在線工業(yè)魯棒化調(diào)控細(xì)胞狀態(tài)生產(chǎn)抗Her-2單抗的裝置與方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域中可在線調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)生產(chǎn)抗Her-2單克隆抗體的裝置與方法，尤其涉及一種可在線工業(yè)魯棒化(industrially robust)連續(xù)監(jiān)控、連續(xù)灌注生物反應(yīng)器及培養(yǎng)瓶/袋系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中各項(xiàng)理生化指標(biāo)，并可直接在線調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞狀態(tài)的細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增和制備抗Her-2單克隆抗體的裝置和方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌是一類疾病而不是一種疾病，它的發(fā)生涉及細(xì)胞凋亡與增殖失衡、細(xì)胞的分化紊亂、癌基因與抑癌基因的功能失調(diào)以及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)等多種生命活動(dòng)的異常。HER2作為與乳腺癌的轉(zhuǎn)移預(yù)后有密切關(guān)系的癌基因，已成為目前的研究熱點(diǎn)之一。
[0003]1987年，Slamon等在一項(xiàng)189名人乳腺癌的研究中，首次報(bào)道了原癌基因HER2在乳腺癌癌細(xì)胞中的表達(dá)，指出HER2基因在乳腺癌的生物學(xué)行為和發(fā)病機(jī)制中有重要作用。HER2也稱為c-erB2或HER2，由922個(gè)腺嘌呤、1382個(gè)胞嘧啶、1346個(gè)鳥(niǎo)嘌呤和880個(gè)胸腺嘧啶組成。原癌基因HER2(即Erb_B2)位于染色體17q21，編碼185kDa具有跨膜酪氨酸激酶活性的生長(zhǎng)因子受體。由胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)三部分組成，胞外結(jié)構(gòu)域主要是由2個(gè)配體結(jié)合域(RLD)與2個(gè)富含半胱氨酸區(qū)構(gòu)成。HER2單體無(wú)活性，必須形成二聚體才能產(chǎn)生活化信號(hào)。HER2異質(zhì)二聚體大大減弱了 EGFR與cabl的偶聯(lián)，減少了 EGFR在細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程中的降解，促進(jìn)EGFR循環(huán)回到細(xì)胞膜，使EGFR在細(xì)胞膜過(guò)度表達(dá),加速了細(xì)胞的增殖,導(dǎo)致腫瘤形成和增長(zhǎng)加快。
[0004]HER2通過(guò)多種細(xì)胞內(nèi)分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，其主要下游物質(zhì)包括絲裂原活化蛋白(MAP)激酶、PI3激酶、C-Src、Shc及Grb2等；HER2介導(dǎo)的胞內(nèi)信號(hào)途徑主要包括促絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑、磷脂酰肌醇-3激酶(P1-3K)及絲-蘇氨酸激酶(AKT)途徑。HER2介導(dǎo)的另一信號(hào)途徑為在細(xì)胞存活中發(fā)揮重要作用的P1-3K/AKT途徑。HER2過(guò)表達(dá)可激活A(yù)KT及核因子-K B (NF- K B)，持續(xù)活化的AKT和NF- κ B能導(dǎo)致抗凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)TNF- α的抗性，降低宿主對(duì)腫瘤的防御能力。
[0005]Tutsi等對(duì)698例原發(fā)性乳腺癌患者進(jìn)行了持續(xù)54個(gè)月的跟蹤隨訪發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是淋巴結(jié)陰性還是陽(yáng)性組，單因素或多因素分析都顯示HER2基因的擴(kuò)增是主要的預(yù)后指標(biāo)。并且，Salmon等認(rèn)為HER2是比雌激素受體、腫瘤大小等更有價(jià)值的預(yù)后指標(biāo)。Tutsi等研究發(fā)現(xiàn)可聯(lián)合HER2與ER兩者來(lái)判斷乳腺癌的預(yù)后和臨床療效。HER2基因是第一個(gè)用來(lái)預(yù)測(cè)化療療效的因子。1994年，Muss等第一次報(bào)道了 HER2基因擴(kuò)增或蛋白過(guò)度表達(dá)的患者對(duì)含有阿霉素(Doxorubicin)的化療方案效果較好后，世界上許多研究小組都進(jìn)行回顧性的研究，證實(shí)了 HER2與Doxorubicin的關(guān)系并發(fā)現(xiàn)了這種關(guān)系的生物學(xué)機(jī)制。Mazouni等研究39名正接受新輔助療法的有HER2擴(kuò)增的I1、111期原發(fā)性乳腺癌患者發(fā)現(xiàn)，對(duì)接受化療尤其是赫賽汀治療的乳腺癌患者，血清HER2ECD的下降水平與病理應(yīng)答有關(guān)，提示血清HER2E⑶水平可能用來(lái)監(jiān)控HER2過(guò)表達(dá)的原發(fā)性乳腺癌患者的化療療效。
[0006]曲妥珠單抗是一種重組DNA衍生的人源化單克隆抗體，選擇性地作用于人表皮生長(zhǎng)因子受體_2(HER2)的細(xì)胞外部位。此抗體屬I(mǎi)gGl型，含人的框架區(qū)，及能與HER-2結(jié)合的鼠抗-P185HER2抗體的互補(bǔ)決定區(qū)。人源化的抗HER2抗體是由懸養(yǎng)于無(wú)菌培養(yǎng)基中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(中CH0)產(chǎn)生的，用親合色譜法和離子交換法純化，包括特殊的病毒滅活的去除程序。國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞HER2原癌基因或C-erbB2編碼一個(gè)單一的受體樣跨膜蛋白，分子量185kDa，其結(jié)構(gòu)上與表皮生長(zhǎng)因子受體相關(guān)。在原發(fā)性乳腺癌患者中觀察到有25%-30%的患者HER2過(guò)度表達(dá)。HER2基因擴(kuò)增的結(jié)果是這些腫瘤細(xì)胞表面HER2蛋白表達(dá)增加，導(dǎo)致HER2受體活化。研究表明，HER2過(guò)度表達(dá)的腫瘤患者較無(wú)過(guò)度表達(dá)的無(wú)病生存期短。HER2的過(guò)度表達(dá)可通過(guò)以下方法診斷:對(duì)腫瘤組織塊以免疫組化為基礎(chǔ)的評(píng)價(jià)法，組織或血衆(zhòng)樣品的ELISA法或熒光原位雜交法(FISH)。
[0007]曲妥珠單抗在體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均顯示可抑制HER2過(guò)度表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖。另外，曲妥珠單抗是抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)(ADCC)的潛在介質(zhì)。在體外研究中，曲妥珠單抗介導(dǎo)的ADCC被證明在HER2過(guò)度表達(dá)的癌細(xì)胞中比HER2非過(guò)度表達(dá)的癌細(xì)胞中更優(yōu)先產(chǎn)生。
[0008]Genentech公司就Herceptin產(chǎn)品相關(guān)的專利申請(qǐng)了如下保護(hù):
[0009](I) 一種可與HER2受體胞外區(qū)特異性結(jié)合、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的單克隆抗體及該其在在治療過(guò)量表達(dá)HER2受體的癌癥病人方面的應(yīng)用。
[0010](2) 一種可與HER2受體胞外區(qū)特異性結(jié)合、使過(guò)量表達(dá)HER2
[0011]受體的腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性因子更敏感的單克隆抗體。
[0012](3)治療過(guò)量表達(dá)HER2受體的癌癥病人的方法，包括給上述患者服用有效量的細(xì)胞毒性因子和能與HER2受體結(jié)合、使過(guò)量表達(dá)HER2受體的腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性因子更敏感的抗體，以消除或減小患者的腫瘤。
[0013](4)細(xì)胞毒性因子和抗體抗原結(jié)合殘基在上述權(quán)利要求方面的應(yīng)用。
[0014]Genentech公司就與Herceptin產(chǎn)品相關(guān)的技術(shù)已在美國(guó)、日本、加拿大申請(qǐng)了專利保護(hù)，具體的專利為JP3502885、US5677171、
[0015]US5720937、US5720954、US5725856、US5770195、US5772997、
[0016]JP11255666、JP11335297、JP3040121、CA1341082、US6165464
[0017]、US6387371、US6399063、US2002192211。但針對(duì)于抗體工藝的細(xì)節(jié)，并沒(méi)有過(guò)多涉及。
[0018]就抗Her-2單克隆抗體的產(chǎn)業(yè)化工藝而言，現(xiàn)代動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)表達(dá)技術(shù)是上述產(chǎn)品的關(guān)鍵核心技術(shù)，該技術(shù)工藝復(fù)雜、難度大。這些先進(jìn)的重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)掌握在國(guó)外少數(shù)制藥公司手中，幫助這些跨國(guó)公司攫取高額利潤(rùn)。而我國(guó)比世界先進(jìn)技術(shù)水平相差懸殊，是牽扯到一系列技術(shù)的整體性工業(yè)的差距。因此，我們不僅需要快速追趕，縮小差距，更需要加快技術(shù)研發(fā)，在相關(guān)領(lǐng)域取得跨越式發(fā)展，形成真正具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗Her-2單克隆抗體生產(chǎn)的核心關(guān)鍵技術(shù)。
[0019]目前，重組抗Her-2單克隆抗體的生產(chǎn)表達(dá)方法通常為采用批培養(yǎng)，分批補(bǔ)料培養(yǎng)等。這些重組蛋白生產(chǎn)工藝雖然已經(jīng)被放大至1000L以上，但是工藝本身存在如下缺點(diǎn):I)培養(yǎng)，表達(dá)過(guò)程的參數(shù)控制較少，不能完全或只能部分程度的控制培養(yǎng)環(huán)境的理化條件如溫度，pH，CO2和O2濃度，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度等；2)即使通過(guò)反應(yīng)器對(duì)理、生、化條件進(jìn)行精確控制，但這種控制方法仍然缺乏對(duì)細(xì)胞狀態(tài)本身的精確調(diào)節(jié)和控制。處于生長(zhǎng)和蛋白過(guò)程中的細(xì)胞狀態(tài)可以極大地影響最終表達(dá)的重組蛋白質(zhì)量(如蛋白質(zhì)的糖基化水平，蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的正確形成)，而細(xì)胞狀態(tài)并不僅僅是通過(guò)上述理、生、化等參數(shù)對(duì)細(xì)胞的影響所能決定的，對(duì)于抗Her-2單克隆抗體這樣的蛋白來(lái)說(shuō)，生產(chǎn)獲得的蛋白活性更加是遠(yuǎn)遠(yuǎn)比單純的蛋白質(zhì)量重要；3)批次培養(yǎng)獲得的細(xì)胞的重復(fù)性較低，且極大地受到不同實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)技術(shù)人員個(gè)人操作的影響，在試驗(yàn)和生產(chǎn)中會(huì)出現(xiàn)較大的批次間差異(batch to batchvariat1n)，這也是目前藥物品質(zhì)控制和監(jiān)管領(lǐng)域的難題之一。因此，一種具有簡(jiǎn)便可靠性的(robust)可大規(guī)?；?scalable)應(yīng)用于工業(yè)化(industrial)抗Her_2單克隆抗體是目前表達(dá)工藝(process development)研究領(lǐng)域的瓶頸。
[0020]此外，對(duì)于傳統(tǒng)工藝用細(xì)胞狀態(tài)“好”與“壞”來(lái)描述細(xì)胞是一種口語(yǔ)化的表達(dá)，而“延遲期”，“對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期”和“平臺(tái)期”等言語(yǔ)也是一個(gè)較為籠統(tǒng)的概念，不夠精確和準(zhǔn)確。據(jù)公開(kāi)報(bào)導(dǎo)和本公司研究部門(mén)的研究結(jié)果，細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)與整個(gè)群體的細(xì)胞周期分布具有一定的相關(guān)性。按照細(xì)胞在分裂過(guò)程中表現(xiàn)出的顯著性差異的行為，細(xì)胞周期可以大致分為三個(gè)階段(圖1 (圖片來(lái)源于:Hwww.newearthb1med.0rgH)):gap I phase (G1 phase,Gl期)是一個(gè)細(xì)胞周期的起始階段，在這個(gè)階段，細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行相關(guān)蛋白質(zhì)的合成等行為，細(xì)胞體積和基因組不產(chǎn)生任何變化，隨后，細(xì)胞會(huì)根據(jù)自身所處的環(huán)境來(lái)判斷是否跨越過(guò)限制點(diǎn)(restrict1n poin