種中風(fēng)模型對(duì)NPC植入有反應(yīng)。探索這些觀察結(jié)果在臨床中的應(yīng)用將表明，患固定基底神經(jīng)節(jié)和海馬中風(fēng)的患者可能受益于NPC移植。移植后5周和12周組織學(xué)檢查結(jié)果表明，存活的NPC導(dǎo)致了所觀察到的功能改善。這些資料提示，植入10萬和20萬個(gè)NPC比低劑量的4萬個(gè)細(xì)胞使行為恢復(fù)得更好。移植物存活與行為恢復(fù)效果之間的相關(guān)性分析進(jìn)一步支持以下觀點(diǎn)存活的NPC細(xì)胞促進(jìn)了中風(fēng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知恢復(fù)。注意，移植物存活是用慢病毒標(biāo)記方法測(cè)定的，此法能可靠地標(biāo)記移植的NPC。用此法也易于追蹤NPC的遷移。取決于中風(fēng)的類型，看來如MCAo和MCAI中所見，腦損傷越重，NPC遷移得越好。相反，TGI所導(dǎo)致的中度腦損傷中該細(xì)胞的遷移較差。觀察到NPC能越過較長距離到達(dá)損傷部位，提示它能夠遷移到特定的中風(fēng)靶部位發(fā)揮修復(fù)作用。以下實(shí)施例提供的結(jié)果支持以下觀點(diǎn)遷移的NPC很可能分化成為神經(jīng)元表型。許多因素可能影響到遷移細(xì)胞的優(yōu)先分化，包括但不限于宿主的微環(huán)境和中風(fēng)類型(部位和程度/死亡細(xì)胞的類型)。F.MNC的實(shí)驗(yàn)觀察和優(yōu)點(diǎn)雖然本發(fā)明考慮可移植自體或同種異體的MNC，包括含MNC的藥物組合物，但優(yōu)選同種異體移植(同種動(dòng)物的移植物形成單位)。在一實(shí)施方式中，同種異體移植模擬了在患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者中發(fā)生的同種異體移植MNC時(shí)的臨床狀況。在以下J章節(jié)中提供了在中風(fēng)動(dòng)物模型中移植同種異體MNC的動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果。這些動(dòng)物模型可用于了解本發(fā)明治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的效果。章節(jié)H的結(jié)果提示，在行為評(píng)估試驗(yàn)中，與對(duì)照組和MASC組相比，MNC組顯示顯著性改善。組織學(xué)分析中，MCAo后41天時(shí)測(cè)定的梗塞面積顯示三組之間無顯著性差異。與MASC相比，MNC顯示較高的存活率，宿主腦中較大比例的MNC顯示神經(jīng)元標(biāo)記陽性和軸突延伸。在行為評(píng)估試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，MASC組顯示有輕度改善但不如MNC組。本發(fā)明MNC移植的另一優(yōu)點(diǎn)是，與例如多能MASC相比，MNC的存活率更高。移植后一個(gè)月，檢測(cè)到約30-45％移植的MNC，而只檢測(cè)到10-20％移植的MASC。MNC的較高存活率對(duì)功能恢復(fù)有益。在近年的研究中，觀察到在宿主腦的皮質(zhì)、紋狀體和海馬中某些MNC產(chǎn)生了延伸的軸突，但在MASC組中沒觀察到。因此MNC組顯著性行為改善提示，移植的MNC在宿主腦中維持了神經(jīng)元特征，對(duì)MCAo大鼠模型的功能恢復(fù)有貢獻(xiàn)。G.NPC實(shí)施例本文提供這些實(shí)施例的目的是說明而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)方案所有動(dòng)物先接受MCAo、MCAI或TGI中風(fēng)手術(shù)。術(shù)后約6周用提高身體轉(zhuǎn)向試驗(yàn)、bederson試驗(yàn)、Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)動(dòng)物。只用隨后出現(xiàn)明顯運(yùn)動(dòng)缺陷的動(dòng)物進(jìn)行移植手術(shù)并隨機(jī)分配至以下各治療組。表2給出了此項(xiàng)研究各分支的樣品大小。表2.治療狀況此項(xiàng)研究所用的大鼠總數(shù)所有動(dòng)物經(jīng)歷中風(fēng)手術(shù)，接受3針(MCAo和MCAI)或2針(TGI)注射細(xì)胞，并每天用環(huán)孢菌素A(10mg/kg，i.p)治療。移植后前4周每周檢測(cè)動(dòng)物情況。移植后第5周一半動(dòng)物安樂死作腦梗塞、移植物存活、表型表達(dá)和細(xì)胞遷移的組織學(xué)分析。其余動(dòng)物用于評(píng)估長期行為，中風(fēng)后第12周安樂死作NPC的組織學(xué)檢查。為了說明，以下提供了流程圖。中風(fēng)手術(shù)↓行為試驗(yàn)(中風(fēng)后6周，此項(xiàng)研究只包括達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物)↓移植(中風(fēng)后第6周)↓行為試驗(yàn)(移植后4周內(nèi)第周一次和第12周用GFP慢病毒載體系統(tǒng)標(biāo)記細(xì)胞GFP慢病毒系統(tǒng)由日內(nèi)瓦大學(xué)(Geneva，Switzerland)的DidierTrono博士提供。用以下通用方法標(biāo)記NPC細(xì)胞。此法耐受微小變異。所需材料10mg/ml聚凝胺貯備液/過濾除菌(Sigma)Opti-MEM培養(yǎng)液(Gibco/Invitrogen)1％胎牛血清和抗菌素(青霉素/鏈霉素)6孔板約1X106個(gè)San-Bio細(xì)胞病毒懸浮液詳細(xì)步驟1.在37℃培養(yǎng)箱中溫?zé)峒?xì)胞培養(yǎng)液。2.加入聚凝胺至10μg/ml(將10微升10mg/ml聚凝胺貯備液加入到10ml培養(yǎng)液中，充分混勻。)3.在另一試管中將1ml病毒懸浮液加到1ml含聚凝胺的培養(yǎng)液中。4.在37℃水浴中快速溶化一小瓶SanBio細(xì)胞。用70％乙醇淋洗小瓶擦干。5.將全部內(nèi)容物加入到一裝有10ml預(yù)溫PBS的15ml離心管中；輕輕混合，在臨床用低速離心機(jī)中室溫下1000RPM離心5分鐘。6.輕輕抽吸上清液并將細(xì)胞顆粒重懸在2ml含有病毒的預(yù)溫培養(yǎng)液(步驟3)中。7.將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到6孔板的一孔中，放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)。8.用10ml預(yù)溫的PBS洗滌細(xì)胞二次。9.用20微升PBS或所選培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移到1.5ml小離心管中。冰上保持。細(xì)胞已準(zhǔn)備好移植。行為試驗(yàn)在本發(fā)明的藥理學(xué)研究中檢測(cè)動(dòng)物的以下感覺運(yùn)動(dòng)行為和認(rèn)知行為提高身體的轉(zhuǎn)向試驗(yàn)(ElevatedBodySwingTest，EBST)Morris水迷宮試驗(yàn)Bederson神經(jīng)學(xué)評(píng)分提高身體的轉(zhuǎn)向試驗(yàn)(EBST)提高身體的轉(zhuǎn)向試驗(yàn)(EBST)檢測(cè)基礎(chǔ)性體位反射功能和不對(duì)稱軀干功能。已證明實(shí)驗(yàn)鼠在MCAo和MCAI局部缺血后顯示EBST有長期缺陷。C.Boriongan等“中腦動(dòng)脈梗塞后的運(yùn)動(dòng)和被動(dòng)回避缺失”PhysiolBehav.1995，58909-17。也參見C.Boriongan等“成功堵塞中腦動(dòng)脈時(shí)運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)的早期評(píng)價(jià)”，Neuroreport.1998b，93615-21。對(duì)慢性中風(fēng)的神經(jīng)元移植范例也作了評(píng)價(jià)。C.Boriongan等“成功堵塞中腦動(dòng)脈時(shí)運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)的早期評(píng)價(jià)”，Neuroreport.1998；93615-21。EBST包括手握住動(dòng)物的尾巴和記錄其頭轉(zhuǎn)向的方向。實(shí)驗(yàn)裝置為透明的普列克斯玻璃(plexiglas)盒(40x40x35.5cm)。輕輕握住動(dòng)物的尾根部，提起尾巴直到動(dòng)物的鼻子離開地表面2英寸。記數(shù)鼠頭向兩側(cè)運(yùn)動(dòng)偏離身體中線約10度的左或右轉(zhuǎn)次數(shù)。一次轉(zhuǎn)向試驗(yàn)后，將動(dòng)物放回普列克斯玻璃盒中讓其自由活動(dòng)30秒再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每只動(dòng)物重復(fù)這些步驟20次。正常大鼠顯示轉(zhuǎn)向差別(swingbias)為50％，即左轉(zhuǎn)和右轉(zhuǎn)的次數(shù)相同。75％轉(zhuǎn)向差別表示20次試驗(yàn)中15次轉(zhuǎn)向一側(cè)5次轉(zhuǎn)向另一側(cè)。先前的EBST工作發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)(nigrostriatal)腦損傷動(dòng)物在損傷后一個(gè)月出現(xiàn)＞75％的轉(zhuǎn)向運(yùn)動(dòng)差異，這種不對(duì)稱性可保持6個(gè)月。Bederson神經(jīng)學(xué)檢查Bederson神經(jīng)學(xué)評(píng)分檢查的是感覺運(yùn)動(dòng)功能。JBederson等“大鼠中腦動(dòng)脈栓塞神經(jīng)學(xué)檢查的模型和開發(fā)評(píng)價(jià)”Stroke.1986.17472-6；MAltumbabic，“大鼠的腦內(nèi)出血血腫抽吸術(shù)的效果”Stroke.1998，291917-22。先前工作表明，在大鼠MCAo和MCAI中風(fēng)模型中，如Bederson模式那樣可檢測(cè)到這段時(shí)間中有神經(jīng)學(xué)缺陷。按上述步驟在EBST后約1小時(shí)進(jìn)行Bederson神經(jīng)學(xué)檢查。4種試驗(yàn)得到各個(gè)大鼠的神經(jīng)學(xué)評(píng)分，包括(a)觀察有無自發(fā)性同側(cè)轉(zhuǎn)圈，分?jǐn)?shù)0(不轉(zhuǎn)圈)-3分(不停轉(zhuǎn)圈)；(b)對(duì)側(cè)后肢回縮，待測(cè)動(dòng)物在其后肢側(cè)移2-3cm后能否恢復(fù)原位，0分(立即回縮)，3分(幾分鐘后回縮或不能回縮)；(c)杠桿行走能力，0分(大鼠在2.4cm寬80cm長的杠桿上行走容易)，3分(大鼠在杠桿上不能站穩(wěn)10秒鐘)；和(d)雙側(cè)前爪握持力，檢測(cè)握住2mm直徑鋼棍的能力，0分(大鼠前爪握持力正常)，3分(大鼠不能用前爪握持)。每個(gè)評(píng)估日進(jìn)行所有4次試驗(yàn)，各15分鐘，評(píng)分相加得到神經(jīng)缺陷評(píng)分(最大可能評(píng)分為12分)。Morris水迷宮(MWM)試驗(yàn)Morris水迷宮試驗(yàn)可評(píng)估幾個(gè)方面的認(rèn)知功能，包括任務(wù)的獲得和保留、尋找方法和堅(jiān)持。推測(cè)水迷宮任務(wù)試驗(yàn)對(duì)受MCAo影響的幾處腦區(qū)域包括紋狀體和前額皮層損傷敏感。在Bederson神經(jīng)學(xué)檢查后約1小時(shí)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)以評(píng)估空間立體記憶。Morris水迷宮試驗(yàn)設(shè)備為直徑6英寸深3英寸的可充氣槽。在該槽中加入12cm的水和300ml牛奶使其不透明。將具有直徑10cm園形表面的用透明普列克斯玻璃制作的11cm高平臺(tái)放入此水槽中4位置之一。平臺(tái)低于水面1cm如此不讓水中的動(dòng)物看見。將此水槽分成4等份，每份面積相等。將測(cè)試鼠放入水槽中面朝向槽外側(cè)，從4個(gè)起始位置之一(東、南、西、北)釋放，這些位置是隨機(jī)確定的，距水槽邊緣相等距離任意定位。平臺(tái)位于南西象限中部距水槽邊緣25cm。每次試驗(yàn)后改變起始點(diǎn)。給動(dòng)物約60秒尋找平臺(tái)和在平臺(tái)上休息約30秒鐘，再放回起始點(diǎn)。從隨機(jī)確定的起始點(diǎn)共進(jìn)行3次試驗(yàn)。如果大鼠在約60秒內(nèi)不能找到隱藏的平臺(tái)，則將其放到平臺(tái)上休息約30秒鐘。休息后將大鼠放回水槽再測(cè)試2次。共包括3次測(cè)試訓(xùn)練。第2天進(jìn)行測(cè)試(探索試驗(yàn)，見下文)。每次訓(xùn)練和測(cè)試后將大鼠放回底部裝有加熱墊的籠子中。用連接計(jì)算機(jī)的攝象機(jī)通過影象分析儀監(jiān)視泳道。利用逃走到找到平臺(tái)的間隔時(shí)間和大鼠找到平臺(tái)游泳的距離長度來評(píng)估水迷宮任務(wù)完成情況。用公式游泳速度＝距離長度/逃走時(shí)間來評(píng)估完成此任務(wù)的大鼠運(yùn)動(dòng)能力。為評(píng)估對(duì)平臺(tái)的記憶，第2天在水槽中進(jìn)行無平臺(tái)的60秒鐘探索試驗(yàn)。監(jiān)測(cè)找到先前平臺(tái)位置花費(fèi)時(shí)間的百分比。MCAo中風(fēng)手術(shù)在無菌條件下進(jìn)行所有的手術(shù)步驟。MCAo中風(fēng)方法取自文獻(xiàn)，具體是C.Boriongan等“給血腦屏障損傷大鼠長期注射環(huán)孢菌素A不會(huì)傷害其被動(dòng)回避的記憶”NeurosciRes.1998，32195-200。用多普勒激光檢測(cè)成功堵塞(動(dòng)脈)的各動(dòng)物，顯示在堵塞1小時(shí)期間腦血流顯著減少(＞75％)。MCAo產(chǎn)生了一致的紋狀體損傷。MCAI中風(fēng)手術(shù)MCAI手術(shù)方法見Y.Wang等“膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子可保護(hù)局部缺血引起的腦皮層損傷”1997，JNeuroscience，17(11)4341-4348。也可采用多普勒激光來驗(yàn)證動(dòng)脈結(jié)扎。MCAI產(chǎn)生了一致的皮層損傷。TGI中風(fēng)手術(shù)采用一種4-血管堵塞技術(shù)。在深度麻醉下給動(dòng)物作頸椎中線切口。通過一頸椎前側(cè)孔分離椎動(dòng)脈。用顯微鑷子結(jié)扎兩側(cè)頸總動(dòng)脈15分鐘。此技術(shù)證明能產(chǎn)生全腦缺血，與海馬損傷相符。神經(jīng)元前體細(xì)胞神經(jīng)元前體細(xì)胞由SanBio公司(MountainView，CA)提供。通常按照PCT/JP03/01260產(chǎn)生這些細(xì)胞。移植方法在無菌條件下進(jìn)行所有手術(shù)步驟。在equithesin(3mg/kg，i.p)麻醉下(檢查動(dòng)物的疼痛反射)，用26號(hào)植入套管針將NPC直接植入到MCAo動(dòng)物的紋狀體中，MACI動(dòng)物的皮層中，或TGI動(dòng)物的海馬中。參見Y.Wang等“膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)營養(yǎng)因子可保護(hù)局部缺血引起的腦皮層損傷”1997，JNeuroscience，17(11)4341-4348和C.Borlongan等“移植凍存的人胚胎癌衍生的神經(jīng)元(NT2N細(xì)胞)促進(jìn)了局部缺血大鼠的功能恢復(fù)”，ExpNeurol，1998，149310-21?？捎帽疚乃龇椒ǐ@得凍存的NPC。用臺(tái)盼蘭排除法計(jì)數(shù)活細(xì)胞然后立即移植給最后的接受動(dòng)物。預(yù)定的細(xì)胞用量(4萬、10萬和20萬)是指活細(xì)胞數(shù)。在融化細(xì)胞后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行移植手術(shù)。輸注速度為每分鐘1微升細(xì)胞液。輸注后給予3分鐘吸收時(shí)間然后抽回注射針。手術(shù)期間用加熱墊和直腸溫度計(jì)維持體溫約37℃直到從麻醉恢復(fù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用重復(fù)測(cè)定的ANOVA分析行為數(shù)據(jù)，p＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。用包括Posthoc檢驗(yàn)的折中t檢驗(yàn)來提示各治療組之間有無顯著性差異(p’s＜0.05)。實(shí)施例1MCAo結(jié)果--移植后4周每周檢測(cè)給測(cè)試動(dòng)物進(jìn)行上述MCAo手術(shù)，移植后4周每周評(píng)價(jià)一次，結(jié)果如下。EBST移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，21＝57.06，p＜0.0001)(圖1)。還觀察到劑量依賴性顯著作用(20萬＞10萬＞4萬)(p’s＜0.01)。移植后4周每周的運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱性比基線顯著降低(p’s＜0.0001)，移植后1周時(shí)出現(xiàn)最強(qiáng)烈恢復(fù)(p’s＜0.0001)，移植后2、3和4周則顯示穩(wěn)定的恢復(fù)。Posthoc檢驗(yàn)顯示，移植后1周時(shí)三種劑量細(xì)胞之間運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱性的顯著減少?zèng)]有差異；但移植后第2、3和4周時(shí)可見劑量依賴性效果(p’s＜0.05)(圖2)。Bederson試驗(yàn)移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，21＝9.65，p’s＜0.001)(圖3)。20萬和10萬細(xì)胞較高劑量的神經(jīng)缺陷評(píng)分比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量有更好的改善(p’s＜0.01)。移植后4周每周的神經(jīng)缺陷評(píng)分比基線明顯要低(p’s＜0.0001)。隨時(shí)間推移移植動(dòng)物的行為改善傾向于更佳，移植后2、3和4周比移植后第1周好(p’s＜0.0001)。Posthoc檢驗(yàn)顯示，移植后一周時(shí)三種劑量細(xì)胞之間的神經(jīng)缺陷評(píng)分的顯著減少?zèng)]有不同；但第2周10萬和20萬高劑量的恢復(fù)比4萬低劑量為好(p’s＜0.05)；移植后3和4周顯示有劑量依賴效應(yīng)(20萬＞10萬＞4萬)(p’s＜0.05)(圖4)。MWM獲得移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示無顯著的主要治療效果(F2，21＝2.87，p＝0.08)(圖5)。與基線和移植后一周相比，如2、3和4周較長獲得時(shí)間所顯示的那樣，看來在整個(gè)移植后4周的時(shí)間里傾向于較長的MWM獲得時(shí)間(p’s＜0.01)(圖6)。MWM探索試驗(yàn)找到平臺(tái)的時(shí)間。移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，21＝61.33，p＜0.0001)(圖7)。20萬和10萬細(xì)胞較高劑量找到平臺(tái)的時(shí)間比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量明顯縮短(p’s＜0.0001)。移植后4周每周找到平臺(tái)的時(shí)間比基線明顯縮短(p’s＜0.0001)。隨時(shí)間推移移植動(dòng)物的行為改善傾向于更佳，移植后2、3和4周比移植后第1周好(p’s＜0.0001)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后4周內(nèi)20萬和10萬較高劑量找到平臺(tái)的時(shí)間顯著少于低劑量4萬細(xì)胞；移植后1周和4周顯示有劑量依賴效應(yīng)(20萬＞10萬＞4萬)(p’s＜0.05)(圖8)。MWM探索試驗(yàn)在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間。移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，21＝15.19，p’s＜0.0001)(圖9)。20萬和10萬細(xì)胞較高劑量在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量明顯較長(p’s＜0.01)。移植后4周每周在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間比基線明顯增加(p’s＜0.0001)。隨時(shí)間推移移植動(dòng)物的行為改善傾向于更佳，移植后3和4周比移植后第1和2周好(p’s＜0.0001)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后4周內(nèi)20萬和10萬高劑量在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間比4萬低劑量明顯更長(p’s＜0.05)(圖10)。實(shí)施例2MCAI結(jié)果--移植后4周每周檢測(cè)給測(cè)試動(dòng)物進(jìn)行上述MCAI手術(shù)，移植后4周每周評(píng)價(jià)一次，結(jié)果如下。EBST移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，24＝76.30，p’s＜0.001)(圖11)。20萬和10萬細(xì)胞較高劑量的運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱恢復(fù)得比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量更好(p’s＜0.0001)。移植后4周每周的運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱比基線明顯減少(p’s＜0.0001)。移植后2、3和4周顯示恢復(fù)得更好。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后一周較高劑量細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱減少顯著好于低劑量，有劑量依賴效應(yīng)(20萬＞10萬＞4萬)(p’s＜0.05)(圖12)。Bederson試驗(yàn)移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，24＝3.65，(p＜0.05)(圖13)。20萬細(xì)胞最高劑量的神經(jīng)缺陷評(píng)分的改善比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量更好(p’s＜0.05)；中等劑量10萬細(xì)胞與低劑量4萬細(xì)胞之間未見明顯差異(圖13)。移植后4周每周的神經(jīng)缺陷評(píng)分改善比基線明顯要低(p’s＜0.0001)，整個(gè)期間保持穩(wěn)定，整個(gè)期間每周神經(jīng)評(píng)分不同劑量細(xì)胞之間無顯著性差異(p’s＞0.05)。Posthoc檢驗(yàn)顯示3周和4周時(shí)最高劑量20萬個(gè)細(xì)胞的恢復(fù)比低劑量4萬個(gè)細(xì)胞要好(p’s＜0.01)；移植后較早時(shí)間點(diǎn)不同劑量細(xì)胞之間未見顯著差異(p’s＞0.05)(圖14)。MWM獲得移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示無顯著的主要治療效果(F2，24＝5.78-16，p＞0.05)(圖15)。與基線相比，如1、2、3和4周較長獲得時(shí)間所顯示的那樣，看來在整個(gè)移植后4周的時(shí)間里傾向于更長的MWM獲得時(shí)間(p’s＜0.0001)(圖16)。MWM探索試驗(yàn)找到平臺(tái)的時(shí)間。移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示無明顯的主要治療效果(F2，24＝0.62，p＝0.55)(圖17)。在整個(gè)移植后時(shí)間內(nèi)，注意到找到平臺(tái)的時(shí)間顯著更久(p’s＜0.001)(圖18)。MWM探索試驗(yàn)在平臺(tái)區(qū)域上花費(fèi)的時(shí)間。移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示無明顯的主要治療效果(F2，24＝2.01，p＝0.16)(圖19)。雖然在移植后整個(gè)4周內(nèi)在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間比基線明顯要長(p’s＜0.001)，但只在移植后1周觀察到短暫的劑量依賴效應(yīng)(p’s＜0.05)，其余3周測(cè)試時(shí)間內(nèi)未見到(p’s＞0.05)(圖20)。實(shí)施例3TGI結(jié)果--移植后4周每周檢測(cè)給測(cè)試動(dòng)物進(jìn)行上述MCAI手術(shù)，移植后4周每周評(píng)價(jià)一次，結(jié)果如下。Bederson試驗(yàn)移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，23＝47.33，p’s＜0.001)(圖21)。20萬和10萬個(gè)細(xì)胞較高劑量的神經(jīng)缺陷評(píng)分的改善比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量更好(p’s＜0.0001)。移植后4周每周的神經(jīng)缺陷評(píng)分改善比基線明顯要低(p’s＜0.0001)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后1周神經(jīng)缺陷評(píng)分顯著降低在三種細(xì)胞劑量之間無差異，但在2、3和4周時(shí)最高劑量10萬和20萬個(gè)細(xì)胞的恢復(fù)比低劑量4萬個(gè)細(xì)胞要好(p’s＜0.005)；移植后4周呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)(20萬＞10萬＞4萬)(p’s＜0.05)(圖22)。MWM獲得移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有顯著的主要治療效果(F2，23＝9.88-16，p’s＜0.001)(圖23)。然而此顯著治療效果的獲得只是由于最高劑量20萬個(gè)細(xì)胞與其它二種10萬和4萬個(gè)細(xì)胞劑量相比在移植后1周獲得此任務(wù)時(shí)產(chǎn)生了短暫的顯著改善)(p’s＜0.005)。然而注意到，移植后2、3和4周的獲得時(shí)間比基線和移植后1周時(shí)更長(p’s＜0.005)(圖24)。MWM探索試驗(yàn)找到平臺(tái)的時(shí)間。移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，23＝30.98，p’s＜0.0001)(圖25)。20萬和10萬細(xì)胞較高劑量找到平臺(tái)的時(shí)間比4萬個(gè)細(xì)胞低劑量明顯縮短(p’s＜0.0001)。移植后4周每周找到平臺(tái)的時(shí)間比基線明顯縮短(p’s＜0.0001)。隨時(shí)間推移移植動(dòng)物的行為改善傾向于更佳，移植后3和4周比移植后第1和2周要好(p’s＜0.0001)。Posthoc檢驗(yàn)顯示，移植后2和3周20萬較高劑量找到平臺(tái)的時(shí)間顯著少于其它二種10萬和4萬個(gè)細(xì)胞(p’s＜0.05)；而移植后4周內(nèi)對(duì)找到平臺(tái)二種較高劑量比低劑量獲得了更好的改善(p’s＜0.05)(圖26)。MWM探索試驗(yàn)在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間。移植后4周每周檢測(cè)一次，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，23＝54.06，p’s＜0.0001)(圖27)。在整個(gè)移植后4周內(nèi)呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)(20萬＞10萬＞4萬)(p’s＜0.0001)。此外，整個(gè)移植后4周內(nèi)在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間變長(p’s＜0.0001)。Posthoc檢驗(yàn)顯示，移植后3和4周20萬和10萬較高劑量在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間比4萬低劑量明顯更長(p’s＜0.05)。在移植后2周時(shí)只有最高劑量細(xì)胞導(dǎo)致在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間比其它二種劑量細(xì)胞顯著更長(p’s＜0.05)(圖28)。實(shí)施例4移植后5周的組織學(xué)檢查移植后5周對(duì)隨機(jī)選擇的動(dòng)物實(shí)行安樂死(見表3)。限于對(duì)每種劑量和中風(fēng)類型的2-3份腦樣品進(jìn)行組織學(xué)檢查。因此根據(jù)GFP表面熒光只定量分析了存活和遷移的移植細(xì)胞。采用各種其它組織學(xué)參數(shù)標(biāo)記物的特異性抗體檢測(cè)表型的表達(dá)，只提供了總體描述。移植NPC細(xì)胞的存活GFP表面熒光顯示所有三種中風(fēng)類型的移植細(xì)胞存活均為劑量依賴型(20萬＞10萬＞4萬)(F8，32＝33.9，p＜0.0001)(圖29)。GFP陽性細(xì)胞平均數(shù)顯示，較低劑量4萬細(xì)胞導(dǎo)致低數(shù)量的GFP陽性移植細(xì)胞存活，而二種較高劑量10萬和20萬細(xì)胞導(dǎo)致較高數(shù)量的GFP陽性移植細(xì)胞存活。這些觀察與MCAo、MCAI和TGI移植動(dòng)物所見相符。然而，計(jì)算每種細(xì)胞劑量的移植細(xì)胞存活百分比時(shí)，三種劑量得到的百分比無顯著差異(F8.32＝1.67，p’s＞0.05)(圖30)。表3移植后5周時(shí)的組織學(xué)檢查移植細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)量中風(fēng)類型樣品大小NPC4萬個(gè)MCAo4MCAI5TGI410萬個(gè)MCAo5MCAI5TGI420萬個(gè)MCAo5MCAI5TGI4移植細(xì)胞的存活與功能恢復(fù)之間呈正相關(guān)回歸分析顯示移植的NPC細(xì)胞存活數(shù)越多(20萬＞10萬＞4萬)，功能的改善越好(圖31)。移植NPC細(xì)胞的遷移GFP表面熒光顯示大多數(shù)移植細(xì)胞(約55％-85％)仍呆在最初移植部位(圖32)。MCAo移植動(dòng)物中，在最初的紋狀體植入部位易于鑒定到一些GFP陽性細(xì)胞(62％)，MCAI移植動(dòng)物中GFP陽性細(xì)胞仍呆在最初植入的皮質(zhì)部位(53％)，TGI移植動(dòng)物中GFP陽性細(xì)胞仍呆在最初的海馬部位(86％)。然而看來MCAo和MCAI移植動(dòng)物顯示比TGI移植動(dòng)物有更多遷移的移植細(xì)胞。然而觀察到的遷移移植細(xì)胞仍呆在到整個(gè)靶區(qū)域內(nèi)，即MCAo觀察到的遷移細(xì)胞在紋狀體內(nèi)，MCAI在皮質(zhì)內(nèi)，TGI在海馬內(nèi)。MCAo和MCAI中遷移的移植細(xì)胞的特征是，移植細(xì)胞分別位于紋狀體和皮質(zhì)局部缺血性半影內(nèi)層。MCAo還觀察到細(xì)胞沿紋狀體局部缺血半影的中部向外側(cè)(1.8mm)，背側(cè)向腹側(cè)(2.3mm)遷移。MCAI中見到細(xì)胞從中部向外側(cè)遷移(4.4mm)。TGI移植動(dòng)物中移植細(xì)胞的遷移特征是，在CA2和CA3區(qū)中鑒定到GFP陽性的SBDP(分別距離最初的CA1植入部位1.6mm和0.7mm遠(yuǎn))。NPC表達(dá)的表型植入的NPC細(xì)胞為GFAP陽性(約5％)，極少數(shù)細(xì)胞(每個(gè)大腦2-5個(gè)細(xì)胞)NeuN也陽性。用GFP共定位這兩個(gè)標(biāo)記。所有劑量和所有三種類型的中風(fēng)中這些觀察相一致。實(shí)施例5移植后12周MCAo的結(jié)果移植后12周評(píng)價(jià)了進(jìn)行上述TGI手術(shù)后的測(cè)試動(dòng)物，結(jié)果如下。EBST移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝11.84，p＜0.005)(圖32).Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱顯著低于基線(p＜0.001)。Bederson試驗(yàn)移植后12檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝41.83，p＜0.001)(圖32)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周神經(jīng)缺陷顯著少于基線水平(p＜0.001)。MWM獲得移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示無顯著的主要治療效果(F2，9＝0.36，p＝0.71)(圖33)。這些結(jié)果表明基線與移植后12周之間的MWM獲得無顯著性差異。MWM探測(cè)試驗(yàn)找到平臺(tái)的時(shí)間。移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝6.18，p＜0.05)(圖33)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周找到平臺(tái)的時(shí)間明顯少于基線(p＜0.001)。MWM探測(cè)試驗(yàn)在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間。移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝6.18，(p＜0.05)(圖33)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間明顯多于基線(p＜0.001)。實(shí)施例6移植后12周MCAI的結(jié)果移植后12周評(píng)價(jià)了給予上述MCAI手術(shù)的測(cè)試動(dòng)物，結(jié)果如下。EBST移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝23.02，(p＜0.0005)(圖34).Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周運(yùn)動(dòng)不對(duì)稱顯著低于基線(p＜0.0001)。Bederson試驗(yàn)移植后12檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝9.29，(p＜0.001)(圖34)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周神經(jīng)缺陷顯著少于基線水平(p＜0.0001)。MWM獲得移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示無顯著的主要治療效果(F2，9＝1.37，p＝0.30)(圖35)。這些結(jié)果表明基線與移植后12周之間的MWM獲得無顯著性差異。MWM探索試驗(yàn)找到平臺(tái)的時(shí)間。移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示無明顯的主要治療效果(F2，9＝0.26，p＝0.78)(圖35)。這些結(jié)果表明MWM探索試驗(yàn)，即有平臺(tái)時(shí)基線與移植后12周之間無顯著差異。MWM探索試驗(yàn)在平臺(tái)區(qū)域上花費(fèi)的時(shí)間。移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示無明顯的主要治療效果(F2，9＝0.15，p＝0.86)(圖35)。這些結(jié)果表明MWM探索試驗(yàn)，即無平臺(tái)時(shí)基線與移植后12周之間無顯著差異。實(shí)施例7移植后12周TGI的結(jié)果移植后12周評(píng)價(jià)了進(jìn)行上述TGI手術(shù)的測(cè)試動(dòng)物，結(jié)果如下。Bederson試驗(yàn)移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝184.02，p＜0.0001)(圖36)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周神經(jīng)缺陷顯著少于基線水平(p＜0.0001)。MWM獲得移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示無顯著的主要治療效果(F2，9＝0.31，p＝0.74)(圖37)。這些結(jié)果表明基線與移植后12周之間的MWM獲得無顯著性差異。MWM探索試驗(yàn)找到平臺(tái)的時(shí)間。移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝5.14，p＜0.05)(圖37)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周找到平臺(tái)的時(shí)間明顯少于基線(p＜0.0001)。MWM探索試驗(yàn)在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間。移植后12周檢測(cè)，全體ANOVA顯示有明顯的主要治療效果(F2，9＝4.39，p＜0.05)(圖37)。Posthoc檢驗(yàn)顯示移植后12周在平臺(tái)區(qū)域花費(fèi)的時(shí)間明顯多于基線(p＜0.0001)。實(shí)施例8移植后12周的組織學(xué)檢查移植后12周對(duì)所有存留的動(dòng)物實(shí)行安樂死(見表4)。根據(jù)GFP表面熒光和采用各種其它免疫組化參數(shù)標(biāo)記物的特異性抗體檢測(cè)表型的表達(dá)，定量分析了存活和遷移的移植細(xì)胞。表4移植后5周時(shí)的組織學(xué)檢查移植細(xì)胞類型細(xì)胞數(shù)量(大約)中風(fēng)類型樣品大小NPC4萬個(gè)MCAo4MCAI4TGI410萬個(gè)MCAo4MCAI4TGI420萬個(gè)MCAo4MCAI4TGI4移植NPC細(xì)胞的存活GFP表面熒光顯示所有三種中風(fēng)類型的移植細(xì)胞存活均為部分劑量依賴型(20萬＝10萬＞4萬)(F8，27＝14.88，p＜0.0001)(圖38)。GFP陽性細(xì)胞平均數(shù)顯示，較低劑量4萬細(xì)胞導(dǎo)致低數(shù)量的GFP陽性移植細(xì)胞存活，而二種較高劑量10萬和20萬細(xì)胞導(dǎo)致較高數(shù)量的GFP陽性移植細(xì)胞存活。這些觀察與MCAo、MCAI和TGI移植動(dòng)物所見相符。然而，計(jì)算每種細(xì)胞劑量的移植細(xì)胞存活百分比時(shí)，三種劑量得到的百分比無顯著差異(F8.27＝1.37，p＞0.05)(圖39)。提示低和高劑量的移植細(xì)胞存活百分率主要因CsA的免疫抑制作用而維持。移植NPC細(xì)胞的遷移與5周時(shí)的組織學(xué)檢查相同，GFP表面熒光顯示大多數(shù)移植的細(xì)胞(約65％-90％)仍呆在最初移植部位。MCAo移植動(dòng)物中，在最初的紋狀體植入部位易于鑒定到一些GFP陽性細(xì)胞(72％)；MCAI移植動(dòng)物中GFP陽性細(xì)胞仍呆在最初植入的皮質(zhì)部位(64％)；TGI移植動(dòng)物中GFP陽性細(xì)胞仍呆在最初的海馬部位(91％)。看來MCAo和MCAI移植動(dòng)物顯示比TGI移植動(dòng)物有更多遷移的移植細(xì)胞。然而，觀察到的遷移移植細(xì)胞仍呆在整個(gè)靶區(qū)域內(nèi)，即MCAo觀察到的遷移細(xì)胞在紋狀體內(nèi)，MCAI在皮質(zhì)內(nèi)，TGI在海馬內(nèi)。MCAo和MCAI遷移的移植細(xì)胞特征是，移植細(xì)胞分別位于紋狀體和皮質(zhì)局部缺血性半影內(nèi)層。MCAo還觀察到細(xì)胞沿紋狀體局部缺血半影的中部向外側(cè)(2.0mm)，背側(cè)向腹側(cè)(2.5mm)遷移。MCAI中見到細(xì)胞從中部向外側(cè)遷移(4.5mm)。TGI移植動(dòng)物的移植細(xì)胞遷移特征是，在CA2和CA3區(qū)中鑒定到GFP陽性的SBDP(分別距離最初的CA1植入部位1.6mm和0.8mm遠(yuǎn))。NPC表達(dá)的表型所有類型的中風(fēng)和劑量中，存活率約為15％。在這些最初的移植部位中，大多數(shù)細(xì)胞保留了其串珠狀外觀，NeuN或GFAP陰性。然而在MCAo移植動(dòng)物中，這些細(xì)胞的少數(shù)顯示為NeuN和GFAP陽性。分別檢測(cè)到MCAo、MCAI和TGI移植動(dòng)物中GFP陽性細(xì)胞沿紋狀體半影、皮質(zhì)半影和CA3區(qū)遷移，NeuN免疫染色的確顯示這些細(xì)胞表達(dá)了成熟神經(jīng)元的這種標(biāo)記?？傮w上，所有類型的中風(fēng)和劑量中，約25％存活的GFP陽性細(xì)胞為NeuN陽性；從移植部位遷移出的細(xì)胞約60％為NeuN陽性。這些細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元特有的精細(xì)長突起形態(tài)，這在MCAo移植動(dòng)物中很豐富。GFP表面熒光顯微觀察顯示各類中風(fēng)都有獨(dú)特的神經(jīng)元形態(tài)，以及移植的NPC細(xì)胞間接觸。經(jīng)GFAP染色證實(shí)一些細(xì)胞(所有類型的中風(fēng)和劑量中共約5％)顯示為膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(如果不是全部的話)GFAP陽性細(xì)胞位于血管內(nèi)或其附近。移植物抗宿主組織病理學(xué)紋狀體、皮質(zhì)或海馬的Nissi染色無腫瘤形成證據(jù)。實(shí)施例9中風(fēng)模型的其它NPC檢測(cè)此項(xiàng)研究的目的是檢查用NPC治療中風(fēng)動(dòng)物的效果。利用行為試驗(yàn)來揭示中風(fēng)動(dòng)物移植細(xì)胞后的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能。中風(fēng)后1個(gè)月時(shí)進(jìn)行移植，移植后1月的整個(gè)存活期間每天給予環(huán)孢菌素A(CsA，10mg/kg，i.p)抑制動(dòng)物的免疫排斥反應(yīng)。移植后7、14和28天特征分析移植動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能。用運(yùn)動(dòng)行為和神經(jīng)功能評(píng)價(jià)，確定NPC的有效范圍劑量顯示移植結(jié)果很成功。采用三種治療方案0(單用培養(yǎng)液)，低劑量90kNPC和高劑量190kNPC。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所需的樣本大小確定每種治療方案所需的相應(yīng)動(dòng)物數(shù)量(每組＝10只)。達(dá)不到行為缺陷標(biāo)準(zhǔn)(神經(jīng)功能檢測(cè)時(shí)轉(zhuǎn)向運(yùn)動(dòng)75％偏向一側(cè)和2.5分)的動(dòng)物不包括在此項(xiàng)研究中。因此，此研究只包括達(dá)到這些標(biāo)準(zhǔn)和超過這些標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物。通常大多數(shù)中風(fēng)動(dòng)物可達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，最終統(tǒng)計(jì)學(xué)分析至少需要8只動(dòng)物。研究期間所有動(dòng)物給予免疫抑制劑(每天CsA，10mg/kg，i.p)。所有動(dòng)物先接受MCAo中風(fēng)手術(shù)。手術(shù)后4周用EBST測(cè)試動(dòng)物，1小時(shí)后Bederson神經(jīng)學(xué)檢查。只將出現(xiàn)明顯運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)功能缺陷的動(dòng)物隨后用于移植手術(shù)并隨機(jī)分配作以下治療表5.治療方案說明所有動(dòng)物經(jīng)歷中風(fēng)手術(shù)，接受紋狀體(MCAo)細(xì)胞移植和用CsA長期治療移植后7、14和28天對(duì)動(dòng)物再次進(jìn)行同一組行為測(cè)試。為說明，以下提供了流程圖。中風(fēng)手術(shù)↓行為試驗(yàn)(中風(fēng)后1月，此項(xiàng)研究只包括此后達(dá)到和超過標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物)↓移植(中風(fēng)后1月)↓行為試驗(yàn)(移植后7、14和28天)在無菌條件下進(jìn)行所有的手術(shù)步驟。用equithesin(300mg/kg，i.p.)麻醉動(dòng)物，通過疼痛反射核查。MCA堵塞技術(shù)包括通過頸動(dòng)脈插入縫合絲到達(dá)MCA結(jié)合部阻斷頸總動(dòng)脈和大腦動(dòng)脈環(huán)的血流。通過腹側(cè)中線頸椎切口確定右側(cè)頸總動(dòng)脈并分離此動(dòng)脈。4-0號(hào)縫合絲用無菌不吸收的縫合線制成(Ethicon公司)，其尖端直徑變細(xì)可用橡膠粘結(jié)劑與24-26號(hào)針連接。將長約15-17mm的縫合絲從外部插入到頸動(dòng)脈內(nèi)阻斷MCA。堵塞右側(cè)MCA1小時(shí)；MCA堵塞1小時(shí)通常導(dǎo)致最大梗塞。此外，已發(fā)現(xiàn)該栓子尖端的長度和大小在體重250-350克的大鼠中可產(chǎn)生MCA完全堵塞。采用加熱墊和直腸溫度計(jì)有利于維持體溫在正常范圍。用多普勒激光檢測(cè)堵塞和再灌注是否成功。將多普勒探頭放在預(yù)計(jì)堵塞的紋狀體區(qū)上方硬膜區(qū)域(AP+2.0，ML±2.0和DV-4.0mm)測(cè)量堵塞前，期間和堵塞后的腦血流。在無菌條件下進(jìn)行所有的手術(shù)步驟。在equithesin(3mg/kg，i.p.)麻醉下(通過疼痛反射核查)，用28號(hào)植入套管針直接將NPC細(xì)胞或運(yùn)載體植入動(dòng)物的紋狀體(前囟前0.5mm，距中線側(cè)面2.8mm和硬膜表面下方5.0mm)中。凍存的人NPC獲自SanBio公司，在移植手術(shù)前融化。移植前和最后一只動(dòng)物手術(shù)后立刻進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，采用臺(tái)盼蘭排除法。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)研究確定的有效劑量范圍，預(yù)先確定細(xì)胞劑量(9萬和18萬)。融化細(xì)胞后2小時(shí)內(nèi)進(jìn)行移植術(shù)。輸注速度為每分鐘1微升細(xì)胞液。輸注后給予3分鐘吸收，然后抽回注射針。一次用一個(gè)注射針，但3處背腹側(cè)沉積點(diǎn)各接受3微升細(xì)胞液。整個(gè)手術(shù)和隨后的麻醉蘇醒期間用加熱墊和直腸溫度計(jì)維持體溫在37℃左右。如EBST和Bederson兩種試驗(yàn)中檢查轉(zhuǎn)向運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)缺陷與中風(fēng)前動(dòng)物的行為比較有顯著性偏差顯示的那樣，1小時(shí)的MCAo中風(fēng)手術(shù)在中風(fēng)后1個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生了一致的行為損傷。中風(fēng)前與中風(fēng)后動(dòng)物行為之間的配對(duì)比較，顯示此項(xiàng)研究包括的所有中風(fēng)動(dòng)物在兩種試驗(yàn)中都有顯著損傷(p’s＜0.0001)。隨機(jī)安排，用運(yùn)載體、低劑量90kNPC或高劑量180kNPC治療中風(fēng)動(dòng)物，ANOVA顯示兩種檢查都有顯著治療效果(p’s＜0.0001)。治療組之間的配對(duì)比較顯示，早至移植后7天不論劑量，移植NPC的中風(fēng)動(dòng)物與用運(yùn)載體治療的中風(fēng)動(dòng)物相比，顯示行為缺陷有明顯緩和(p’s＜0.05)。移植NPC中風(fēng)動(dòng)物的這種行為恢復(fù)持續(xù)直到移植后第14天和28天，即與用運(yùn)載體相比，不論劑量，NPCGFP顯著減少了運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)損傷(p’s＜0.0001)。更密切地檢查二種NPC劑量顯示，移植后所有天內(nèi)EBST試驗(yàn)(p’s＜0.01)和移植后14和28天Bederson試驗(yàn)(p’s＜0.0005)中高劑量180k導(dǎo)致的行為缺陷緩和顯著好于低劑量90k。結(jié)果見圖44-45。這些行為試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，早至移植后7天NPC對(duì)行為恢復(fù)即有治療效益。結(jié)果進(jìn)一步顯示，移植NPC的正面療效可穩(wěn)定保持到移植后28天(研究截止期)。雖然低和高劑量的NPC都促進(jìn)了功能恢復(fù)，但高劑量的行為恢復(fù)比低劑量明顯更好。此研究中對(duì)所有的中風(fēng)動(dòng)物都給予了免疫抑制劑。因?yàn)橛幂d體處理的中風(fēng)動(dòng)物沒有表現(xiàn)出任何可見的行為恢復(fù)，從而消除了免疫抑制劑CsA可能產(chǎn)生的混淆作用，這種混淆作用在先前中風(fēng)前、中風(fēng)期間和中風(fēng)后給予藥物的研究中可以見到。觀察到的行為恢復(fù)只限于移植了NPC的中風(fēng)動(dòng)物，表明此種治療效果的來源不可能是免疫抑制劑，而是移植的細(xì)胞。進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色及Nissi染色，用NIH的成像系統(tǒng)測(cè)定各動(dòng)物的最大梗塞面積。用以下公式計(jì)算梗塞體積＝2mm(切片厚度)×[所有腦切片中梗塞面積之和(mm2)]。移植后一個(gè)月，隨機(jī)選擇的動(dòng)物實(shí)行安樂死以進(jìn)行免疫組化分析。用標(biāo)準(zhǔn)的ABC法處理組織，步驟如下用4倍放大的數(shù)字化PC基成像工具計(jì)算機(jī)程序觀察20微米速凍組織切片。盲法記錄腦切片數(shù)據(jù)，用Abercrombie公式計(jì)算免疫陽性細(xì)胞總數(shù)。采用不會(huì)與鼠細(xì)胞表面標(biāo)記或其它鼠蛋白交叉反應(yīng)的抗人細(xì)胞表面標(biāo)記的特異性人單克降抗體HuNu評(píng)估移植后NPC細(xì)胞的存活。分別用Neu-N和GFAP的免疫組化分析在移植細(xì)胞中檢測(cè)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞表型的表達(dá)。遷移的NPC植入細(xì)胞也具有有這些細(xì)胞表面標(biāo)記?？傊?，移植后一個(gè)月紋狀體中NPC細(xì)胞存活良好，少數(shù)為MAP2陽性神經(jīng)元。兩種劑量NPC之間存活的移植細(xì)胞數(shù)無顯著差異。NPC補(bǔ)充了局部缺血中風(fēng)半影區(qū)的細(xì)胞喪失。兩種劑量水平顯示幾乎相同程度的神經(jīng)元拯救效果。圖46-48提供了這些分析的數(shù)據(jù)。H.MNC實(shí)施例提供以下實(shí)施例是為了說明而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)驗(yàn)步驟培養(yǎng)MASC和誘導(dǎo)產(chǎn)生神經(jīng)元如S.Azizi等“植入albino-大鼠腦中的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的遷移類似于移植的星形細(xì)胞”，ProcnatlAcadSciUSA，1998，953908-13所述，分離Wistar大鼠的MASC細(xì)胞。如M.Dezawa等“移植體外分化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘生了大鼠坐骨神經(jīng)的再生”，EurJNeurosci，2001，141771-6所述用pBabeneo-GFP載體通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染對(duì)MASC進(jìn)行綠熒光蛋白(GFP)標(biāo)記。如M.Dezawa等“從骨髓基質(zhì)細(xì)胞特異性誘生神經(jīng)元細(xì)胞及其在自身移植中的應(yīng)用”，JClinInvest，2004，1131710-10所述，從MASC誘生神經(jīng)元。簡言之，用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺Lipofectamin2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)將含Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)的載體(pCIneo-NICD)轉(zhuǎn)染入MASC細(xì)胞。11天后用G418選擇細(xì)胞。為誘生MNC，將NICD轉(zhuǎn)染的MASC細(xì)胞亞克隆一次(60-70％融合)，用含10％FBS、5μMFSK(Calbiochem，LaJolla，California)、10ng/mlbFGF(Peprotech，London，UK)的α-MEM培養(yǎng)。5天后將細(xì)胞移植入MCAo大鼠模型中。為體外鑒定誘生的MNC，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。采用抗-MAP-2ab(Sigma，St，Louis，Missouri)、神經(jīng)纖絲-M(NF-M)(Chemicon，Temecula，California)和β-微管蛋白3(β-tubulin3)(Sigma，St，Louis，Missouri)作為神經(jīng)元標(biāo)記，90-95％的MNC細(xì)胞顯示這些免疫標(biāo)記為陽性。MCAo大鼠模型200-250g雄性Wistar大鼠維持在室溫(24℃)下，白天-黑夜各12小時(shí)循環(huán)，給予食物自由飲水。此MCAO方法是J.Koizumi等“局部缺血性腦水腫的實(shí)驗(yàn)研究。1，一種在局部缺血區(qū)域引入重循環(huán)血的大鼠腦栓塞新實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?，JpnJStroke，1986，81-8和E.Longa等“無須切開顱骨的大鼠可逆性中腦動(dòng)脈堵塞模型”，Stroke，1989，2084-91所述方法的改進(jìn)。簡言之，在用0.1-1.5％氟烷、10％O2和空氣混合氣體誘導(dǎo)的深度麻醉下，作頸椎中線切口，確定左頸動(dòng)脈分叉處，在外部結(jié)扎的頸動(dòng)脈中插入直徑0.3mm頭部帶硅橡膠涂層的4-0號(hào)尼龍線制成的探頭，推進(jìn)到頸動(dòng)脈中距分叉處16-18mm。手術(shù)期間用反潰式加熱墊(BWT-100，BioReseachCenterCo.Ltd，Tokyo，Japan)和直腸溫度計(jì)維持體溫在37.5-38.0℃。進(jìn)行動(dòng)脈的血?dú)夥治?，并通過麻醉機(jī)的控制將氧氣壓力維持在85-120mmHg。堵塞后通過10mm探頭管道引流進(jìn)行4小時(shí)重灌注。移植MCAO術(shù)后第7天，腹腔內(nèi)注射50mg/kg的苯巴比妥鈉麻醉大鼠，放在立體定位框中。初步實(shí)驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生距中線側(cè)面約3.5mm一側(cè)區(qū)域的栓塞區(qū)域。為了在非壞死的腦實(shí)質(zhì)中移植細(xì)胞，通過立體定位將含8000-16000個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的3微升磷酸緩沖細(xì)胞懸液(PBS，pH7.4)注射到各鼠左前腦的以下三個(gè)部位前囟前+2mm、0mm和-2mm處；中線外側(cè)2mm處；和距皮質(zhì)表面深1.2mm處。移植細(xì)胞總數(shù)為24000-48000。準(zhǔn)備了三組動(dòng)物對(duì)照組，僅接受PBS(不進(jìn)行細(xì)胞移植)(n＝7)；MASC組，進(jìn)行非處理的完整MASC細(xì)胞移植(n＝10)；和NMC組，其中植入有MNC(n＝10)。行為測(cè)試用以下試驗(yàn)評(píng)價(jià)神經(jīng)損傷的嚴(yán)重程度杠桿平衡試驗(yàn)、肢體位置試驗(yàn)和Morris水迷宮試驗(yàn)。MCAO后7(移植前一天)、14、21、28和35天進(jìn)行杠桿平衡試驗(yàn)和肢體位置試驗(yàn)。MCAO術(shù)后36-40天進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)。杠桿平衡試驗(yàn)(beambalancetest)用杠桿平衡試驗(yàn)來評(píng)估總體前庭運(yùn)動(dòng)功能，按C.Dixon等“實(shí)驗(yàn)性大鼠腦損傷的一種液體叩診模型”J.Neurosurg，1987，67110-9所述進(jìn)行。根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分0分為爪子握住杠桿上部姿態(tài)穩(wěn)定而平衡；1分為握住杠桿側(cè)面和/或動(dòng)作發(fā)抖；2分為有一個(gè)或幾個(gè)爪子滑脫；3分為試圖在杠桿上平衡但失敗；4分為從杠桿上跌下不再嘗試平衡或吊在杠桿上。肢體定位試驗(yàn)肢體定位試驗(yàn)檢查對(duì)視覺、觸覺和本體感受刺激肢體位置反應(yīng)的感覺運(yùn)動(dòng)整合，一般按照M.DeRyck等“光化學(xué)中風(fēng)模型鹽酸氟苯桂嗪預(yù)防大鼠新皮質(zhì)梗塞后的感覺運(yùn)動(dòng)缺陷”，Stroke，1989，201383-1390所述進(jìn)行此試驗(yàn)。一般也按照DeRyck此文所述進(jìn)行本體感受加合試驗(yàn)。各試驗(yàn)的評(píng)分根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)0分為立即和完全擺好肢體位置；1分為不完全和/或延遲(＞2秒)擺好，包括間有連枷；2分為擺不好肢體位置。給予右前肢視覺、正面和側(cè)面觸碰及本體感受刺激。給予右后肢正面和側(cè)面觸碰及本體感覺刺激。對(duì)前肢和后肢進(jìn)行本體感受加合試驗(yàn)?？傇u(píng)分范圍0-18分。Morris水迷宮試驗(yàn)Morris水迷宮試驗(yàn)是用于評(píng)估感知功能的方法。報(bào)道了此試驗(yàn)的幾種改進(jìn)。一種采用A.Fukunaga等“局部缺血大鼠腦中植入間充質(zhì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞后的分化和血管生成”，CellTransplant.1999，8435-41中所述的試驗(yàn)方法。在MACO術(shù)后36-40天進(jìn)行此試驗(yàn)。準(zhǔn)備水池(直徑150cm深35cm)。逃脫平臺(tái)(直徑10cm)位于不透明白色牛奶水池表面以下1cm。圍繞水池邊緣設(shè)計(jì)有4個(gè)起始點(diǎn)N、E、S和W。平臺(tái)保持在象限的中部，與水池中心和邊緣等距。從各起始點(diǎn)放入大鼠讓其游泳直到爬上平臺(tái)，記錄到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間(最大120秒)。每天2套4次試驗(yàn)訓(xùn)練大鼠連續(xù)5天。第一套5天訓(xùn)練后進(jìn)行第二套空間探索試驗(yàn)。用該試驗(yàn)估計(jì)短期記憶保留。撤去平臺(tái)讓大鼠游泳60秒鐘，測(cè)定各大鼠通過平臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。也測(cè)定在平臺(tái)象限上花費(fèi)的時(shí)間。第41天，給予過量戊巴比妥處死動(dòng)物，經(jīng)頸動(dòng)脈灌注0.9％鹽水，然后是高碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液，如McLean等，″Periodate-lysine-paraformaldehydefixative.Anewfixationforimmunoelectronmicroscopy″(高碘酸-賴氨酸-低聚甲醛固定劑，免疫電子顯微鏡用的一種新固定劑)JHistochemCytochem.1974；221077-83實(shí)施例1部分所述。用BrainMatrix(BASInc.Warwickshire，UK)將腦切割成2毫米厚的冠狀切片。由各個(gè)冠狀切片制備10μm厚的冷凍切片。用蘇木精和伊紅(H&E)染色各切片以評(píng)估梗塞面積。用1×物鏡在光學(xué)顯微鏡下獲取切片圖像，用ScionImage(ScionCorporation，F(xiàn)rederick，MD)追蹤損傷區(qū)域。一般根據(jù)R.Swanson等，″Asemiautomatedmethodformeasuringbraininfarctvolume.″JCerebBloodFlowMetab(測(cè)量腦梗塞體積的半自動(dòng)化方法).1990；10290-29所述計(jì)算梗塞體積，以對(duì)側(cè)半球體積的百分比表示。為進(jìn)行免疫染色，將切片在40℃下與MAP-2(1∶100，BoehringerMannheim，Germany)、β-微管蛋白3(1∶400，Sigma，Missouri)、NF-M(1∶200，BoehringerMannheim，Germany)、Tuj-1(1∶100，BAbCO，CA)或GFAP(1∶400，Dako，CA)的初級(jí)抗體孵育過夜。使用AlexaFluor546-偶聯(lián)的抗鼠IgG(MolecularProbes，Eugene，OR)(對(duì)于MAP-2)或抗兔IgG(MolecularProbes，Eugene，OR)(對(duì)于β-微管蛋白3、NF-M、Tuj-1和GFAP)作為第二抗體。用TOTO-3進(jìn)行核染色。用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLMS)(Radiance2000，Bio-Rad，Hertfordshire，UK)觀察樣本。計(jì)算每只大鼠整個(gè)前腦中GFP-標(biāo)記細(xì)胞的總量。以相同方式計(jì)算海馬中GFP-標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用非重復(fù)性ANOVA檢測(cè)分析行為評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)和阻塞體積。當(dāng)結(jié)果有顯著性時(shí)(p＜0.05)，采用95％顯著水平的Student-newman-KeulsPosthoc程序分析。除非另有說明，提供的數(shù)值是平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)施例10行為測(cè)試MCAO術(shù)后一周移植前刻進(jìn)行此測(cè)試，此時(shí)已出現(xiàn)嚴(yán)重的右側(cè)神經(jīng)缺陷，各行為試驗(yàn)的平均記分顯示三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。杠桿平衡試驗(yàn)從第7天到21天三組之間的平均記分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第28和35天MNC組平均記分顯示比對(duì)照組(28天p＝0.0041；35天p＝0.0001)和MASC組(分別為p＝0.0471；0.0007)明顯改善。雖然28天和35天MASC組檢測(cè)顯示比對(duì)照組有輕度改善，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。肢體定位試驗(yàn)7-21天三組的平均評(píng)分之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。28和35天時(shí)，MNC和MASC組與對(duì)照組相比顯示有顯著性改善(分別為28天p＝0.0022和0.085；35天p＝0.0022和0.0211)。然而整個(gè)試驗(yàn)期間MNC與MASC組之間平均評(píng)分顯示無顯著差異(圖41)。Morris水迷宮試驗(yàn)圖42顯示三組中各組大鼠每套4次試驗(yàn)找到淹沒的逃脫平臺(tái)記錄的花費(fèi)時(shí)間。顯示MNC組花費(fèi)的時(shí)間與對(duì)照和MASC組相比最短。39天第二套和40天第一套試驗(yàn)的平均花費(fèi)時(shí)間顯示MNC與對(duì)照組之間有顯著性差異(分別為p＝0.0339和0.0492)(圖42)。雖然MNC組找到逃脫平臺(tái)花費(fèi)的時(shí)間傾向短于MASC組，但不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異?？臻g探索試驗(yàn)中，MNC組大鼠顯示比對(duì)照組(p＝0.0419)和MASC組(p＝0.0453)大鼠有顯著改善(圖43)。呆在平臺(tái)位置象限上的平均時(shí)間三組中MNC組最長。MNC與對(duì)照組之間存在顯著性差異(p＝0.0339)(圖43)。實(shí)施例11組織學(xué)研究阻塞區(qū)域位于左半球外側(cè)一半，包括皮質(zhì)、紋狀體和海馬，大部分腦損傷區(qū)觀察到囊腫和疤痕形成。與對(duì)側(cè)相比，患病側(cè)海馬萎縮，出現(xiàn)部分形態(tài)不規(guī)則的神經(jīng)元和神經(jīng)元喪失。測(cè)定了所有MCAO模型中的阻塞體積。33天時(shí)MNC、MASC和對(duì)照組的平均阻塞體積分別為50.7±10.9％、51.0±10.2％和50.9±11.1％，三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。移植的GFP標(biāo)記的MASC和MNC細(xì)胞主要位于完整組織與阻塞區(qū)之間的邊緣區(qū)域，包括同側(cè)皮質(zhì)、白質(zhì)胼胝體、紋狀體和海馬。觀察到炎癥細(xì)胞滲入阻塞病灶。MNC與MASC二組之間阻塞病灶中滲入的炎癥細(xì)胞數(shù)似無差異。大量GFP標(biāo)記的MNC細(xì)胞為MAP-2免疫標(biāo)記陽性，顯示在宿主腦中長出了軸突。它們也是Tuj1和β-微管蛋白3免疫標(biāo)記陽性。在同側(cè)海馬，GFP標(biāo)記的MNC細(xì)胞有許多細(xì)胞小體和軸突為NF-M陽性。大部分GFP標(biāo)記的移植MNC細(xì)胞為MAP-2B陽性(84.0±8.1％)，而只有一小部分細(xì)胞為GFAP陽性(1.0±0.2％)。相反，在宿主腦中絕大多數(shù)MASC細(xì)胞為神經(jīng)元標(biāo)記(MAP-2、Tuj1、β-微管蛋白3和NF-M)和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記(GFAP)陰性。GFP-標(biāo)記細(xì)胞中的MAP-2和GFAP陽性細(xì)胞的百分比分別為1.4±0.2％和4.8±1.0％。沒發(fā)現(xiàn)MAP-2陽性MASC細(xì)胞中形成軸突。宿主前腦中MNV和MASC的平均數(shù)為13250±1126和5850±997。移植后一個(gè)月檢測(cè)到約30-45％移植的MNC細(xì)胞，另一方面檢測(cè)到10-20％的移植MASC細(xì)胞。在局部缺血的腦中MNC的存活率大大高于MASC。在海馬中，MNC的平均數(shù)為790±160，89％為MAP-2陽性。相反，MASC的平均數(shù)為470±66，0.6％為MAP-2陽性，表明大多數(shù)移植的MASC細(xì)胞是神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記陰性。所有各組大鼠MCAO術(shù)后41天，腦實(shí)質(zhì)中沒觀察到腫瘤形成。參考文獻(xiàn)AiharaN，MizukawaK，KoieK，MabeH，NishinoH.StriatalgraftsininfarctstriatopallidumincreaseGABArelease，recognizeGABAareceptorandimprovewatermazelearningintherat(大鼠梗塞的紋狀體蒼白球紋狀體移植提高了GABA釋放、識(shí)別GABAa受體和改善了水迷宮識(shí)別)BrainRes.1994；33483-488AltumbabicM，PeelingJ，DelBigioMR.Intracerebralhemorrhageintherateffectsofhematomaaspiration(大鼠腦內(nèi)出血血腫抽吸術(shù)的效果).Stroke.1998；291917-22.Azizi，S.A.，Stokes，D.，Augelli，B.J.，DiGirolamo，C.，Prockop，D.J.Engraftmentandmigrationofhumanbonemarrowstromalcellsimplantedinthebrainsofalbinorats-similaritiestoastrocytegrafts(植入albino-大鼠腦中的人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的遷移類似于移植的星形細(xì)胞).ProcNatlAcadSciUSA，1998；953908-13.BedersonJB，PittsLH，TsujiM，NishimuraMC，DavisRL，BartkowskiH.Ratmiddlecerebralarteryocclusionevaluationofthemodelanddevelopmentofaneurologicexamination(大鼠中腦動(dòng)脈梗塞神經(jīng)學(xué)檢查的模型評(píng)價(jià)和開發(fā)).Stroke.1986；17472-6.BjorklundA，LindvallO.Cellreplacementtherapiesforcentralnervoussystemdisorders(中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的細(xì)胞置換療法).NatNeurosci.2000；3537-44.BorlonganCV，CahillDW，SanbergPR.Locomotorandpassiveavoidancedeficitsfollowingocclusionofthemiddlecerebralartery(中腦動(dòng)脈梗塞后的運(yùn)動(dòng)和被動(dòng)回避缺陷).PhysiolBehav.1995，58909-17.BorlonganCV，F(xiàn)ujisakiT，WatanabeS.Chroniccyclosporine-Ainjectioninratswithdamagedblood-brainbarrierdoesnotimpairretentionofpassiveavoidance(給血腦屏障損傷大鼠長期注射環(huán)孢菌素A不會(huì)傷害其被動(dòng)回避的記憶).NeurosciRes.1998，32195-200.BorlonganCV，HidaH，NishinoH.Earlyassessmentofmotordysfunctionsaidsinsuccessfulocclusionofthemiddlecerebralartery(成功堵塞中腦動(dòng)脈時(shí)運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)的早期評(píng)價(jià)).Neuroreport.1998；93615-21.BorlonganCV，TajimaY，TrojanowskiJQ，LeeVM，SanbergPRTransplantationofcryopreservedhumanembryonalcarcinoma-derivedneurons(NT2Ncells)promotesfunctionalrecoveryinischemicrats(移植凍存的人胚胎癌衍生的神經(jīng)元(NT2N細(xì)胞)促進(jìn)了局部缺血大鼠的功能恢復(fù)).ExpNeurol.1998；149310-21.BorlonganCV，YamamotoM，TakeiN，KumazakiM，UngsuparkornC，HidaH，SanbergPR，NishinoH.Glialcellsurvivalisenhancedduringmelatonin-inducedneuroprotectionagainstcerebralischemia(褪黑激素誘導(dǎo)提高了膠質(zhì)細(xì)胞的存活對(duì)腦缺血提供了神經(jīng)保護(hù)).FASEBJ.2000；141307-17BrundinP，WidnerH，NilssonOG，StreckerRE，BjorklundA.Intracerebralxenograftsofdopamineneuronstheroleofimmunosuppressionandtheblood-brainbarrier(多巴胺神經(jīng)元腦內(nèi)異種移植免疫抑制和血腦屏障的作用).ExpBrainRes.1989；75195-207.ButcherSP，HenshallDC，TeramuraY，IwasakiK，SharkeyJ.NeuroprotectiveactionsofFK506inexperimentalstrokeinvivoevidenceagainstanantiexcitotoxicmechanism(FK506在實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)中的神經(jīng)保護(hù)作用抗興奮毒素機(jī)制的體內(nèi)證據(jù)).JNeurosci.1997；176939-46.ButovasS，LukkarinenJ，VirtanenT，JolkkonenJ，SiveniusJ.Differentialeffectofthealpha2-adrenoceptorantagonist，atipamezole，inlimb-placingtaskandskilledforepawusefollowingexperimentalstroke(α2-腎上腺能受體拮抗劑atipamezole在實(shí)驗(yàn)性中風(fēng)后的肢體位置試驗(yàn)和熟練的前爪使用中的不同作用).RestorNeurolNeurosci.2001；18143-51.ChenJ，LiY，WangL，LuM，ZhangX，ChoppM.Therapeuticbenefitofintracerebraltransplantationofbonemarrowstromalcellsaftercerebralischemiainrats(大鼠腦缺血后大腦內(nèi)移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞的治療效果).JNeurolSci.2000；18949-57.ChenJ，SanbergPR，LiY，WangL，LuM，WillingAE，Sanchez-RamosJ，ChoppM.Intravenousadministrationofhumanumbilicalcordbloodreducesbehavioraldeficitsafterstrokeinrats(靜脈內(nèi)給予人臍帶血減少了大鼠中風(fēng)后的行為缺陷).Stroke.2001Nov；32(11)2682-8.ChenJ，LiY，WangL，ZhangZ，LuD，LuM，ChoppM.Therapeuticbenefitofintravenousadministrationofbonemarrowstromalcellsaftercerebralischemiainrats(靜脈給予腦局部缺血大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的治療效果).Stroke.2001；321005-11.ChoppM，LiY.Treatmentofneuralinjurywithmarrowstromalcells(用骨髓基質(zhì)細(xì)胞治療神經(jīng)損傷).LancetNeurol.2002；192-100.Chu，K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患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷處。21.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞是實(shí)質(zhì)內(nèi)給予的。22.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞包括人骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞。23.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述提供骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞包括提供骨髓粘附性干細(xì)胞；和誘導(dǎo)該骨髓粘附性干細(xì)胞形成骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞。24.如權(quán)利要求23所述的方法，還包括使骨髓粘附性干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化產(chǎn)生所述神經(jīng)元前體細(xì)胞；和誘導(dǎo)所述神經(jīng)元前體細(xì)胞形成神經(jīng)元細(xì)胞。25.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷是缺血性中風(fēng)或出血性中風(fēng)造成的。26.如權(quán)利要求18所述的方法，還包括給予患者免疫抑制劑。27.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述功能恢復(fù)是部分功能恢復(fù)。28.如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)于患者是同種異體細(xì)胞。29.一種移植物形成單元，其包含骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體，所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞存在量足以在給予患者所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞后促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷患者的功能恢復(fù)。30.如權(quán)利要求29所述的移植物形成單元，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的載體包括溶劑、分散介質(zhì)、抗菌劑或抗真菌劑。31.如權(quán)利要求29所述的移植物形成單元，其特征在于，所述移植物包含神經(jīng)元前體細(xì)胞，神經(jīng)元前體細(xì)胞的數(shù)量約為1萬個(gè)至約1億個(gè)。32.如權(quán)利要求29所述的移植物形成單元，其特征在于，所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞含有標(biāo)記。33.如權(quán)利要求29所述的移植物形成單元，其特征在于，所述骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞包括人骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞。全文摘要公開了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的方法和材料。優(yōu)選的方法和材料包括神經(jīng)元前體細(xì)胞和/或骨髓粘附性干細(xì)胞衍生的神經(jīng)元細(xì)胞。文檔編號(hào)C12N5/06GK101605552SQ200680015279公開日2009年12月16日申請(qǐng)日期2006年3月6日優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日發(fā)明者出澤真理,森敬太申請(qǐng)人:桑比歐公司