本發(fā)明涉及植物細胞培養(yǎng)
技術領域：
，進一步涉及植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)過程中次級代謝產(chǎn)物的誘導表達，具體涉及一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法。
背景技術：
：植物細胞培養(yǎng)技術是以離體植物細胞或原生質(zhì)體為對象，以細胞量擴增和目標代謝產(chǎn)物累積為目的的培養(yǎng)工藝。對于以獲得特定代謝產(chǎn)物為目的的細胞培養(yǎng)而言，其主要工藝環(huán)節(jié)不僅在于細胞量的擴增，同時，目標代謝產(chǎn)物的誘導合成對培養(yǎng)效益更為重要。在植物細胞的培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)條件和營養(yǎng)條件是影響產(chǎn)量的最重要因素，其中培養(yǎng)條件是指溫度、溶氧、光照、pH等環(huán)境條件的控制，而營養(yǎng)條件主要指植物細胞的培養(yǎng)基。天山雪蓮又名雪蓮、天山總苞雪蓮，為菊科鳳毛菊屬植物，是我國高山地區(qū)的一種稀有名貴的中藥材，含黃酮、生物堿、多糖等多種有效成分，具有活血通經(jīng)，散寒除濕，強筋壯陽等功效，多用于風濕性關節(jié)炎、經(jīng)血不調(diào)、陽痿、跌打損傷的治療。但雪蓮生長環(huán)境特異，生長周期長，人類長期的盲目采挖，已使雪蓮的自然資源近于枯竭，通過懸浮培養(yǎng)來生產(chǎn)雪蓮的有效成分，既可保護野生資源，又可以滿足日益增長的中藥需求。然而雪蓮細胞培養(yǎng)條件苛刻，對營養(yǎng)要求高，現(xiàn)有技術的離體懸浮培養(yǎng)技術盡管取得了一定的進展但目標產(chǎn)物雪蓮黃酮的產(chǎn)量始終處于較低水平。在雪蓮細胞培養(yǎng)的研究中，如何提高培養(yǎng)物中的主要有效藥用成分黃酮的含量和質(zhì)量，擴大培養(yǎng)規(guī)模，最終實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，是這一領域的研究重點。國內(nèi)外研究者在雪蓮愈傷組織培養(yǎng)、細胞懸浮培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)等方面做了大量工作，然而目前雪蓮細胞的培養(yǎng)效果以及總黃酮的產(chǎn)量仍有待提升。天山雪蓮難以人工種植，資源受到迫害，供不應求；植物細胞培養(yǎng)方面細胞株不穩(wěn)定，次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低，大規(guī)模生產(chǎn)難。目前在天山雪蓮大規(guī)模技術培養(yǎng)方面報道較少，只涉及到10L左右的反應器，且無兩階段培養(yǎng)技術在雪蓮細胞生產(chǎn)黃酮方面的應用，調(diào)控技術應用少等，致使現(xiàn)在缺少一種穩(wěn)定高產(chǎn)且快速的大規(guī)模培養(yǎng)天山雪蓮細胞的調(diào)控工藝。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，以解決現(xiàn)有技術的天山雪蓮細胞培養(yǎng)方法所得的黃酮產(chǎn)量較低的技術問題。本發(fā)明要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術的天山雪蓮細胞培養(yǎng)方法難以規(guī)模化放大。為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，包括以下步驟：1)取天山雪蓮細胞接種于液體生長培養(yǎng)基中，以溫度20～25℃，每天光照14～18h、黑暗6～10h，光照強度1000～3000lux的條件培養(yǎng)，每7～10天傳代一次，直至培養(yǎng)液中細胞鮮重達初始細胞接種量3～5倍；2)取步驟1)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重30-80g/L的接種量接種于液體生長培養(yǎng)基中，以溫度20～25℃，100～130rpm的轉速搖床培養(yǎng)5～8天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重150～400g/L的接種量接種于液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度2000～3000lux，100～130rpm的轉速搖床培養(yǎng)1～4天；3)取步驟2)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重50～100g/L的接種量接種于液體生長培養(yǎng)基中，以0.01～1m3/h的通氣速率培養(yǎng)5～8天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重150～300g/L的接種量接種于液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度2000～3000lux，0.01～1m3/h的通氣速率培養(yǎng)1～4天；其中所述生長培養(yǎng)基是含有0.4～0.6mg/L植物激素6-BA、0.8～1.2mg/L植物激素NAA、20～40g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基；所述生產(chǎn)培養(yǎng)基是含有0.4～0.6mg/L植物激素6-BA、0.8～1.2mg/L植物激素NAA、0.1～100μmol/l苯丙氨酸、0.5～10μmol/l冠菌素、15～25g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，步驟1)中用于接種的天山雪蓮細胞是通過以下方法獲得的：取天然雪蓮試管苗進行外植體誘導，獲得愈傷組織，對固體細胞利用Ser137γ射線、uv-B誘變，而后0-8℃處理，再利用含蔗糖50-100g/L的MS固體培養(yǎng)基，以溫度20～25℃，每天光照14～18h、黑暗6～10h，光照強度1000～3000lux的條件反復培養(yǎng)，篩選獲得天然雪蓮細胞系。作為優(yōu)選，步驟1)中所述反復培養(yǎng)的過程中，每兩周繼代一次。作為優(yōu)選，步驟1)中用于接種的天山雪蓮細胞，其黃酮產(chǎn)量不低于細胞總干重的7％。作為優(yōu)選，步驟2)所得產(chǎn)物中黃酮產(chǎn)量不低于細胞總干重的13％。作為優(yōu)選，步驟3)中利用生長培養(yǎng)基所進行的培養(yǎng)是在公開號為CN103224882A或CN204385208U的中國專利文獻所披露的生物反應器中進行的，培養(yǎng)過程中反應器的振頻為1～20次/min。作為優(yōu)選，步驟3)中利用生產(chǎn)培養(yǎng)基所進行的培養(yǎng)是在公開號為CN103224882A或CN204385208U的中國專利文獻所披露的生物反應器中進行的，培養(yǎng)過程中反應器的振頻為5-20次/min。作為優(yōu)選，步驟3)所得產(chǎn)物中黃酮產(chǎn)量不低于細胞總干重的11％。作為優(yōu)選，步驟2)中所述生長培養(yǎng)基盛裝于100mL三角瓶中；步驟2)中所述生產(chǎn)培養(yǎng)基盛裝于100mL三角瓶中。作為優(yōu)選，步驟2)中所述從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，是50～150目的篩網(wǎng)過濾除掉培養(yǎng)液得到的。作為優(yōu)選，步驟3)中對天山雪蓮細胞的培養(yǎng)是在20～2000L容積的生物反應器中進行的。本發(fā)明提供了一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，該技術方案通過培養(yǎng)方式和誘導物成分的改進顯著改善了細胞的黃酮產(chǎn)量，同時可適用于規(guī)模化的放大。具體來看，本發(fā)明首先以液體懸浮的方式對初始細胞株快速培養(yǎng)，每7～10天傳代一次，細胞鮮重的增長量在3～5倍；而后采用兩階段培養(yǎng)法：生長階段使細胞快速增殖，7～10天獲得最大細胞量，生產(chǎn)階段在一定的高密度接種量150～400g/l(鮮重)條件下，加入前體苯丙氨酸、誘導劑冠菌素，培養(yǎng)3-5天收獲細胞，黃酮含量提高至13％以上。本工藝采用新型誘導劑冠菌素，用量小，作用顯著，無毒副作用，能夠迅速提高雪蓮細胞的黃酮含量；本發(fā)明適用于20L以上的大規(guī)模生物反應器，已利用本公司的生物反應器在20L、100L、200L、1000L規(guī)模成功培養(yǎng)，且細胞狀態(tài)良好，產(chǎn)量穩(wěn)定，黃酮含量在11％以上。具體實施方式以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。實施例1(天山雪蓮細胞系的生長和生產(chǎn)動力學考察)配置經(jīng)激素篩選及優(yōu)化后的MS培養(yǎng)基，即生長培養(yǎng)基LG，含有0.5mg/l6-BA、1mg/lNAA、30g/l蔗糖，100ml三角搖瓶，裝液量為20ml，取一株培養(yǎng)至一個周期末的天山雪蓮細胞系(命名為SE-5)，以40g/l濃度(鮮重)接入上述三角搖瓶中，分別在培養(yǎng)0天、2天、4天、6天、8天、10天、12天、14天、16天、18天、20天檢測細胞的鮮重和黃酮產(chǎn)量，結果如表1所示。表1天山雪蓮細胞系SE-5在生長培養(yǎng)基LG中的生長動力學表現(xiàn)培養(yǎng)時間\考察項目細胞鮮重(g)黃酮產(chǎn)量(μg)0天402.12天45.72.44天72.53.66天110.85.98天159.57.810天165.28.212天140.16.814天100.65.216天68.33.518天65.82.420天53.21.8實施例2(天山雪蓮細胞兩階段調(diào)控工藝在小試搖瓶規(guī)模的實現(xiàn))分別配置生長培養(yǎng)基LG(含有0.5mg/l6-BA、1mg/lNAA、30g/l蔗糖)和生產(chǎn)培養(yǎng)基LP(含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、20g/l、100umol/l苯丙氨酸、5umol/l冠菌素、20g/l蔗糖)，接種60g/l(鮮重)的SE-5細胞于100ml三角搖瓶中，裝有20mlLG培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為23℃，搖床轉速為120rpm，培養(yǎng)10天；利用100目的篩網(wǎng)過濾除掉培養(yǎng)液，接種150/l(鮮重)細胞于100ml三角搖瓶中，裝有20mlLP生產(chǎn)培養(yǎng)基，24h全光照，光照強度為2000lux，轉速為130rpm，培養(yǎng)3天收獲細胞。結果：經(jīng)過生長培養(yǎng)階段的天山雪蓮細胞，鮮重翻倍量為5倍，生長量達到300g/l(鮮重)，同時啟動兩批次的生產(chǎn)培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后結束，收獲的雪蓮細胞的黃酮含量為13％。實施例3(天山雪蓮細胞兩階段調(diào)控工藝在中試1000L反應器規(guī)模的實現(xiàn))采用一次性生物反應器，裝有1000LLG生長培養(yǎng)基(包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、30g/l蔗糖)，振頻為5次/min，通空氣為0.3m3/h，接種量為50g/l,培養(yǎng)周期為7天；接種200g/l(鮮重)細胞于裝有1000lLP生產(chǎn)培養(yǎng)基(包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、100umol/l苯丙氨酸、5umol/l冠菌素、20g/l蔗糖)的一次性生物反應中，，24h全光照，光照強度為2000-3000lux，振頻7次/min，通空氣為0.6m3/h，培養(yǎng)5天收獲細胞。結果：經(jīng)過生長培養(yǎng)階段的天山雪蓮細胞，鮮重翻倍量為4倍，生長量達到200g/l(鮮重)，同時啟動-批次1000L反應器的生產(chǎn)培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后結束，收獲的雪蓮細胞的黃酮含量達到11％。實施例4一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，包括以下步驟：1、天山雪蓮細胞系篩選：采用天然雪蓮試管苗進行外植體誘導，獲得愈傷組織，對固體細胞進行Ser-137、uv-B誘變，低溫4℃處理，含高糖50-100g/l的MS培養(yǎng)基反復進行篩選，獲得一株天山雪蓮細胞系，命名為SE-5，培養(yǎng)條件為23℃，光周期為16h/8h,光照強度為1000-3000lux,每兩周繼代一次。2、液體懸浮天山雪蓮細胞系SE-5：挑選生長狀態(tài)良好，顏色鮮亮，質(zhì)地緊實的固體細胞放入含有0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、20-40g/l蔗糖的MS生長培養(yǎng)基LG中，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16h/8h,光照強度為1000-3000lux,每7-10天傳代一次，細胞鮮重翻倍量在3-5倍，黃酮含量在7％以上。3、小試調(diào)控工藝(液-液兩階段培養(yǎng)法)：生長階段是接種30-80g/l(鮮重)的SE-5細胞于100ml三角搖瓶中，裝有20mlLG生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為23℃，搖床轉速為100-130rpm，培養(yǎng)7-10天；生產(chǎn)階段是利用50-150目的篩網(wǎng)過濾除掉培養(yǎng)液，接種150-400/l(鮮重)細胞于100ml三角搖瓶中，裝有20mlLP生產(chǎn)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、0-100umol/l苯丙氨酸、0.5-10umol/l冠菌素、20g/l蔗糖，24h全光照，光照強度為2000-3000lux，轉速為100-130rpm，培養(yǎng)3-5天收獲細胞，此時雪蓮細胞的黃酮含量大于13％。4、大規(guī)模生物反應器調(diào)控工藝：采用本公司自主研發(fā)的一次性生物反應器反應器(見專利ZL201210021722.6和201420705851.1)，裝有20-1000LLG生長培養(yǎng)基，振頻為1-20次/min，通空氣0-1m3/h，接種量為50-100g/l,培養(yǎng)周期為7-10天，黃酮含量6％以上；接種150-300/l(鮮重)細胞于裝有20-1000LP生產(chǎn)培養(yǎng)基的一次性生物反應中，培養(yǎng)基中包含0.5mg/l6-BA、1.0mg/lNAA、100umol/l苯丙氨酸、0.5-10umol/l冠菌素、20g/l蔗糖，24h全光照，光照強度為2000-3000lux，振頻為5-20次/min，通空氣0-1m3/h，培養(yǎng)3-5天收獲細胞，此時雪蓮細胞的黃酮含量大于11％。實施例5一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，包括以下步驟：1)取天山雪蓮細胞接種于液體生長培養(yǎng)基中，以溫度20℃，每天光照14h、黑暗6h，光照強度1000lux的條件培養(yǎng)，每7天傳代一次，直至培養(yǎng)液中細胞鮮重達初始細胞接種量3倍；2)取步驟1)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重30g/L的接種量接種于15mL液體生長培養(yǎng)基中，以溫度20℃，100rpm的轉速搖床培養(yǎng)5天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重150g/L的接種量接種于15mL液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度2000lux，100rpm的轉速搖床培養(yǎng)1天；3)取步驟2)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重50g/L的接種量接種于20L液體生長培養(yǎng)基中，以0.01m3/h的通氣速率培養(yǎng)5天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重150g/L的接種量接種于20L液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度2000lux，0.01m3/h的通氣速率培養(yǎng)1天；其中所述生長培養(yǎng)基是含有0.4mg/L植物激素6-BA、0.8mg/L植物激素NAA、20g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基；所述生產(chǎn)培養(yǎng)基是含有0.4mg/L植物激素6-BA、0.8mg/L植物激素NAA、0.1μmol/l苯丙氨酸、0.5μmol/l冠菌素、15g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基。在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：步驟1)中用于接種的天山雪蓮細胞是通過以下方法獲得的：取天然雪蓮試管苗進行外植體誘導，獲得愈傷組織，對固體細胞利用Ser137γ射線、uv-B誘變，而后0℃處理，再利用含蔗糖50g/L的MS固體培養(yǎng)基，以溫度20℃，每天光照14h、黑暗6h，光照強度1000lux的條件反復培養(yǎng)，篩選獲得天然雪蓮細胞系。步驟1)中所述反復培養(yǎng)的過程中，每兩周繼代一次。步驟1)所得產(chǎn)物中黃酮產(chǎn)量為細胞總干重的7％。步驟2)中所述生長培養(yǎng)基盛裝于100mL三角瓶中；步驟2)中所述生產(chǎn)培養(yǎng)基盛裝于100mL三角瓶中。步驟2)中所述從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，是50目的篩網(wǎng)過濾除掉培養(yǎng)液得到的。步驟1)所得產(chǎn)物中黃酮產(chǎn)量為細胞總干重的13％。步驟3)中利用生長培養(yǎng)基所進行的培養(yǎng)是在公開號為CN103224882A的中國專利文獻所披露的生物反應器中進行的，培養(yǎng)過程中反應器的振頻為1次/min。步驟3)中利用生產(chǎn)培養(yǎng)基所進行的培養(yǎng)是在公開號為CN103224882A的中國專利文獻所披露的生物反應器中進行的，培養(yǎng)過程中反應器的振頻為5次/min。步驟3)所得產(chǎn)物中黃酮產(chǎn)量為細胞總干重的11％。實施例6一種規(guī)?；囵B(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，包括以下步驟：1)取天山雪蓮細胞接種于液體生長培養(yǎng)基中，以溫度25℃，每天光照18h、黑暗10h，光照強度3000lux的條件培養(yǎng)，每10天傳代一次，直至培養(yǎng)液中細胞鮮重達初始細胞接種量5倍；2)取步驟1)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重80g/L的接種量接種于25mL液體生長培養(yǎng)基中，以溫度25℃，130rpm的轉速搖床培養(yǎng)8天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重400g/L的接種量接種于25mL液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度3000lux，130rpm的轉速搖床培養(yǎng)4天；3)取步驟2)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重100g/L的接種量接種于1000L液體生長培養(yǎng)基中，以1m3/h的通氣速率培養(yǎng)8天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重300g/L的接種量接種于1000L液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度3000lux，1m3/h的通氣速率培養(yǎng)4天；其中所述生長培養(yǎng)基是含有0.6mg/L植物激素6-BA、1.2mg/L植物激素NAA、40g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基；所述生產(chǎn)培養(yǎng)基是含有0.6mg/L植物激素6-BA、1.2mg/L植物激素NAA、100μmol/l苯丙氨酸、10μmol/l冠菌素、25g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基。在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：步驟1)中用于接種的天山雪蓮細胞是通過以下方法獲得的：取天然雪蓮試管苗進行外植體誘導，獲得愈傷組織，對固體細胞利用Ser137γ射線、uv-B誘變，而后8℃處理，再利用含蔗糖100g/L的MS固體培養(yǎng)基，以溫度25℃，每天光照18h、黑暗10h，光照強度3000lux的條件反復培養(yǎng)，篩選獲得天然雪蓮細胞系。步驟2)中所述從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，是150目的篩網(wǎng)過濾除掉培養(yǎng)液得到的。步驟3)中利用生長培養(yǎng)基所進行的培養(yǎng)是在公開號為CN204385208U的中國專利文獻所披露的生物反應器中進行的，培養(yǎng)過程中反應器的振頻為20次/min。步驟3)中利用生產(chǎn)培養(yǎng)基所進行的培養(yǎng)是在公開號為CN204385208U的中國專利文獻所披露的生物反應器中進行的，培養(yǎng)過程中反應器的振頻為20次/min。實施例7一種規(guī)模化培養(yǎng)天山雪蓮細胞高產(chǎn)黃酮的調(diào)控方法，包括以下步驟：1)取天山雪蓮細胞接種于生長培養(yǎng)基中，以溫度23℃，每天光照16h、黑暗8h，光照強度2000lux的條件培養(yǎng)，每8天傳代一次，直至培養(yǎng)液中細胞鮮重達初始細胞接種量4倍；2)取步驟1)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重55g/L的接種量接種于20mL生長培養(yǎng)基中，以溫度23℃，115rpm的轉速搖床培養(yǎng)6天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重275g/L的接種量接種于20mL生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度2500lux，115rpm的轉速搖床培養(yǎng)3天；3)取步驟2)培養(yǎng)所得的天山雪蓮細胞，以鮮重75g/L的接種量接種于20L生長培養(yǎng)基中，以0.5m3/h的通氣速率培養(yǎng)7天；從產(chǎn)物中取天山雪蓮細胞，以鮮重225g/L的接種量接種于20L生產(chǎn)培養(yǎng)基中，以24h全光照，光照強度2500lux，0.5m3/h的通氣速率培養(yǎng)2天；其中所述生長培養(yǎng)基是含有0.5mg/L植物激素6-BA、1mg/L植物激素NAA、30g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基；所述生產(chǎn)培養(yǎng)基是含有0.5mg/L植物激素6-BA、1mg/L植物激素NAA、500μmol/l苯丙氨酸、5μmol/l冠菌素、20g/l蔗糖的MS培養(yǎng)基。以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3