8% (圖4中A)。不僅如此，誘導(dǎo)細(xì)胞不僅建立起神經(jīng)元特異的轉(zhuǎn)錄譜，同時(shí)成纖 維細(xì)胞特異基因，如Fspl、Collal的表達(dá)也被沉默（圖3中G和圖4中A)。
[0205] 4、CiNs具備的神經(jīng)元電生理功能特征
[0206] 為了檢測(cè)CiNs的電生理功能特性，對(duì)步驟3的CiNs進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí) 驗(yàn)（圖5中A)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)14-20天的CiNs細(xì)胞膜去極化后，電流鉗取具有顯著細(xì)胞突起 的CiNs細(xì)胞檢測(cè)，能夠記錄到動(dòng)作電位（35. 0%，n= 20)(圖5中B;表4)。同時(shí)，電壓鉗 記錄到快速非活化內(nèi)向及外向電流，證明CiNs細(xì)胞膜表面電壓依賴的鉀離子及鈉離子通 道開放（圖5中C;表4)。此外，將CiNs與單層培養(yǎng)的原代膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元共培養(yǎng)后， CiNs細(xì)胞膜的神經(jīng)元功能特性顯著增強(qiáng)（53. 8%，n= 39)(圖5中D和E;表5)。自發(fā)的 興奮性突觸后電流也被檢測(cè)到（47. 6%，n= 21)(圖5中F和圖4中B;表5)。興奮性突 觸后電流可以被受體特異的拮抗劑，如6-氰基-7-硝基喹喔啉-2, 3-二酮（CNQX)和2-氨 基-5-磷?；焖狨ィˋP5)，所抑制（圖5中F)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明CiNs具有神經(jīng)元細(xì)胞 膜的功能特性，并且在與原代膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元共培養(yǎng)后，CiNs細(xì)胞之間或與原代神經(jīng)元 之間能夠形成突觸連接和通訊。
[0207] 表4.未經(jīng)共培養(yǎng)的CiNs電生理特性
[0208]
[0209]
[0210] 注：Rm:輸入阻抗；Cm:膜電容；RMP:靜息膜電位；APthreshold:動(dòng)作電位閾值； APamp:動(dòng)作電位峰度；Ina-max:最大鈉電流峰值。所有數(shù)據(jù)為均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0211] 表5.經(jīng)原代膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元共培養(yǎng)的CiNs電生理特性
[0212]
[0213] 注：所有數(shù)據(jù)為均值+/_標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0214] 5、細(xì)胞譜系追蹤證明化學(xué)重編程誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元
[0215] 為了證明化學(xué)重編程得到的神經(jīng)元是由成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變而來，利用Cre-LoxP細(xì) 胞譜系追蹤系統(tǒng)來跟蹤表達(dá)成纖維細(xì)胞特異基因，F(xiàn)spl，的細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)變（Bhowmicket al.，2004;Iwanoetal.，2002;Madisenetal.，2010;Strutzetal.，1995)(圖 6 中A) 〇 由TdTomato焚光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)另一種典型成纖維細(xì)胞蛋白，C0L1A1，從而進(jìn)一 步證明被標(biāo)記細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（圖6中B和C)。在經(jīng)過化學(xué)誘導(dǎo)后（用上述FICB培養(yǎng) 基培養(yǎng)），TdTomato陽性細(xì)胞發(fā)出大量神經(jīng)元樣細(xì)胞突起（圖6中D)。結(jié)果表明TdTomato 陽性細(xì)胞可以通過化學(xué)重編程相對(duì)高效地被誘導(dǎo)為神經(jīng)元（圖6中E-?。以上結(jié)果為化學(xué) 重編程誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元提供了直接的遺傳學(xué)證據(jù)。
[0216] 6、CiNs的化學(xué)誘導(dǎo)過程不經(jīng)過中間增殖階段
[0217] 為了進(jìn)一步理解化學(xué)重編程所經(jīng)歷的中間過程，在上述小分子誘導(dǎo)（用上述FICB 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)）來自雜合TauEGFP基因敲入小鼠的小鼠胚胎皮膚來源的成纖維細(xì)胞進(jìn)行 化學(xué)重編程的同時(shí)，用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU)處理細(xì)胞（圖7中A)(Vierbuchenet al.，2010)。結(jié)果顯示大部分（約80% )的TUJ1陽性細(xì)胞沒有被BrdU標(biāo)記（圖7中B和 0,說明化學(xué)小分子誘導(dǎo)的細(xì)胞重編程并不經(jīng)過中間細(xì)胞增殖階段。
[0218] 7、在誘導(dǎo)CiNs產(chǎn)生的過程中，小分子直接激活了神經(jīng)元關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子并打破 了成纖維細(xì)胞特異的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
[0219] 為探究小分子如何在化學(xué)重編程中發(fā)揮作用，首先采用每個(gè)小分子的功能替代物 嘗試將其替代來進(jìn)一步研究他們的生物學(xué)活性。將來自雜合TauEGFP基因敲入小鼠的小 鼠胚胎皮膚來源的成纖維細(xì)胞分別在相應(yīng)的小分子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中按照上述方法進(jìn)行培養(yǎng) 14-21天后檢測(cè)TUJ1陽性細(xì)胞。結(jié)果表明Forskolin(cAMP激活劑）、CHIR99021 (GSK3抑制 劑）和I-BET151 (BET家族溴結(jié)構(gòu)域抑制劑）分別可以被其他的cAMP激活劑、GSK3抑制劑 和BET抑制劑所替代（圖4中C)，表明了他們?cè)贑iNs化學(xué)重編程誘導(dǎo)過程中的功能靶點(diǎn)。
[0220] 為了更好地理解細(xì)胞命運(yùn)重編程的過程，用RNA-Seq分析來檢測(cè)小分子處理48小 時(shí)以及19天后的細(xì)胞（用上述FICB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)雜合TauEGFP基因敲入小鼠的MEFs48 小時(shí)和19天）整體基因表達(dá)譜的變化。層次聚類的結(jié)果顯示，誘導(dǎo)細(xì)胞和原代神經(jīng)元聚類 很近，但和成纖維細(xì)胞很遠(yuǎn)（圖8中A)。相應(yīng)的，在選取了特異表達(dá)于成纖維細(xì)胞、CiNs和 原代神經(jīng)元中的特異表達(dá)基因（表達(dá)量相差至少3倍）進(jìn)行分析后（Caiazzoetal.，2011; Duetal.，2014)，發(fā)現(xiàn)這些特異表達(dá)基因的重疊情況在誘導(dǎo)后的細(xì)胞和原代神經(jīng)元之間 呈現(xiàn)出一定的相似性（圖8中B)。對(duì)比成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)19天后的細(xì)胞（神經(jīng)元樣細(xì)胞， CiNs)富集表達(dá)很多神經(jīng)元特異的基因，包括參與神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生和維持、離子通道以及功 能突觸組分的基因（Mapt、Gap43、Stmn3、Stmn4、Synl、Syp和Sytl)(圖 8 中C和D)。此外， 成纖維細(xì)胞標(biāo)志基因（Fap、Des、Twist2等）被下調(diào)了（圖8中D)(Caiazzoetal.，2011; Kimetal.，2011)，表明CiNs丟失了原始的成纖維細(xì)胞特性。其中，以成纖維細(xì)胞中同一 基因的表達(dá)量為1，誘導(dǎo)19天后的細(xì)胞（神經(jīng)元樣細(xì)胞，CiNs)中的Fap，Des,Slug,Den,和 Twist2表達(dá)量分別是0、0. 04、0. 16、0. 003、0. 065。與此結(jié)果具有一致性的是，在進(jìn)一步選 擇了特異性表達(dá)基因（表達(dá)量高至少10倍）進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)小分子誘導(dǎo)的細(xì)胞中成纖維 細(xì)胞基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)被打破了，而神經(jīng)元富集基因被上調(diào)了（圖9中A)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)19天后， 60. 6%的神經(jīng)元富集基因被上調(diào)了至少兩倍，而只有1.8%被下調(diào)了。另外，80%的成纖維 細(xì)胞富集基因被下調(diào)了至少兩倍，而只有6. 1 %被上調(diào)了，這表明化學(xué)誘導(dǎo)既可以整體性地 激活神經(jīng)元富集基因，同時(shí)又能抑制成纖維細(xì)胞富集基因的表達(dá)（圖9中A)。GO分析顯示 化學(xué)誘導(dǎo)后上調(diào)的基因主要是參與突觸傳導(dǎo)、神經(jīng)元分化、神經(jīng)元發(fā)育、離子運(yùn)輸、軸突生 成、離子通道激活以及其他一些神經(jīng)發(fā)育的關(guān)鍵生物學(xué)過程（圖9中E)。下調(diào)的基因則主 要參與細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂等生物學(xué)過程（圖9中E)。綜合在一起，這些結(jié)果表明小分子誘 導(dǎo)后的細(xì)胞獲得了一個(gè)類似原代神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄譜并打破了原始細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。
[0221] RT-qPCR分析結(jié)果表明神經(jīng)命運(yùn)決定基因的激活和成纖維細(xì)胞命運(yùn)決定基因的下 調(diào)在小分子處理24小時(shí)之內(nèi)就發(fā)生了（圖9中B和C)。ISX9對(duì)于激活很多神經(jīng)元特異基 因是必需的，包括像NeuroDl這種神經(jīng)元主宰基因（matergenes)(圖9中D)。在化學(xué)誘 導(dǎo)48小時(shí)后，NeuroDl和Ngn2這兩個(gè)神經(jīng)命運(yùn)主宰基因的表達(dá)被顯著上調(diào)了（圖9中B和 E)，表明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與了最初的化學(xué)誘導(dǎo)過程。有意思的是，Ascii這一最常被 用于誘導(dǎo)神經(jīng)元命運(yùn)轉(zhuǎn)變的主宰轉(zhuǎn)錄因子在重編程早期并沒有被激活（圖9中B)。
[0222] 接下來，確定了每個(gè)小分子在調(diào)節(jié)這些內(nèi)源性細(xì)胞命運(yùn)決定基因的表達(dá)上的作 用。通過從組合中逐一撤除每個(gè)小分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISX9對(duì)于誘導(dǎo)關(guān)鍵神經(jīng)基因是必需的 (圖9中D-F)，表明這些小分子是通過一個(gè)基于ISX9的協(xié)同作用來誘導(dǎo)神經(jīng)命運(yùn)決定基因 表達(dá)的。有意思的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明I-BET151是抑制內(nèi)源性成纖維細(xì)胞命運(yùn)決定基因表達(dá) 譜的核心小分子（圖9中F和G)，導(dǎo)致了成纖維細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的有效破壞。這些結(jié)果 表明小分子通過協(xié)同性地激活目的細(xì)胞命運(yùn)主宰基因并抑制起始細(xì)胞命運(yùn)主宰基因的方 式對(duì)細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)行了操控（圖9中H)。
[0223]二、討論
[0224] 本申請(qǐng)開發(fā)了一組全新的小分子，能夠高效誘導(dǎo)從成纖維細(xì)胞向功能神經(jīng)元細(xì)胞 跨胚層的直接譜系重編程。這些化學(xué)方法誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)出原代神經(jīng)元細(xì)胞的特 征，體現(xiàn)在表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞的基因表達(dá)譜以及具備相應(yīng)的電生理功能?；瘜W(xué)方法直接重編程 誘導(dǎo)神經(jīng)元的發(fā)現(xiàn)和化學(xué)方法誘導(dǎo)細(xì)胞多能性的發(fā)現(xiàn)（Houetal.，2013)證明了體細(xì)胞命 運(yùn)能夠通過采用小分子化合物操縱細(xì)胞信號(hào)通路和內(nèi)源的細(xì)胞命運(yùn)決定網(wǎng)絡(luò)的方式實(shí)現(xiàn)， 而整個(gè)過程不需要外源轉(zhuǎn)基因或其它細(xì)胞命運(yùn)特異的因子，比如microRNAs。
[0225] 雖然主宰轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為是細(xì)胞命運(yùn)的主導(dǎo)決定因素（Xuetal.，2015)，本申請(qǐng) 展示了一組小分子化合物就足夠激活這些基因的表達(dá)。就像在研究中展示的一樣，ISX9, 一 種異惡唑，已經(jīng)被報(bào)道通過激活的鈣離子信號(hào)促進(jìn)神經(jīng)分化（Schneideretal.，2008)，在 本申請(qǐng)的誘導(dǎo)體系中對(duì)于在成纖維起始細(xì)胞上激活神經(jīng)基因是必須的，這種激活效應(yīng)被其 它小分子進(jìn)一步加強(qiáng)（圖9中D和E)。在誘導(dǎo)CiNs的重編程過程中，Ngn2和NeuroDl是 第一輪響應(yīng)的基因，它們?cè)谛》肿犹幚?小時(shí)內(nèi)就被激活（9中B)。最近，Ngn2,在發(fā)育中 的神經(jīng)命運(yùn)決定性的原神經(jīng)基因，已經(jīng)被報(bào)道可以在輔助其它轉(zhuǎn)錄因子和小分子的情況下 從成纖維細(xì)胞直接誘導(dǎo)神經(jīng)命運(yùn)的發(fā)生（Bertrandetal.，2002;Liuetal.，2013)。其 它的神經(jīng)基因（因子）也在接下來的化學(xué)重編程進(jìn)程中被后續(xù)性激活（圖9中A和圖8中 D)。這些結(jié)果揭示了小分子主導(dǎo)的成纖維細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的直接重編程過程是一種層級(jí) 性的轉(zhuǎn)錄激活的過程，在這個(gè)過程中被小分子有效激活的細(xì)胞命運(yùn)決定的基因可能起始和 穩(wěn)定了自我調(diào)節(jié)的神經(jīng)特異性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)環(huán)路，并進(jìn)一步的激發(fā)了下游的調(diào)控基因的表達(dá)， 并建立神經(jīng)元的功能特征。
[0226] 有趣的是，添加到小分子組合中的I-BET151顯著的增進(jìn)了重編程過程（圖3中B 和C)，并且，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)I-BET151是破壞成纖維細(xì)胞核心轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的核心小分子（圖9中 F) <J-BET151被報(bào)道能夠競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合到BET家族蛋白的BRD結(jié)構(gòu)域（Sealetal.，2012)。 BRD4，BET家族蛋白之一，被報(bào)道能夠特異性的結(jié)合到已激活（開放的）染色質(zhì)區(qū)域和維持 細(xì)胞特異的基因表達(dá)譜BRD4(Wuetal，2015)。抑制BRD4可能破壞細(xì)胞命運(yùn)的維持特性并 且改變起始細(xì)胞類型的表達(dá)譜（Chiangetal.，2014;DiMiccoetal.，2014)，這和本申 請(qǐng)發(fā)現(xiàn)的I-BET151在早期重編程過程中直接破壞了成纖維細(xì)胞特異的基因網(wǎng)絡(luò)是一致的 (圖9中D和F)。并且，本申請(qǐng)也和細(xì)胞命運(yùn)改變的"彼此抑制模型"(Wangetal.，2011)，以 及已有的報(bào)道證明細(xì)胞命運(yùn)能夠通過敲除起始細(xì)胞類型的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子是一致的（Hanna etal.，2008)。并且，就在最近已發(fā)現(xiàn)BRD4通過結(jié)合到核心基因的超級(jí)增強(qiáng)子上來維持胚 胎干細(xì)胞（ESCs)的多能性，而抑制BRD4導(dǎo)致ESCs核心干性網(wǎng)絡(luò)的丟失和促使向神經(jīng)外胚 層的特化（DiMiccoetal.，2014)。作用于結(jié)合在超級(jí)增強(qiáng)子區(qū)的蛋白復(fù)合體或者相關(guān)激 活（維持）基因表達(dá)的因子上的小分子有可能將來能夠成為一種廣泛的擦除起始細(xì)胞身份 的擦除劑。
[0227]另外，雖然在本申請(qǐng)的研究中被鑒定出的小分子并非特異作用神經(jīng)譜系的，但 是它們作用的信號(hào)通路已被報(bào)道涉及體外的神經(jīng)定向分化，甚至包括體內(nèi)的神經(jīng)發(fā)育。 CHIR99021通常作為一個(gè)糖原合成酶激酶3B的抑制劑被用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)分化 (Chambersetal.，2009)，并且這個(gè)小分子最近也被報(bào)道能夠增進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的神經(jīng)直 接重編程（Ladewigetal.，2012)。Forskolin是一種獨(dú)特的二砲腺苷酸環(huán)化酶激活劑， 并且通常被用于增加cAMP的水平（Seamonetal.，1981)，而cAMP反應(yīng)結(jié)合元件（CREB)， Forskolin的一個(gè)下游祀點(diǎn)，已經(jīng)被報(bào)道用來調(diào)節(jié)神經(jīng)的特化和促進(jìn)軸突的再生（Seamon etal.，1981;Dworkinetal.，2010)。這些在定向分化和譜系重編程上有雙重功能的小分 子揭示了發(fā)育線索和發(fā)育相關(guān)的信號(hào)通路對(duì)于開發(fā)促進(jìn)細(xì)胞譜系重編程也是很有教益的。
[0228] 總體而言，本申請(qǐng)揭示了一張新奇的再生醫(yī)學(xué)藍(lán)圖，通過使用化學(xué)藥劑來改變和 設(shè)計(jì)細(xì)胞身份。CiNs和CiPSCs(Houetal.，2013)兩項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)揭示了一種通過開發(fā)小 分子來操縱細(xì)胞命運(yùn)的普適性策略，這種策略通過小分子替代已經(jīng)報(bào)道的用于譜系重編程 的基因，激活目標(biāo)細(xì)胞類型特異的主宰基因和沉默起始細(xì)胞類型的核心基因表達(dá)（實(shí)現(xiàn)細(xì) 胞命運(yùn)的操縱）。考慮到這種方法未來潛在的治療用途，可以預(yù)期未來通過采用當(dāng)前已經(jīng)建 立的這種化學(xué)重編程策略，來操縱人類細(xì)胞命運(yùn)。在未來，本申請(qǐng)將可能引導(dǎo)新的其它小分 子的發(fā)現(xiàn)，這些新組建的小分子組合將可能實(shí)現(xiàn)直接重編程獲得其它功能細(xì)胞類型，并有 可能幫助更精確的鑒定出決定細(xì)胞命運(yùn)和重編程的新的因子。并且，本申請(qǐng)的研究可能對(duì) 體細(xì)胞命運(yùn)的可塑性提供了新的觀點(diǎn)，揭示出細(xì)胞命運(yùn)的可塑性可能比以往認(rèn)為的更加靈 活、更加具備可操作性。
[0229] 參考文獻(xiàn)
[0230]Bhowmick，N.A.，Chytil，A.，Plieth，D.，Gorska，A.E.，Dumont，N.，Shappell，S .,Washington,M.K. ,Neilson,E.G. ,andMoses,H.L. (2004).TGF-betasignalingin fibroblastsmodulatestheoncogenicpotentialofadjacentepithelia.Science 303,848-851.
[0231]Bertrand,N. ,Castro,D.S. ,Guillemot,F.Proneuralgenesandthe specificationofneuralcelltypes.NatRevNeurosci3,517 - 530 (2002)
[0232]Caiazzo,M. ,Dell'Anno,M.T. ,Dvoretskova,E. ,Lazarevic,D. ,Taverna,S. ,Le 〇,D.，Sotnikova，T.D.，Menegon，A.，Roncaglia，P.，Colciago,G.，etal. (2011).Direct generationoffunctionaldopaminergicneuronsfrommouseandhumanfibroblasts. Nature476, 224-227.
[0233]Chambers,S.M. ,Fasano,C.A. ,Papapetrou,E. P.，Tomishima，M.，Sadelain，M.，andStuder,L. (2009).Highlyefficientneural conversionofhumanESandiPScellsbydualinhibitionofSMADsignaling.Nat Biotechnol27, 275-280.
[0234]Chanda,S. ,Ang,C.E. ,Davila,J. ,Pak,C. ,Mall,M. ,Lee,Q. Y.,Ahlenius,H. ,Jung,S.ff. ,Sudhof,T.C. ,andffernig,M. (2014).Generationofinduced neuronalcellsbythesinglereprogrammingfactorASCL1.StemCellReports 3, 282-296.
[0235]Chiang,C.M. (2014).Nonequivalentresponsetobromodomain-targetingBET inhibitorsinoligodendrocytecellfatedecision.ChemBiol21,804-806.
[0236]Davis,R.L. ,ffeintraub,H. ,andLassar，A.B. (1987) ?Expressionofasingle transfectedcDNAconvertsfibroblaststomyoblasts.Cell51,987-1000.
[0237]DiMicco,R. ,Fontanals-Cirera,B. ,Low,V. ,Ntziachristos,P. ,Yuen,S. K. ,Lovell,C.D. ,Dolgalev,I. ,Yonekubo,Y. ,Zhang,G. ,Rusinova,E. ,etal. (2014). ControlofembryonicstemcellidentitybyBRD4_dependenttranscriptional elongationofsuper-enhancer-associatedpluripotencygenes.CellRep9, 234-247.
[0238]Dworkin,S. ,andMantamadiotis,T. (2010).TargetingCREBsignallingin neurogenesis.ExpertOpinTherTargets14,869-879.
[0239]Hanna,J. ,Markoulaki,S. ,Schorderet,P. ,Carey,B.ff. ,Beard,C. ,fferni g，M.，Creyghton，M.P.，Steine，E.J.，Cassady，J.P.，F(xiàn)oreman，R.，etal. (2008) ? DirectreprogrammingofterminallydifferentiatedmatureBlymphocytesto pluripotency.Cell133, 250-264.
[0240]Iwano,M.，PIieth，D.，Danoff，T.M.，Xue，C.，Okada，H.，andNei1son，E. G. (2002).Evidencethatfibroblastsderivefromepitheliumduringtissue fibrosis.JClinInvest110,341-350.
[0241]Kim，J.，Su，S.C.，Wang，H.，Cheng，A.W.，Cassady，J.P.，Lodato,M.A.，Lengner，C. J. ,Chung,C.Y. ,Dawlaty,M.M. ,Tsai,L.H. ,etal. (2011).Functionalintegrationof dopaminergicneuronsdirectlyconvertedfrommousefibroblasts.CellStemCell 9, 413-419.
[0242] Ladewig，J.，Mertens，J.，Kesavan，J.，Doerr，J.，Poppe，D.，Glaue，F(xiàn).，Herms，S. ,ffernet,