專利名稱：一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白用作檢 測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)第四位常見的惡性腫瘤，也是我國(guó)第二位常見惡性腫瘤， 每年大約有250，000名患者死于肝細(xì)胞癌。肝細(xì)胞癌惡性程度高，容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后 差，而且早期診斷較困難，往往延誤了最佳治療時(shí)期。但由于西方發(fā)達(dá)國(guó)家肝癌的發(fā)病率較 低，國(guó)際上對(duì)肝癌的基礎(chǔ)研究仍較為薄弱，而我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)家，發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)上 升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡構(gòu)成年輕化，每年用于肝癌治療的醫(yī)療支出大為增加，肝癌成了嚴(yán)重危 害我國(guó)人民生命財(cái)產(chǎn)安全的頭號(hào)敵人，并且是影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個(gè)重要因素，因此，加 大力度進(jìn)行我國(guó)肝癌的基礎(chǔ)研究具有戰(zhàn)略意義，而分離和鑒定新的肝癌相關(guān)基因是目前肝 癌基礎(chǔ)研究中的前沿課題。到目前為止，已有不下20種的基因異常表達(dá)被確定與肝癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但已 確定的肝癌相關(guān)基因在肝癌中的異常表達(dá)率并不高，肝癌的發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明，肝癌 的早期診斷率仍有待提高。此外，傳統(tǒng)的肝癌手術(shù)加化療以及近年來(lái)配合使用的多種基因 治療方法仍沒有明顯提高肝癌患者的生存率，因而尋找新的肝癌相關(guān)基因、尤其是肝癌高 表達(dá)基因?qū)τ谔接懜伟┑陌l(fā)病機(jī)制具有重要意義。因此，研究和開發(fā)在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白質(zhì)具有重要意義，尋找 新的在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)的基因和/或蛋白質(zhì)也具有迫切需要性。Rad9A ^ S (Cell cycle checkpoint control protein RAD9A, hRAD9A, EC = 3. 1. 11. 2，DNArepair exonuclease Rad9A homolog A)的 NCBI 登錄號(hào)為 NP_004575， Swissprot 登錄號(hào)為 Q99638, IPI 號(hào)為 IPI00005277. 4 (human3. 28 version)。Rad9A 的一個(gè) 主要功能是提高細(xì)胞對(duì)DNA損傷的抗性并維持基因組的完整性。這與Rad9A參與以下生理 過程有關(guān)參與構(gòu)成Rad9A-Radl-HuSl復(fù)合物，調(diào)控細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)；參與修復(fù)DNA損傷， 主要是堿基切除修復(fù)(base excision repair)；參與維持端粒的穩(wěn)定。Rad9A還參與細(xì)胞 凋亡DNA損傷促使Rad9A被caspase 3剪切，產(chǎn)生的N端片段從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，隨后 與抗凋亡的Bcl-XL蛋白結(jié)合而抑制其功能，從而促進(jìn)凋亡。另外，Rad9A還具有以下功能 反式激活目標(biāo)基因、3’ _5’核酸外切酶活性、抑制雄性激素受體的反式激活活性以及參與核 糖核苷酸的合成等(http://www. uniprot. org/uniprot/Q99638)。在 Rad9A 蛋白的 387 位 的絲氨酸殘基上發(fā)生磷酸化獲得的蛋白即為Ph0Sph0-Rad9A-S387。另外，有少量研究顯示，Rad9A蛋白與部分癌癥相關(guān)，如Cheng等在48例乳腺癌 樣本中發(fā)現(xiàn)有25例乳腺癌樣本中Rad9A的mRNA水平顯著上調(diào)，但沒有1例乳腺癌樣本 Φ Rad9A ^ mRNA /JC5FII^TiI (The cell cycle checkpoint gene Rad9A is a novel oncogene activatedby llql3 amplification and DNA methylation in breast cancer.Cancer Res 2005,65, (19)，8646-54)；隨后，Kebebew 等證實(shí)在甲狀腺癌中 Rad9A 的 mRNA 水平H著上升(Diagnosticand prognostic value of cell-cycle regulatory genes in malignant thyroid neoplasms. World JSurg 30(5) :767_74) ；Zhu 等發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞 系中Rad9A的表達(dá)水平較正常的前列腺細(xì)胞系顯著升高(Rad9A has a functional role in human prostate carcinogenesis. Cancer Res 68(5) : 1267-74) ；Maniwa 等證實(shí) Rad9A 的表達(dá)水平在部分非小細(xì)胞肺癌樣本中顯著升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Rad9A存在過度磷酸化現(xiàn)象 (Accumulation of hRad9A protein in the nuclei of nonsmall eelllung carcinoma cells. Cancer 103(1) :126_32)。但是到目前為止，現(xiàn)有文獻(xiàn)中未見有Rad9A，特別是Ph0Sph0-Rad9A-S387，與肝細(xì) 胞癌的相關(guān)性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
通過篩選在人類肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，本申 請(qǐng)的發(fā)明人找到了一種在人類肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達(dá)的蛋白 質(zhì)(在癌組織中表達(dá)上調(diào))，經(jīng)質(zhì)譜鑒定為Ph0Sph0-Rad9A-S387。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)， Phospho-Rad9A-S387的確在肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達(dá)(在癌組織 中表達(dá)上調(diào))。利用人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H印G2和人正常肝細(xì)胞株L02進(jìn)行的免疫熒光實(shí)驗(yàn)， 證明Ph0Sph0-Rad9A-S387在這兩種細(xì)胞株間存在差異表達(dá)(在人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H印G2 中表達(dá)上調(diào))。通過對(duì)62對(duì)人肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一 步證實(shí)了 Ph0Sph0-Rad9A-S387在人類肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織中存在差異表達(dá)(在 癌組織中表達(dá)上調(diào))。基于Ph0Sph0-Rad9A-S387與肝細(xì)胞癌的這種相關(guān)性，這種蛋白質(zhì)可以作為一種 蛋白質(zhì)分子標(biāo)記物對(duì)它的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)可以用于檢測(cè)肝細(xì)胞癌。因此，本發(fā)明的首要目的在于提供Ph0Sph0-Rad9A-S387的一種應(yīng)用。本發(fā)明提供的Ph0Sph0-Rad9A-S387的應(yīng)用為作為用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的分子標(biāo)記 物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體的應(yīng)用。本發(fā)明提供的Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體的應(yīng)用，為用于制備檢測(cè)肝細(xì)胞癌的 制劑和/或用于制備檢測(cè)肝細(xì)胞癌的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明，抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種體外檢測(cè)肝組織中Ph0Sph0-Rad9A-S387的表 達(dá)是否異常的方法。本發(fā)明提供的方法為檢測(cè)待測(cè)肝組織中Ph0Sph0-Rad9A-S387的數(shù)量，并與正常 肝組織中的Ph0Sph0-Rad9A-S387的數(shù)量進(jìn)行比較。鑒于到目前為止，還沒有Ph0Sph0-Rad9A-S387的表達(dá)量與肝細(xì)胞癌早期診斷的相 關(guān)性報(bào)道。因此，本發(fā)明的這一發(fā)現(xiàn)將為肝細(xì)胞癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。


圖IA為Ph0Sph0-Rad9A-S387的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，泳道1_6為肝細(xì)胞癌組織的檢測(cè)結(jié)果，泳道1’ -6’為與泳道1-6對(duì)應(yīng)的癌旁組織的檢測(cè)結(jié)果。圖IB為Rad9A的免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，泳道1_6為肝細(xì)胞癌組織的檢測(cè)結(jié)果， 泳道1’ -6’為與泳道1-6對(duì)應(yīng)的癌旁組織的檢測(cè)結(jié)果。圖2A為對(duì)圖IA的免疫印跡結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)分布圖， 其中，HCC為肝細(xì)胞癌患者的癌組織，non-HCC為癌旁組織。圖2B為對(duì)圖IB的免疫印跡結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析得出的蛋白質(zhì)表達(dá)量相對(duì)分布圖， 其中，HCC為肝細(xì)胞癌患者的癌組織，non-HCC為癌旁組織。圖3為Phospho-Rad9A-S387的免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，Al為!fepG2細(xì)胞中 Phospho-Rad9A-S387的分布情況，A2為H印G2的細(xì)胞核，A3為Al和A2的疊加圖，Bl為L(zhǎng)02 細(xì)胞中Phospho-Rad9A-S387的分布情況，B2為L(zhǎng)02的細(xì)胞核，B3為Bl和B2的疊加圖。圖4為Ph0Sph0-Rad9A-S387的免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，A為肝細(xì)胞癌組織， B為癌旁組織，物鏡放大倍數(shù)為20倍。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人， 分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的條件，或按照制造廠商所建議的條件。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，尿素、3-[(3_膽酰胺丙基)_ 二乙銨]-1-丙磺酸 (CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三(羥甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙 酰胺(IAA)購(gòu)自Bio-Rad公司；CLM-2262L-Leu(U-13C6,98% )購(gòu)自劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；透 析胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；D9785細(xì)胞培養(yǎng)粉末、β -巰基乙醇、L-GlruL-Lys和L-Met購(gòu) 自 Sigma 公司；胰蛋白酶(Trypsin，sequencing grade)購(gòu)自 Promega 公司；SCX 柱禾Π SAX 柱以及PH緩沖液試劑盒購(gòu)自Column Technology公司；!fepG2細(xì)胞株和L02細(xì)胞株購(gòu)自中 國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)和細(xì)胞研究所的細(xì)胞庫(kù)。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的溶液/培養(yǎng)基配方如下不含谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)基5%透析胎牛血清，0.2mM苯甲基磺酰氟 (PMSF)，ImM EDTA,苯甲異惡唑青霉素25mg/mL，慶大霉素50mg/mL，青霉素100U/mL，鏈霉素 100mg/mL,兩性霉素 B 0. 25mg/mL,制霉菌素 50U/mL。裂解液8mol/L尿素、4% CHAPS、40mmol/L Tris 和 65mmol/L DTT。裂解緩沖液8mol/L尿素，40mmol/L Tris, 65mmol/L DTT。TBST =Tris 2. 42g/L，氯化鈉 8g/L, Tween_201ml/L，用 HCl 調(diào)節(jié) pH 到 7. 6。本申請(qǐng)的發(fā)明人用非酶解樣品制備法(nonenzymatic sample preparation, NESP)制備了肝細(xì)胞癌的癌組織與癌旁組織的蛋白質(zhì)樣品，并以13C標(biāo)記的!fepG2和L02細(xì) 胞的蛋白質(zhì)樣品等比例混合物作為內(nèi)標(biāo)，采用CDIT技術(shù)結(jié)合以溶液內(nèi)酶解結(jié)合陰陽(yáng)多維 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定并比較其表達(dá)量， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rad9A在肝細(xì)胞癌組織中上調(diào)表達(dá)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和免疫組織化 學(xué)實(shí)驗(yàn)證明Ph0Sph0-Rad9A-S387的確在肝細(xì)胞癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中存在差異表達(dá)。實(shí)施例1、肝細(xì)胞癌的癌組織及癌旁組織蛋白質(zhì)樣品的制備從東方肝膽外科醫(yī)院獲取5例肝細(xì)胞癌患者的癌組織及癌旁組織，該5例患者，均 由2名病理科醫(yī)生確診，患有肝細(xì)胞癌，5例患者的病理資料如表1所示。表1、5例肝細(xì)胞癌患者的病理資料
權(quán)利要求
一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白的應(yīng)用，所述細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白為Phospho Rad9A S387，其特征在于，所述應(yīng)用為用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用作檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記 是檢測(cè)這種蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞組織中的表達(dá)量。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)這種蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞組織中的表 達(dá)量是檢測(cè)這種蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞組織中是否均存在上調(diào)表達(dá)。
4.一種抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為用于制備檢測(cè) 肝細(xì)胞癌的制劑。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體包括單 克隆抗體和多克隆抗體。
6.一種抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為用于制備檢測(cè) 肝細(xì)胞癌的試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體包括單 克隆抗體和多克隆抗體。
8.一種體外檢測(cè)肝組織中Ph0Sph0-Rad9A-S387的表達(dá)是否異常的方法，其特征在 于，所述方法為檢測(cè)待測(cè)肝組織中Ph0Sph0-Rad9A-S387的數(shù)量，并與正常肝組織中的 Phospho-Rad9A-S387的數(shù)量進(jìn)行比較。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述檢測(cè)為使用抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的 抗體進(jìn)行檢測(cè)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗Ph0Sph0-Rad9A-S387的抗體包括單 克隆抗體和多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白的應(yīng)用。本發(fā)明提供的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)控蛋白為Phospho-Rad9A-S387，其應(yīng)用為Phospho-Rad9A-S387作為檢測(cè)肝細(xì)胞癌的蛋白質(zhì)分子標(biāo)記的應(yīng)用。Phospho-Rad9A-S387在肝細(xì)胞癌的癌細(xì)胞和癌旁細(xì)胞中存在明顯的差異表達(dá)，因此，可根據(jù)其在肝細(xì)胞中的表達(dá)量檢測(cè)患者是否患有肝細(xì)胞癌。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101995472SQ20091005678
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月21日
發(fā)明者徐孟杰, 曾嶸, 李辰, 武祎, 阮宏強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院