本發(fā)明涉及生物技術(shù)和資源利用與可持續(xù)發(fā)展領(lǐng)域，具體涉及一種具生物活性的霍亂毒素b亞基蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

霍亂弧菌(vibriocholerae)引起一種烈性腸道傳染病，表現(xiàn)為腹瀉脫水、休克甚至死亡，屬于國(guó)際檢疫傳染病。世界衛(wèi)生組織2016年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，全球每年爆發(fā)130～400萬(wàn)起霍亂病例，每年因?yàn)榛魜y造成2.1～14.3萬(wàn)人死亡?；魜y嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，而霍亂毒素(choleratoxin，ct)是霍亂弧菌分泌的一種具有adp-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的毒素，是引起腹瀉的主要因素。ct是一種典型的ab5結(jié)構(gòu)的毒素，5個(gè)b亞基非共價(jià)結(jié)合成非常緊湊穩(wěn)定的圓桶狀五聚體；a亞基(cta)呈球形，由cta1和cta2兩部分組成，cta1與cta2由肽鍵和二硫鍵相連，cta2肽插入ctb五聚體的桶狀中心，并與b5非共價(jià)緊密結(jié)合，形成支架將a1與b5連在一起。ct通過(guò)ctb與腸道上皮細(xì)胞膜gm1受體(單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂)結(jié)合后，內(nèi)吞經(jīng)脂質(zhì)筏運(yùn)輸?shù)竭_(dá)高爾基體(orlandiandfishman,1998；wolfetal.,1998)，再到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，霍亂毒素與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的一些宿主蛋白相互作用，使a亞基的a1部分和毒素其它部分分離，并且被去折疊，形成無(wú)結(jié)構(gòu)的多肽鏈，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，重新形成有結(jié)構(gòu)的具有酶活性的蛋白(tsaietal.,2001；tsaiandrapoport,2002；fujinagaetal.,2003)。

由于霍亂毒素b亞基(ctb)是霍亂毒素?zé)o毒性細(xì)胞結(jié)合部位，易于與細(xì)胞膜表面gm1受體結(jié)合(merrittetal.,1994)而進(jìn)入細(xì)胞的特性，且神經(jīng)組織中g(shù)m1含量較為豐富，因此ctb常作為一種經(jīng)典神經(jīng)環(huán)路示蹤分子載體且具有高靈敏度，與特定探針連接后，即可作為一種示蹤劑。在神經(jīng)磁共振成像(mri)中，已經(jīng)有研究ctb與dota-gd共價(jià)連接后作為造影劑，具有特異性，信號(hào)增強(qiáng)，并且可穩(wěn)定存在一周以上(wu,c.w.-h.,etal.2011.)。更重要的是，ctb可作為配體與不同物質(zhì)結(jié)合制備新型神經(jīng)示蹤劑，這些研究都顯示ctb在神經(jīng)解剖學(xué)示蹤劑的發(fā)展中的廣泛應(yīng)用價(jià)值。

大量研究結(jié)果表明，霍亂毒素b亞基(ctb)不具有毒性，但仍有很強(qiáng)的免疫原性，口服后能產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)，現(xiàn)在已被用于開(kāi)發(fā)作為霍亂弧菌的保護(hù)性疫苗。同時(shí)ctb也具有較強(qiáng)的免疫佐劑活性，可以作為抗原輸送載體使用，抗原分子與ctb融合后與腸相關(guān)淋巴組織細(xì)胞表面的gm1具有很強(qiáng)的親和力，有利于抗原的傳遞和免疫識(shí)別。對(duì)于一些通過(guò)吸附粘膜侵入機(jī)體的病原體，通過(guò)粘膜途徑給藥的疫苗比皮下注射疫苗更具有優(yōu)勢(shì)，因此粘膜佐劑的研究對(duì)于開(kāi)發(fā)口服、鼻飼等通過(guò)粘膜給藥的疫苗具有重要意義。

另外，已有研究證實(shí)霍亂毒素能在體外誘導(dǎo)大鼠和人的腦癌細(xì)胞分化為正常細(xì)胞(li,y.,etal.2007.)，對(duì)引起惡性高血壓的腎上腺髓質(zhì)瘤細(xì)胞也有逆轉(zhuǎn)作用，該研究意味著霍亂毒素在特定癌癥治療方面有了新的應(yīng)用價(jià)值。

天然霍亂毒素來(lái)源于霍亂弧菌，由于霍亂弧菌的高傳染性，對(duì)于普通生化實(shí)驗(yàn)室無(wú)法直接通過(guò)大量培養(yǎng)霍亂弧菌提取天然霍亂毒素，而商業(yè)化的霍亂毒素價(jià)格昂貴，純度有限，且通常只是非標(biāo)記樣品，無(wú)法充分滿足實(shí)驗(yàn)室研究及各種標(biāo)記方法發(fā)展需要，也難以對(duì)毒素進(jìn)行改造以擴(kuò)展其應(yīng)用，特別是神經(jīng)環(huán)路的示蹤。因此原核重組高效表達(dá)具有生物活性的霍亂毒素顯得十分必要。雖然文獻(xiàn)中也有多次報(bào)道ctb體外表達(dá)，包括原核，真核表達(dá)，但表達(dá)量并不高，所得到的蛋白是否具有生物活性也并不清楚。

本發(fā)明就是利用原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中大量表達(dá)霍亂毒素亞基，然后在體外進(jìn)行高效復(fù)性，得到大量具有生物活性的霍亂毒素b亞基，普通實(shí)驗(yàn)室均可操作，無(wú)污染。最重要的優(yōu)點(diǎn)是，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，進(jìn)行各種熒光，同位素，示蹤劑標(biāo)記。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具生物活性的霍亂毒素b亞基蛋白的制備方法，按照常規(guī)原核表達(dá)方式獲得的ctb蛋白包涵體，均可使用本發(fā)明提供的方法以獲得功能蛋白，蛋白復(fù)性效率高，并具有生物活性。該方法簡(jiǎn)單，操作方便，安全可靠。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種具生物活性的霍亂毒素b亞基蛋白的制備方法，包括下述步驟：

將純化后的霍亂毒素b亞基蛋白包涵體依次進(jìn)行下述處理：

1)含有4m尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,4murea，ph8.5)透析12-24小時(shí)；

2)含有2m尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,2murea，ph8.5)透析12-24小時(shí)；

3)含有1m尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,1murea，ph8.5)透析12-24小時(shí)；

4)不含尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,ph8.5)透析10-24小時(shí)，并繼續(xù)透析2-3遍，即得具備活性的霍亂毒素b亞基蛋白；

以上所述透析過(guò)程中所用透析袋的規(guī)格為10kd。

以上所述方案中，優(yōu)選的：

將純化后的霍亂毒素b亞基蛋白包涵體依次進(jìn)行下述處理：

1)含有4m尿素緩沖液透析24小時(shí)；

2)含有2m尿素緩沖液透析24小時(shí)；

3)含有1m尿素緩沖液透析24小時(shí)；

4)不含尿素緩沖液透析24小時(shí)；

5)不含尿素緩沖液透析10小時(shí)；

6)不含尿素緩沖液透析10小時(shí)，即得具備活性的霍亂毒素b亞基蛋白。

以上所述方案中，優(yōu)選的，所述的純化的霍亂毒素b亞基蛋白包涵體的濃度為0.2mg/ml。以上所述方案中，優(yōu)選的，純化的霍亂毒素b亞基蛋白包涵體的制備方法包括：

1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建：將seqidno.1所示核苷酸序列克隆到pet28a-oh載體上，得到ctb-pet28a-oh表達(dá)載體；

pet28a-oh載體是通過(guò)pcr刪掉pet-28a(+)的n端his-tag以后至bamhi以前的序列得到。

2.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化：將ctb-pet28a-oh表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)中。

3.單克隆活化：挑取含有ctb-pet28a-oh表達(dá)載體的單克隆，在5ml含有卡納抗性的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)進(jìn)行活化。

4.放大培養(yǎng)：將活化12小時(shí)的菌液轉(zhuǎn)入1l含有50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm繼續(xù)振蕩放大培養(yǎng)。

5.誘導(dǎo)表達(dá)：放大培養(yǎng)4小時(shí)，菌液od600為0.8，加入終濃度為1.0mm的iptg，37℃，220rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。

6.細(xì)菌收集：6000rpm，離心10min，收集細(xì)菌。

7.超聲波破碎細(xì)菌：收集的細(xì)菌用50ml裂解緩沖液(100mmtris,500mmnacl,0.1％tritonx-100,5mmedta,ph8.0)懸浮，冰水中超聲(6#變幅桿、25w、3son/6soff)破碎細(xì)菌。

8.包涵體收集：超聲后破碎的細(xì)菌，12000g，離心20min，去掉上清，留包涵體。

9.包涵體清洗：包涵體用50ml清洗緩沖液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巰基乙醇，2murea,ph8.5)懸浮，并使用研磨器充分研磨包涵體10min混勻，然后12000g，離心20min，去上清，得包涵體。包涵體再按照本步驟重復(fù)清洗3遍。

10.包涵體溶解：清洗后的包涵體用100ml溶解緩沖液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巰基乙醇,6m鹽酸胍,ph8.5)溶解，并在4℃，200rpm持續(xù)攪拌20小時(shí)，使包涵體充分溶解。

11.包涵體的親和純化：使用鎳柱親和純化，結(jié)合緩沖液的配方為：50mmtris,500mmnacl,20mm咪唑,8murea,ph8.5,平衡10個(gè)柱長(zhǎng)；鹽酸胍溶解的包涵體離心20000rpm，30min，上清與鎳柱親和(2ml/min)，再使用洗脫緩沖液(50mmtris,500mmnacl,250mm咪唑,8murea,ph8.5)將蛋白洗脫下來(lái)，洗脫速度是2ml/min，既得純度≥95％以上的ctb包涵體。

本與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和顯著的效果：

蛋白表達(dá)量高，包涵體處理后純度高，有生物活性，復(fù)性效率大大提升，操作方便，設(shè)備簡(jiǎn)單，安全可靠，適用于大量制備樣品標(biāo)準(zhǔn)品。

附圖說(shuō)明

圖1為¹⁹fnmr觀測(cè)ctb包涵體復(fù)性過(guò)程。

圖2為sds-page觀測(cè)ctb包涵體復(fù)性過(guò)程。

圖3為ctb-fitc侵染t84細(xì)胞的熒光實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證ctb活性示意圖；

其中圖3中a、b和c:fitc-ctb(表達(dá)復(fù)性)；圖3中d、e和f:fitc-ctb(sigma公司購(gòu)買(mǎi))；圖3中g(shù)、h和i:fitc(空白對(duì)照)

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)；所述試劑或材料，如未特別說(shuō)明，均來(lái)源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1:

一種具生物活性的霍亂毒素b亞基蛋白的制備方法，包括下述步驟：

1.原核表達(dá)載體的構(gòu)建：將ctb基因(seqidno.1所示核苷酸序列，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為seqidno.2所示)克隆到pet28a-oh載體上(酶切位點(diǎn)bamhi和xhoi)，得到

ctb-pet28a-oh表達(dá)載體。

pet28a-oh載體是通過(guò)pet-28a(+)載體改造得到，具體是通過(guò)pcr刪掉pet-28a(+)的n端his-tag以后至bamhi以前的序列，這樣改造可以使克隆后的ctb-pet28a-oh表達(dá)載體n端只有his-tag，提高ctb的表達(dá)量同時(shí)，減少后期酶切程序。

2.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化：將ctb-pet28a-oh表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)中。

3.單克隆活化：挑取含有ctb-pet28a-oh表達(dá)載體的單克隆，在5ml含有卡納抗性的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)進(jìn)行活化。

4.放大培養(yǎng)：將活化12小時(shí)的菌液轉(zhuǎn)入1l含有卡那霉素(50mg/l)的lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm繼續(xù)振蕩放大培養(yǎng)。

5.誘導(dǎo)表達(dá)：放大培養(yǎng)4小時(shí)，菌液od600為0.8，加入終濃度為1.0mm的iptg，37℃，220rpm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。

6.細(xì)菌收集：6000rpm，離心10min，收集細(xì)菌。

7.超聲波破碎細(xì)菌：收集的細(xì)菌用50ml裂解緩沖液(100mmtris,500mmnacl,0.1％tritonx-100,5mmedta,ph8.0)懸浮，冰水中超聲(6#變幅桿、25w、3son/6soff)破碎細(xì)菌。

8.包涵體收集：超聲后破碎的細(xì)菌，12000g，離心20min，去掉上清，留包涵體。

9.包涵體清洗：包涵體用50ml清洗緩沖液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巰基乙醇，2murea,ph8.5)懸浮，并使用研磨器充分研磨包涵體10min混勻，然后12000g，離心20min，去上清，得包涵體。包涵體再按照本步驟重復(fù)清洗3遍。

10.包涵體溶解：清洗后的包涵體用100ml溶解緩沖液(50mmtris,500mmnacl,10mmβ-巰基乙醇,6m鹽酸胍,ph8.5)溶解，并在4℃，200rpm持續(xù)攪拌20小時(shí)，使包涵體充分溶解。

11.包涵體的親和純化：使用鎳柱親和純化，結(jié)合緩沖液的配方為：50mmtris,500mmnacl,20mm咪唑,8murea,ph8.5,平衡10個(gè)柱長(zhǎng)；鹽酸胍溶解的包涵體離心20000rpm，30min，上清與鎳柱親和(2ml/min)，再使用洗脫緩沖液(50mmtris,500mmnacl,250mm咪唑,8murea,ph8.5)將蛋白洗脫下來(lái)，洗脫速度是2ml/min。此時(shí)能得到純度≥95％以上的ctb包涵體，1llb菌液(od600為0.8)可得到ctb包涵體50mg。

12.包涵體復(fù)性:親和純化的包涵體用洗脫緩沖液稀釋至濃度為0.2mg/ml，裝入10kd透析袋按照下述順序依次進(jìn)行梯度透析：

a：含有4m尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,5mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,4murea，ph8.5)透析24小時(shí)；

b：含有2m尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,2mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,2murea，ph8.5)透析24小時(shí)；

c：含有1m尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,5％glycerol,1％glycine,1mmedta,0.1mmgssg,1mmgsh,1murea，ph8.5)透析24小時(shí)；

d：不含尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,2.5％glycerol,0.5％glycine,0.1mmgssg,0.1mmgsh,ph8.5)透析24小時(shí)；

e：不含尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,ph8.5)透析10小時(shí)；

f：不含尿素緩沖液(20mmtris,100mmnacl,ph8.5)透析10小時(shí)；

13.復(fù)性結(jié)束的蛋白收集濃縮：透析結(jié)束后，收集所有透析袋里的樣品，20000g,，30min離心，取上清，即為正確復(fù)性的霍亂毒素b亞基復(fù)合物。

14.蛋白濃縮：用30kd蛋白濃縮管，4000rpm離心濃縮蛋白，置于冷凍干燥機(jī)，得到霍亂毒素b亞基蛋白粉末，用于實(shí)施例2。

通過(guò)以上方法，1llb菌液(od600為0.8)可以得到40mg霍亂毒素b亞基蛋白。根據(jù)最終得到的有生物活性的蛋白的量，可得計(jì)算出，按照本發(fā)明提供的方法，霍亂毒素b亞基蛋白復(fù)性率為80％。

實(shí)施例2:

霍亂毒素b亞基蛋白的活性檢測(cè)：

1.在霍亂毒素b亞基表達(dá)過(guò)程中，在培養(yǎng)基中，加入5-氟-色氨酸標(biāo)記ctb的第88位色氨酸，目的是用¹⁹fnmr直接觀測(cè)包涵體復(fù)性過(guò)程，在復(fù)性過(guò)程中，每次更換緩沖液時(shí)，取450ul透析袋中樣品加入50uld2o，混勻，裝入5mm核磁管中，在600mhz核磁譜儀上采氟譜，根據(jù)¹⁹f的峰可以清晰觀測(cè)變性-中間體-復(fù)性過(guò)程(圖1)。同時(shí)將每一次采譜的樣品取10ul跑sds-page，也可以清楚的看到ctb復(fù)性后五聚體的出現(xiàn)(圖2)。

2.復(fù)性后的霍亂毒素b亞基，為了檢測(cè)其生物活性，我們用異硫氰酸熒光素(fitc)對(duì)蛋白進(jìn)行標(biāo)記，得到具有熒光的fitc-ctb，然后取1mgfitc-ctb樣品用1mlpbs溶解后孵育人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞，孵育3h，然后用pbs清洗細(xì)胞，清洗3遍，確保去掉背景信號(hào)。然后使用熒光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞里存在大量熒光(圖3中a、b和c)。按照同樣的方法，我們用sigma公司購(gòu)買(mǎi)的fitc-ctb做正對(duì)照，看到同樣的結(jié)果(圖3中d、e和f)；用fitc試劑做負(fù)對(duì)照，細(xì)胞里并未觀察到熒光(圖3中g(shù)、h和i)，說(shuō)明fitc是無(wú)法自主進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的。以上實(shí)驗(yàn)可說(shuō)明實(shí)施例1制備的霍亂毒素b亞基蛋白可以自主進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，具有生物活性。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所

<120>一種具生物活性的霍亂毒素b亞基蛋白的制備方法

<130>一種具生物活性的霍亂毒素b亞基蛋白的制備方法

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>312

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

acacctcaaaatattactgatttgtgtgcagaataccacaacacacaaatacatacgcta60

aatgataagatattttcgtatacagaatctctagctggaaaaagagagatggctatcatt120

acttttaagaatggtgcaacttttcaagtagaagtaccaggtagtcaacatatagattca180

caaaaaaaagcgattgaaaggatgaaggataccctgaggattgcatatcttactgaagct240

aaagtcgaaaagttatgtgtatggaataataaaacgcctcatgcgattgccgcaattagt300

atggcaaattaa312

<210>2

<211>103

<212>prt

<213>人工序列

<400>2

thrproglnasnilethraspleucysalaglutyrhisasnthrgln

151015

ilehisthrleuasnasplysilephesertyrthrgluserleuala

202530

glylysargglumetalaileilethrphelysasnglyalathrphe

354045

glnvalgluvalproglyserglnhisileaspserglnlyslysala

505560

ilegluargmetlysaspthrleuargilealatyrleuthrgluala

65707580

lysvalglulysleucysvaltrpasnasnlysthrprohisalaile

859095

alaalailesermetalaasn

100