本發(fā)明法涉及一種牛跟腱膠原蛋白的提取方法。
背景技術(shù)：
目前膠原蛋白主要從豬皮、牛皮、魚皮及動(dòng)物骨骼中提取。動(dòng)物皮膚來源的膠原蛋白受污染幾率高，動(dòng)物骨骼來源膠原蛋白提取率低?，F(xiàn)有提取體系：有機(jī)酸溶液體系、胃蛋白酶-酸溶液體系和中性鹽溶液體系，其中胃蛋白酶-酸溶液體系獲取率最高。常見的提純方式只是簡(jiǎn)單的利用一步柱層析進(jìn)行，此方法存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、分離效率低、產(chǎn)物純度不高等缺點(diǎn)。長(zhǎng)的分離周期和低的分離效率不僅增加了膠原蛋白的生產(chǎn)成本，而且使很多資源無法得到有效的利用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明法的目的是提供一種牛跟腱膠原蛋白的提取方法，可以從牦牛跟腱中分離純化i型膠原蛋白，該方法具有高效性、高選擇性和易放大性。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明法采用如下技術(shù)方案：
一種牛跟腱膠原蛋白的提取方法，包括如下步驟：
a、前處理：新鮮牛跟腱去除軟組織、剔除筋膜、脂肪后，粉碎機(jī)粉碎至0.2～0.5mm大小組織塊，后經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%nacl溶液浸泡5min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%nahco3溶液浸泡30min，去掉血清等成份，消毒，以后操作全部在無菌操作下完成；將用蒸餾水洗滌后的組織小塊放入氯仿與乙醇體積比為2:1的溶液對(duì)其進(jìn)行脫脂，脫脂2-6h，雙蒸水洗滌3次；用含4.5mol/lnacl的0.05mol/ltris-hcl緩沖液（ph7.5）充分洗滌12-36h，以去除脂質(zhì)及血清等成分，低溫離心；
b、抽提：將沉淀加入1l含胃蛋白酶500mg的0.5mol/l冰醋酸，攪拌并維持在低溫，提取72h，每10000g離心10min，去除沉淀；
c、沉淀：在上清液中加入0.5mol/l冰醋酸，使溶液ph為2.5～3.0，通常每升提取液中加入30ml的冰醋酸，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，離心后棄沉淀；
d、鹽析：在上清液中加入nacl至4.4mol/l，攪拌過夜，低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐級(jí)用2.4mol/l、1.7mol/l及1.0mol/l的nacl溶液反復(fù)鹽析酸溶，最后得到的上清液即為膠原粗提液；
e、將膠原粗提液冷凍干燥得到膠原粗提物凍干品，于低溫下保存
f、高效液相色譜純化：將膠原凍干品用超純水溶解，經(jīng)濾膜過濾，取濾液上樣進(jìn)行色譜分離。
進(jìn)一步的，所述步驟a中低溫離心條件為8000r/min，30min，4℃。
進(jìn)一步的，所述步驟f中色譜條件為：zorbax300sb-c18半制備色譜柱，9.4mm×25cm，流動(dòng)相：a為水（85%），b為甲醇（15%）；采用線形梯度洗脫；流速：1ml.min-1；進(jìn)樣量：500ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：室溫，收集主峰，用于理化性質(zhì)鑒定。
進(jìn)一步的，所述步驟f中濾膜為0.45um濾膜。
進(jìn)一步的，所述步驟a中脫脂時(shí)間為4h。
進(jìn)一步的，所述步驟a中用含4.5mol/lnacl的0.05mol/ltris-hcl緩沖液（ph7.5）充分洗滌時(shí)間為24h。
進(jìn)一步的，所述步驟b中攪拌并維持的低溫溫度為4℃。
進(jìn)一步的，所述胃蛋白酶1mg含2500個(gè)活性單位。
進(jìn)一步的，所述緩沖液的制備方法為：將6.06重量份的tris溶解在40重量份的ddh2o中，用4mol/lhcl調(diào)節(jié)ph至7.5，再加10重量份ddh2o，4℃保存。
本發(fā)明還提供了一種牛跟腱膠原蛋白海綿，其制備方法包括如下步驟：
（1）將步驟f中高效液相色譜純化后的膠原戴白攪拌均勻，離心除去氣泡，調(diào)節(jié)ph值至6，稀釋，以1g耗牛跟腱制成50-70ml的膠原蛋白脹液為準(zhǔn)；
（2）將膠原蛋白脹液倒入模具中，-50℃下預(yù)凍24h，經(jīng)-30℃至-50℃冷凍干燥24h得膠原蛋白海綿；
（3）將膠原蛋白海綿60co輻射消毒，封裝，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
優(yōu)選的，步驟（1）中1g耗牛跟腱制成60ml的膠原蛋白脹液；步驟（2）中，經(jīng)-40℃冷凍干燥24h得膠原蛋白海綿。
該膠原蛋白海綿是一種可吸收的外科止血、堵漏的輔料，使用安全方便可靠。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益技術(shù)效果：
牛跟腱來源的膠原較皮膚來源的膠原不容易污染，更清潔，且提取率更高；膠原分子的主體部分是桿狀三螺旋結(jié)構(gòu)，能高度耐受胃蛋白酶的作用，但分子兩端的球蛋白結(jié)構(gòu)能被胃蛋白酶選擇性水解。在ph值為2.5～3.0時(shí)，胃蛋白酶能順利地將末端肽從完整的膠原主體分子上切割下來，這樣交聯(lián)的膠原巨型分子結(jié)構(gòu)受到破壞，近似完整的膠原分子便能夠從膠原纖維中分離出來而被提取，所以酶解法提取膠原的得率最高；運(yùn)用高效液相色譜分離純化i型膠原蛋白的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見的，它有著比普通柱層析更高的柱效，靈敏度高，分離條件溫和，在分離檢測(cè)過程中一般沒有樣品損壞，易于樣品回收，而且操作自動(dòng)化；利用酶解和高效液相色譜制備相結(jié)合的方法可以從牦牛跟腱中分離純化i型膠原蛋白，該方法具有高效性，高選擇性和易放大性。
具體實(shí)施方式
一種牛跟腱膠原蛋白的提取方法，包括如下步驟：
1、前處理：新鮮牛跟腱去除軟組織、剔除筋膜、脂肪后稱取100g，粉碎機(jī)粉碎至0.2～0.5mm大小組織塊，后經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%nacl浸泡5min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%nahco3浸泡30min，去血清等成份，消毒，以后操作全部在無菌操作下完成。將用蒸餾水洗滌后的組織小塊放入氯仿/乙醇（2:1）溶液對(duì)其進(jìn)行脫脂，脫脂4h，雙蒸水洗滌3次。用含4.5mol/lnacl的0.05mol/ltris-hcl緩沖液（ph7.5）充分洗滌24h，以去除脂質(zhì)及血清等成分，低溫離心（8000r/min，30min，4℃）；緩沖液制備方法：將6.06gtris溶解在40ml的ddh2o中，用4mol/lhcl調(diào)節(jié)ph至7.5，再加ddh2o的總量至50ml（即再加入10mlddh2o），4℃保存。
2、抽提：將沉淀加入1l含胃蛋白酶500mg的0.5mol/l冰醋酸，攪拌并維持在4℃，提取72h，每10000g離心10min，去除沉淀；
3、沉淀：在上清液中加入0.5mol/l冰醋酸，使溶液ph為2.5～3.0，通常每升提取液中加入30ml的冰醋酸，用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢?，離心后棄沉淀；
4、鹽析：在上清液中加入nacl至4.4mol/l，攪拌過夜，低溫離心，將沉淀溶于0.5mol/l冰醋酸中，再逐級(jí)用2.4mol/l，1.7mol/l及1.0mol/l的nacl反復(fù)鹽析、酸溶。最后得到的上清液即為膠原粗提液；
5、將膠原粗提液冷凍干燥得到膠原粗提物凍干品，于低溫下保存；
6、高效液相色譜純化：將膠原凍干品用超純水溶解，經(jīng)0.45um濾膜過濾，取濾液上樣進(jìn)行色譜分離；色譜條件：zorbax300sb-c18半制備色譜柱（9.4mm×25cm），流動(dòng)相：a為水（85%），b為甲醇（15%）；采用線形梯度洗脫；流速：1ml.min-1；進(jìn)樣量：500ul；檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm；柱溫：室溫，收集主峰，用于理化性質(zhì)鑒定。
本發(fā)明還提供了一種牛跟腱膠原蛋白海綿，其制備方法包括如下步驟：
（1）將步驟f中高效液相色譜純化后的膠原戴白攪拌均勻，離心除去氣泡，用0.05mol/naoh溶液調(diào)節(jié)ph值至6，用超純水稀釋，以1g耗牛跟腱制成60ml的膠原蛋白脹液為準(zhǔn)；
（2）將膠原蛋白脹液倒入模具中，-50℃下預(yù)凍24h，經(jīng)-40℃冷凍干燥24h得膠原蛋白海綿；
（3）將膠原蛋白海綿60co輻射消毒，封裝，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
該膠原蛋白海綿是一種可吸收的外科止血、堵漏的輔料，使用安全方便可靠。
以上所述的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明法的優(yōu)選方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明法的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明法設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明法的技術(shù)方案做出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。