本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及擬南芥atnac018蛋白及其編碼基因在植物耐逆及抗衰老中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

農(nóng)作物的生產(chǎn)受到鹽堿、干旱等非生物脅迫的影響非常嚴(yán)重。全世界約有20％的耕地和50％的灌溉田受到不同程度的鹽害威脅，并有逐年增加的趨勢。我國鹽漬土地面積約為1.4億畝，占耕地總面積的近7％，此外還有鹽漬荒地2億多畝。全世界干旱和半干旱地區(qū)總面積占陸地總面積的34.9％；我國干旱、半干旱耕地面積占總面積的51％。通過轉(zhuǎn)基因提高作物的耐鹽抗旱能力是一條行之有效的辦法。因此，尋找與鹽、干旱脅迫有關(guān)的基因并研究其具體功能，以及調(diào)控途徑具有重要的理論和實踐意義。

植物衰老，一般認為是指一個器官或整個植株生命功能的衰退并最終導(dǎo)致其自然死亡的一系列變化過程。衰老過程通常伴隨有植株生長速度減慢、植株活力下降、對周圍環(huán)境的改變變得敏感、抗病蟲能力減弱等現(xiàn)象的發(fā)生。衰老是受高度調(diào)控的一系列有序事件，包括光合作用能力喪失、葉綠體解體、co2固定、酶和其它蛋白質(zhì)降解、葉綠體喪失和氨基酸的去除等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供擬南芥atnac018蛋白及其編碼基因在植物耐逆及抗衰老中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了atnaco18蛋白或其編碼基因的應(yīng)用，為如下(a1)和/或(a2)：

(a1)調(diào)控植物耐逆性；

(a2)調(diào)控植物衰老過程；

所述atnaco18蛋白為如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

atnaco18蛋白的編碼基因可為如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

(c1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；

(c2)序列表的序列3所示的dna分子；

(c3)在嚴(yán)格條件下與(c1)或(c2)限定的dna序列雜交且編碼植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)蛋白的dna分子；

(c4)與(c1)或(c2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)蛋白的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

atnaco18蛋白的編碼基因的表達量越高，植物的耐逆性越強。atnaco18蛋白的編碼基因的表達量越低，植物的耐逆性越弱。atnaco18蛋白的編碼基因的表達量越高，植物的衰老延緩程度越強。atnaco18蛋白的編碼基因的表達量越低，植物的衰老程度越強。

在實際應(yīng)用中，當(dāng)所選育的植物品種為耐逆性降低和/或提前衰老的植物品種時，需將atnaco18蛋白的編碼基因的表達量較低的植株作為親本進行雜交。在實際應(yīng)用中，當(dāng)所選育的植物品種為耐逆性增強和/或延緩衰老的植物品種時，需將atnaco18蛋白的編碼基因的表達量較高的植株作為親本進行雜交。

本發(fā)明還保護一種培育耐逆性增強的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將atnaco18蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性增強的轉(zhuǎn)基因植物；

所述atnaco18蛋白為如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

所述atnaco18蛋白的編碼基因為如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

(c1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；

(c2)序列表的序列3所示的dna分子；

(c3)在嚴(yán)格條件下與(c1)或(c2)限定的dna序列雜交且編碼植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)蛋白的dna分子；

(c4)與(c1)或(c2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)蛋白的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

atnaco18蛋白的編碼基因的表達量越高，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性越強。

所述耐逆性可為耐鹽和/或耐旱。所述耐鹽具體可體現(xiàn)為在高鹽環(huán)境下的存活率高。所述高鹽環(huán)境具體可為200mm的nacl水溶液引起的環(huán)境。所述耐旱具體可體現(xiàn)為在干旱環(huán)境下的存活率高。所述干旱環(huán)境具體可為連續(xù)兩周不澆水。

所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為擬南芥，具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。

本發(fā)明還保護一種培育衰老延緩的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將atnaco18蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫剿ダ涎泳彽霓D(zhuǎn)基因植物；

所述atnaco18蛋白為如下(b1)或(b2)：

(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

所述atnaco18蛋白的編碼基因為如下(c1)或(c2)或(c3)或(c4)：

(c1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的dna分子；

(c2)序列表的序列3所示的dna分子；

(c3)在嚴(yán)格條件下與(c1)或(c2)限定的dna序列雜交且編碼植物耐逆性和/或衰老相關(guān)蛋白的dna分子；

(c4)與(c1)或(c2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼植物耐逆性和/或抗衰老相關(guān)蛋白的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。

atnaco18蛋白的編碼基因的表達量越高，所述轉(zhuǎn)基因植物的衰老延緩程度越強。

所述衰老延緩可為莢果衰老延緩和/或葉片衰老延緩。所述莢果衰老可以是在正常生長條件的環(huán)境。所述葉片衰老可以是在離體葉片在3μmaba溶液中培養(yǎng)3天的環(huán)境。

所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為擬南芥，具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。

上述任一所述方法中，atnaco18蛋白的編碼基因可以通過重組表達載體導(dǎo)入目的植物。所述重組表達載體可通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細胞或組織中。

可用現(xiàn)有的植物表達載體構(gòu)建含有atnaco18蛋白的編碼基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。使用atnaco18蛋白的編碼基因構(gòu)建重組表達載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種增強型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此外，使用atnaco18蛋白的編碼基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是atg起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。

為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入在植物中表達可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。

所述重組表達載體具體可為在質(zhì)粒pcm1205的多克隆位點(例如bamhi和kpni酶切位點之間)插入了序列表的序列2或序列3所示的雙鏈dna分子得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的實驗證明：將atnaco18基因?qū)霐M南芥中，轉(zhuǎn)基因擬南芥對高鹽和干旱的耐逆性顯著增加，具體表現(xiàn)為存活率顯著高于野生型及突變體對照，長勢顯著優(yōu)于野生型及突變體對照；將atnaco18基因?qū)霐M南芥中，轉(zhuǎn)基因擬南芥的衰老顯著延緩，具體表現(xiàn)為莢果的葉綠素含量和葉片的葉綠素含量顯著高于野生型及突變體對照。上述結(jié)果表明，atnaco18蛋白或其編碼基因具備耐干旱和耐鹽性及延緩衰老的作用。

附圖說明

圖1為atnaco18基因在各組織中的相對表達量。

圖2為westernblot的結(jié)果。

圖3為轉(zhuǎn)基因植株中atnaco18基因的表達量。

圖4為耐鹽性鑒定中的照片。

圖5為耐鹽性鑒定中的存活率結(jié)果。

圖6為耐旱性鑒定中的照片。

圖7為耐旱性鑒定中的存活率結(jié)果。

圖8為莢果衰老實驗中的照片。

圖9為莢果衰老實驗中葉綠素a/b及葉綠素的含量。

圖10為葉片衰老實驗中的照片。

圖11為葉片衰老實驗中葉綠素a/b及葉綠素的含量。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

peasy-t載體：全式金公司。質(zhì)粒pcm1205：clontech公司。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(col-0)：abrc。擬南芥anac018突變體(m)：abrc；擬南芥anac018突變體中，atnaco18基因被沉默。

提及“農(nóng)桿菌gv3101”的參考文獻：肖衛(wèi)民,趙名琛,鄒敏,蘇承剛,杜小兵,譚遠德,張興國.擬南芥受傷和接種根癌農(nóng)桿菌gv3101對轉(zhuǎn)錄的影響[j].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報.2013，21(5):537-545)。

培養(yǎng)基質(zhì)是將營養(yǎng)土和蛭石為等體積混合得到的。

檢測葉綠素a/b及葉綠素的含量的方法：參考文獻：紫外分光光度計測定葉綠素含量(嚴(yán)衍祿,劉心生.葉綠素測定方法的研究[j].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報.1982,8(2):53-66.

atnaco18蛋白如序列表的序列1所示。atnaco18基因如序列表的序列2所示。

實施例1、通過熒光定量pcr分析atnaco18基因的組織表達情況

分別提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的根、莖、蓮座葉、花、莢果組織的總rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna；然后分別以上述各組織的cdna為模板，采用5’-tactcatatttgtgacttcgg-3’和5’-atgaatatgatgaagatgatg-3’組成的引物對進行pcr擴增，檢測atnaco18基因在不同組織中的表達情況。同時以actin2/8基因作為內(nèi)參，檢測內(nèi)參的引物對如下：5’-ggtaacattgtgctcagtggtgg-3’和5’-aacgaccttaatcttcatgctgc-3’。

反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15min；95℃20sec、60℃30sec、72℃50sec，33個循環(huán)；72℃延伸5min。

atnaco18基因在各組織中的相對表達量見圖1。結(jié)果表明，atnaco18基因在所有組織中均有表達，在根中表達量最低，在莢果中表達量最高。

實施例2、atnaco18基因在提高植物耐逆性中的應(yīng)用

一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的莢果的總rna并反轉(zhuǎn)錄得到cdna。

2、以步驟1得到的cdna為模板，采用引物1和引物2組成的引物對進行pcr擴增，得到pcr產(chǎn)物。

引物1：5’-atggagagtacagattcttc-3’；

引物2：5’-ctcaagaataccaattcaaac-3’。

經(jīng)測序，pcr擴增產(chǎn)物如序列表的序列2所示。

3、將步驟2得到的pcr擴增產(chǎn)物與peasy-t載體連接，得到重組質(zhì)粒。

4、用限制性內(nèi)切酶bamhi和kpni雙酶切步驟3得到的重組質(zhì)粒，回收小片段。

5、用限制性內(nèi)切酶bamhi和kpni雙酶切質(zhì)粒pcm1205，回收約6800bp的載體骨架。

6、將步驟4得到的小片段與步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcm1205-atnaco18。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pcm1205-atnaco18進行結(jié)構(gòu)描述如下：在質(zhì)粒pcm1205的bamhi和kpni酶切位點之間插入了序列表的序列3所示的雙鏈dna分子。序列表的序列3的第4位至第966位即序列表的序列2。重組質(zhì)粒pcm1205-atnaco18中，atnaco18基因和gfp基因由同一個35s啟動子啟動表達。

二、制備轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥

1、將重組質(zhì)粒pcm1205-atnaco18導(dǎo)入農(nóng)桿菌gv3101，得到重組重組菌。

2、將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌的單克隆接種于含50mg/l氯霉素的lb液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)兩天，然后3000rpm/min離心5分鐘，收集菌體沉淀并用含5％蔗糖和0.03％silwetl-77的水溶液懸浮，得到侵染液。

3、取步驟2得到的侵染液，采用沾花浸染法轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，然后收獲種子(t1代)。

4、取步驟3得到的種子，播種于含50mg/l氯霉素的ms固體培養(yǎng)基平板上進行抗性篩選14天。

5、將步驟4中存活的幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基質(zhì)中，收獲種子(t2代)。

6、取步驟5得到的種子，播種于含50mg/l氯霉素的ms固體培養(yǎng)基平板上進行抗性篩選14天。

7、將步驟6中存活的幼苗轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基質(zhì)中，收獲種子(t3代)。

8、將步驟7得到的種子播種到培養(yǎng)基質(zhì)中，種子萌發(fā)后在長日照條件下生長兩周左右開花。

9、將步驟7得到的種子播種到培養(yǎng)基質(zhì)中，萌發(fā)10天后取整個植株，提取總蛋白，依次進行sds-page和westernblot。westernblot采用的一抗為gfp抗體(小鼠單抗)，購自碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為ag281。westernblot采用的二抗為堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗小鼠igg(h+l)，購自自碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號為a0258。結(jié)果見圖2。圖2中，t代表轉(zhuǎn)基因植株，wt代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。由于atnaco18基因和gfp基因由同一個35s啟動子啟動表達，westernblot中，gfp蛋白陽性的植株即為轉(zhuǎn)基因植株。

10、取步驟8中的轉(zhuǎn)基因植株(萌發(fā)10天后取整個植株)，提取總rna并反轉(zhuǎn)錄得到cdna，以cdna為模板，用引物1和引物2組成的引物對(引物1：5’-atggagagtacagattcttc-3’；引物2：5’-ctcaagaataccaattcaaac-3’)進行pcr鑒定，檢測atnaco18基因的表達量。同時以actin2/8基因作為內(nèi)參，檢測內(nèi)參的引物對如下：5’-ggtaacattgtgctcagtggtgg-3’和5’-aacgaccttaatcttcatgctgc-3’。將哥倫比亞生態(tài)型擬南芥和擬南芥anac018突變體作為對照。

部分結(jié)果見圖3。wt代表哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，m代表擬南芥anac018突變體，t代表轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥。結(jié)果表明，擬南芥anac018突變體中atnaco18基因的表達量顯著低于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥中atnaco18基因的表達量顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。

三、制備轉(zhuǎn)空載體擬南芥

用質(zhì)粒pcm1205代替重組質(zhì)粒pcm1205-atnaco18進行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥。

四、atnaco18基因的功能研究

1、幼苗耐逆試驗

(1)耐鹽性

取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子(wt)、擬南芥anac018突變體的種子(m)、t3代純合轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的種子(t)和t3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子，分別作為待測種子，進行如下操作：

試驗組：在ms培養(yǎng)基上播種待測種子并培養(yǎng)2周，然后將幼苗移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)2周(2周中，每兩天澆一次200mmnacl水溶液)，然后拍照并統(tǒng)計存活率。

對照組：在ms培養(yǎng)基上播種待測種子并培養(yǎng)2周，然后將幼苗移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)2周(2周中，每兩天澆一次水)，然后拍照并統(tǒng)計存活率；

培養(yǎng)條件：光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為300-400μmolm^-2s^-1；光照條件下的溫度為22-24℃，相對濕度為70-90％；黑暗條件下的溫度為18-20℃，相對濕度大于90％。

試驗重復(fù)3次，每次每個株系100粒種子，結(jié)果取平均值。

照片見圖4，上圖為對照組的照片，下圖為試驗組的照片。

存活率結(jié)果見圖5。

結(jié)果表明：鹽處理2周后，轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的幼苗的存活率顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、擬南芥anac018突變體和轉(zhuǎn)空載體擬南芥；鹽處理2周后，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的存活率與轉(zhuǎn)空載體擬南芥沒有顯著差異。

(2)耐旱性

取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子(wt)、擬南芥anac018突變體的種子(m)、t3代純合轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的種子(t)和t3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子，分別作為待測種子，進行如下操作：

試驗組：在ms培養(yǎng)基上播種待測種子并培養(yǎng)2周，然后將幼苗移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)4周(前2周正常管理，后2周連續(xù)不澆水)，然后拍照并統(tǒng)計存活率；

對照組：在ms培養(yǎng)基上播種待測種子并培養(yǎng)2周，然后將幼苗移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)4周(4周均正常管理)，然后拍照并統(tǒng)計存活率；

培養(yǎng)條件：光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為300-400μmolm^-2s^-1；光照條件下的溫度為22-24℃，相對濕度為70-90％；黑暗條件下的溫度為18-20℃，相對濕度大于90％。

試驗重復(fù)3次，每次每個株系100粒種子，結(jié)果取平均值。

照片見圖6，上圖為對照組的照片，下圖為試驗組的照片。

存活率結(jié)果見圖7。

結(jié)果表明：干旱處理后，轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的幼苗的成活率顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、擬南芥anac018突變體和轉(zhuǎn)空載體擬南芥；干旱處理后，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的存活率與轉(zhuǎn)空載體擬南芥沒有顯著差異。

2、莢果及葉片衰老實驗

(1)莢果衰老實驗

取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子(wt)、擬南芥anac018突變體的種子(m)、t3代純合轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的種子(t)和t3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子，分別作為待測種子，進行如下操作：

在ms培養(yǎng)基上播種待測種子并培養(yǎng)兩周，然后將幼苗移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)50天，然后拍照、檢測莢果中葉綠素a/b及葉綠素的含量；

培養(yǎng)條件：光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為300-400μmolm^-2s^-1；光照條件下的溫度為22-24℃，相對濕度為70-90％；黑暗條件下的溫度為18-20℃，相對濕度大于90％。

試驗重復(fù)3次，每次每個株系100粒種子，結(jié)果取平均值。

照片見圖8。

葉綠素a/b及葉綠素的含量見圖9。

結(jié)果表明：轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的莢果中葉綠素a/b及葉綠素的含量均顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、擬南芥anac018突變體和轉(zhuǎn)空載體擬南芥；哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的莢果中葉綠素a/b及葉綠素的含量與轉(zhuǎn)空載體擬南芥沒有顯著差異。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的莢果衰老程度顯著低于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、擬南芥anac018突變體和轉(zhuǎn)空載體擬南芥。

(2)葉片衰老實驗

取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的種子(wt)、擬南芥anac018突變體的種子(m)、t3代純合轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的種子(t)和t3代轉(zhuǎn)空載體擬南芥的種子，分別作為待測種子，進行如下操作：

在ms培養(yǎng)基上播種待測種子并培養(yǎng)兩周，然后將幼苗移至培養(yǎng)基質(zhì)中培養(yǎng)7天，然后取離體葉片，在3μmaba水溶液中培養(yǎng)3天，然后拍照并檢測葉片中葉綠素a/b及葉綠素的含量；

培養(yǎng)條件：光周期為16小時光照，8小時黑暗；光強為300-400μmolm^-2s^-1；光照條件下的溫度為22-24℃，相對濕度為70-90％；黑暗條件下的溫度為18-20℃，相對濕度大于90％。

試驗重復(fù)3次，每次每個株系100粒種子，結(jié)果取平均值。

照片見圖10。

葉綠素a/b及葉綠素含量見圖11。

結(jié)果表明：轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的葉片中葉綠素a/b及葉綠素的含量均顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、擬南芥anac018突變體和轉(zhuǎn)空載體擬南芥；哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的葉片中葉綠素a/b及葉綠素的含量與轉(zhuǎn)空載體擬南芥沒有顯著差異。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)atnaco18基因擬南芥的葉片衰老程度顯著低于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、擬南芥anac018突變體和轉(zhuǎn)空載體擬南芥。