本發(fā)明屬于植物細胞培養(yǎng)基技術領域，具體涉及一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術：
紫草入藥，最早見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，《本草綱目》引陶弘景曰“今出襄陽”，可見中國古代一直以紫草為藥用。1990年以后，《中華人民共和國藥典》中收錄了紫草科3種植物，新疆紫草便是其中一種，且品質(zhì)最佳。新疆紫草為紫草科多年生草本植物，有平伏狀粗毛，根粗大，圓錐形，多扭曲，干時紫色。花期6～8月，果期8～9月。喜涼爽濕潤氣候，耐寒，怕高溫，多生于山地、草叢和干燥的石質(zhì)山坡、山谷及灌木林下，中國藥用紫草中70％的原料來自新疆紫草。新疆紫草的有效藥用成分是紫草素及其衍生物，這些成分不但具有抗菌、抗炎、抗癌等多種藥理作用，而且還作為天然色素廣泛用于醫(yī)藥、化妝品和印染工業(yè)中。
中國專利CN1117525B采用新疆紫草幼苗的不同器官作外植體誘導愈傷組織并獲細胞系，建立了細胞固體二步培養(yǎng)生產(chǎn)工藝流程，包括AG-7生長培養(yǎng)基與AP-5生產(chǎn)培養(yǎng)基。中國專利申請CN101289651A提供了一種新疆紫草細胞系和細胞培養(yǎng)生產(chǎn)新疆紫草紫草素的方法，該方法采用液-固培養(yǎng)相結合，通過液體培養(yǎng)制種，固體培養(yǎng)得到培養(yǎng)物，從中選擇綜合性狀好的留種用于液體培養(yǎng)，如此反復。
目前，市場上的新疆紫草基本上來源于野生，在利益的驅(qū)動下，藥農(nóng)一哄而上，年復一年濫采濫挖，導致野生紫草產(chǎn)量連年下滑，而市場需求卻有增無減，缺口繼續(xù)加大。因此，通過細胞的大規(guī)模培養(yǎng)直接生產(chǎn)紫草素來滿足藥用需求是比較有潛力的途徑。但是，細胞培養(yǎng)過程中由于藥用成分含量低而導致成本過高的問題嚴重制約著產(chǎn)業(yè)化進程。因此，研發(fā)出一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基是必要的。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，能提供細胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，成分明確且價格較低，大大縮短了新疆紫草細胞的生產(chǎn)周期，紫草素產(chǎn)量高，有利于日常應用、廣泛推廣及產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。
本發(fā)明的技術方案是：
一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.08-0.15μM，鹽酸吡哆醇8-13mg/L，胸腺嘧啶5-8mg/L，泛酸鈣1-5mg/L，谷胱甘肽10-16μg/L，活性炭0.06-0.14g/L，吲哚乙酸7-12mg/L，甘露醇20-40mg/L，大豆苷50-75μg/L，檸檬酸三銨10-50mg/L和木糖醇20-40g/L。
一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，優(yōu)選的方案是，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.12μM，鹽酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸鈣3mg/L，谷胱甘肽12μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，甘露醇27mg/L，大豆苷62μg/L，檸檬酸三銨40mg/L和木糖醇25g/L。
優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基或White培養(yǎng)基。
另外，本發(fā)明還提供了所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基的制備方法，步驟如下：
S1向基礎培養(yǎng)基中加入鹽酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸鈣、吲哚乙酸、檸檬酸三銨和木糖醇，攪拌30分鐘，加入硫酸鋅、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，繼續(xù)攪拌20分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.5-5.8，滅菌溫度為115-122℃，滅菌時間為25-30分鐘，即得。
優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.6。
優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌溫度為117℃。
優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌時間為28分鐘。
本發(fā)明所用主要原料的作用：
鹽酸吡哆醇：鹽酸吡哆醇，別名維生素B6。白色或類白色的結晶或結晶性粉末；無臭，味酸苦。分子式：C8H11NO3·HCl；C8H12ClNO3，分子量205.64。鹽酸吡哆醇可作為維生素強化劑。本品是機體內(nèi)很多酶如轉(zhuǎn)氨基酶、脫羧酶、消旋酶、脫氫酶、合成酶和羥化酶等的輔酶，且可幫助糖類和蛋白質(zhì)的分解、利用。缺乏時有類似煙酸的缺乏癥。此外，鹽酸吡哆醇還參與色氨酸將煙酸轉(zhuǎn)化為5-羥色胺的反應。并可刺激白細胞的生長，是形成血紅蛋白所需要的物質(zhì)。
胸腺嘧啶：胸腺嘧啶自胸腺中分離得到的一種嘧啶堿。分子式：C5H6N2O2，分子量：126.11，熔點：316℃。胸腺嘧啶是遺傳物質(zhì)的重要組成部分，是合成抗艾滋病藥物AZT、DDT及相關藥物的關鍵中間體，也是合成抗腫瘤，抗病毒藥物β-胸苷的起始原料。
谷胱甘肽：谷胱甘肽(分子式C10H17O6N3S)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的的三肽，具有抗氧化作用和解毒作用。谷胱甘肽在生命體內(nèi)的作用機理和四大生理功能：1、清除人體細胞內(nèi)的自由基，是細胞內(nèi)最主要的抗氧化劑。2、與人體內(nèi)的有毒物質(zhì)結合并排出體外，是人體內(nèi)重要的解毒劑。3、激活和保護免疫細胞，增強人體免疫功能，是重要的免疫增強劑。4、影響皮膚細胞酪氨酸酶活性、抑制黑色素生成，防止皮膚色斑的產(chǎn)生。
活性炭：活性炭可以降低組織培養(yǎng)物的有害代謝物濃度，對細胞生長有利。活性炭為木炭粉碎經(jīng)加工形成的粉末結構，它結構疏松，孔隙大，吸水力強，有很強的吸附作用，它的顆粒大小決定著吸附能力、粒度越小，吸附能力越大。它可以吸附非極性物質(zhì)和色素等大分子物質(zhì)，包括瓊脂中所含的雜質(zhì)，培養(yǎng)物分泌的酚、醌類物質(zhì)以及蔗糖在高壓消毒時產(chǎn)生的5-羥甲基糖醛及激素等。
吲哚乙酸：CAS號：87-51-4，分子式：C10H9NO2，分子量：175.18。吲哚乙酸是一種有機物。純品是無色葉狀晶體或結晶性粉末。遇光后變成玫瑰色。熔點165-166℃。易溶于無水乙醇、醋酸乙酯、二氯乙烷，可溶于乙醚和丙酮。不溶于苯、甲苯、汽油及氯仿。用途：用作植物生長刺激素及分析試劑。
甘露醇：甘露醇的分子式：C6H14O6，分子量：182.17，CAS號：69-65-8。甘露醇是一種己六醇，因溶解時吸熱，有甜味，對口腔有舒服感，故更廣泛用于醒酒藥、口中清涼劑等咀嚼片的制造，其顆粒型專作直接壓片的賦形劑。甘露醇是一種高滲性的組織脫水劑，臨床上廣泛應用于治療腦水腫，預防急性腎衰，治療青光眼，加速毒物及藥物從腎臟的排泄。
大豆苷：CAS號：552-66-9，分子式：C21H20O9，分子量：416.38。藥理作用：降低血壓影響，改善腦循環(huán)，擴張冠脈，改善心肌功能，解熱作用，松弛平滑肌的作用。
本發(fā)明提供的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括硫酸鋅、鹽酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸鈣和大豆苷等。在本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分中，基礎培養(yǎng)基能夠提供新疆紫草的生存和最低的生理活動。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的鹽酸吡哆醇和泛酸鈣，能夠提供新疆紫草細胞所需營養(yǎng)素，促進新疆紫草細胞的發(fā)育。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的胸腺嘧啶，對新疆紫草細胞的分裂起促進作用。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的谷胱甘肽，能夠誘導細胞的增殖，避免過氧化物對新疆紫草細胞的損害。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的活性炭，能夠吸附新疆紫草細胞生長中代謝的有毒物質(zhì)，但是，活性炭在吸附培養(yǎng)基中的有害物質(zhì)的同時，也能吸附生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其它培養(yǎng)基中的成分，發(fā)明人在使用活性炭時，考慮到活性炭的兩面性，經(jīng)大量實驗，得到合適的活性炭與培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的配比，使其都能更好的發(fā)揮作用。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的吲哚乙酸，能夠調(diào)節(jié)新疆紫草細胞的生長。在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的甘露醇，能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓，維持細胞膜內(nèi)外滲透壓平衡，提高滲透壓，防止水分滲入細胞內(nèi)部，造成細胞破裂，另外，本發(fā)明培養(yǎng)基中甘露醇還與木糖醇一起，起到提供碳源的作用。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用大豆苷，能夠與其它物質(zhì)相互作用，促進細胞增殖。本發(fā)明促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基搭配合理，各成分間協(xié)同作用，能提供新疆紫草細胞生長增殖所需的充足營養(yǎng)與良好環(huán)境，促進細胞的增殖，大大縮短了新疆紫草細胞的生產(chǎn)周期，能夠促進新疆紫草細胞合成紫草素，紫草素產(chǎn)量高。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢：
(1)本發(fā)明提供的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，成分明確且價格較低，有利于日常應用、廣泛推廣及產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)。
(2)本發(fā)明提供的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，不占耕地、不破壞新疆紫草野生資源，保護了生態(tài)環(huán)境，解決了新疆紫草資源短缺的問題。
(3)本發(fā)明提供的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，大大縮短了新疆紫草細胞的生產(chǎn)周期，能夠促進新疆紫草細胞合成紫草素，紫草素產(chǎn)量高。
具體實施方式
以下通過具體實施方式的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明B5培養(yǎng)基可購自青島海博生物技術有限公司；White培養(yǎng)基可購自青島海博生物技術有限公司；大豆苷可購自南京廣潤生物制品有限公司。
實施例1、一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基
所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.08μM，鹽酸吡哆醇8mg/L，胸腺嘧啶5mg/L，泛酸鈣1mg/L，谷胱甘肽10μg/L，活性炭0.06g/L，吲哚乙酸7mg/L，甘露醇20mg/L，大豆苷50μg/L，檸檬酸三銨10mg/L和木糖醇20g/L。
所述基礎培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎培養(yǎng)基中加入鹽酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸鈣、吲哚乙酸、檸檬酸三銨和木糖醇，攪拌30分鐘，加入硫酸鋅、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，繼續(xù)攪拌20分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.5，滅菌溫度為115℃，滅菌時間為25分鐘，即得。
實施例2、一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基
所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.15μM，鹽酸吡哆醇13mg/L，胸腺嘧啶8mg/L，泛酸鈣5mg/L，谷胱甘肽16μg/L，活性炭0.14g/L，吲哚乙酸12mg/L，甘露醇40mg/L，大豆苷75μg/L，檸檬酸三銨50mg/L和木糖醇40g/L。
所述基礎培養(yǎng)基為White培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎培養(yǎng)基中加入鹽酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸鈣、吲哚乙酸、檸檬酸三銨和木糖醇，攪拌30分鐘，加入硫酸鋅、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，繼續(xù)攪拌20分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.8，滅菌溫度為122℃，滅菌時間為30分鐘，即得。
實施例3、一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基
所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.12μM，鹽酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸鈣3mg/L，谷胱甘肽12μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，甘露醇27mg/L，大豆苷62μg/L，檸檬酸三銨40mg/L和木糖醇25g/L。
所述基礎培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法：
S1向基礎培養(yǎng)基中加入鹽酸吡哆醇、胸腺嘧啶、泛酸鈣、吲哚乙酸、檸檬酸三銨和木糖醇，攪拌30分鐘，加入硫酸鋅、谷胱甘肽、活性炭、甘露醇和大豆苷，繼續(xù)攪拌20分鐘，得混合物；
S2調(diào)節(jié)步驟S1所得混合物的pH至5.6，滅菌溫度為117℃，滅菌時間為28分鐘，即得。
對比例1、一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基
所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.12μM，鹽酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸鈣3mg/L，谷胱甘肽12μg/L，活性炭0.044g/L，吲哚乙酸0.044g/L，甘露醇27mg/L，大豆苷62μg/L，檸檬酸三銨40mg/L和木糖醇25g/L。
所述基礎培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區(qū)別在于，將活性炭和吲哚乙酸的終濃度均調(diào)整為0.044g/L。
對比例2、一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基
所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.12μM，鹽酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸鈣3mg/L，谷胱甘肽74μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，大豆苷62μg/L，檸檬酸三銨40mg/L和木糖醇25.027g/L。
所述基礎培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區(qū)別在于，沒有添加甘露醇，增加木糖醇的濃度。
對比例3、一種促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基
所述促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，包括基礎培養(yǎng)基和添加在所述基礎培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計，包括：硫酸鋅0.12μM，鹽酸吡哆醇11mg/L，胸腺嘧啶7mg/L，泛酸鈣3mg/L，谷胱甘肽74μg/L，活性炭0.08g/L，吲哚乙酸8mg/L，甘露醇27mg/L，葛根素62μg/L，檸檬酸三銨40mg/L和木糖醇25g/L。
所述基礎培養(yǎng)基為B5培養(yǎng)基。
制備方法與實施例3類似。
與實施例3的區(qū)別在于，將大豆苷替換為葛根素。
試驗例一、本發(fā)明促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基對新疆紫草細胞的培養(yǎng)效果
1、試驗對象：本發(fā)明實施例1-3所得促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，以及對比例1-3所得促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基。
2、試驗方法
2.1、細胞的培養(yǎng)
將新疆紫草細胞按5g鮮重/瓶的量分別接種于實施例1-3所得培養(yǎng)基，以及對比例1-3所得培養(yǎng)基，置于搖床中進行懸浮培養(yǎng)，在25℃溫度下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速120r/min，暗培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)14天后，測定細胞生物量和紫草素含量。
2.2、細胞生物量的測定
取新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)液，用濾紙過濾，將細胞置于烘箱中，55℃烘48h至恒重，稱得其干重，為細胞生物量。
2.3、紫草素含量的測定
取培養(yǎng)的新疆紫草細胞懸浮培養(yǎng)液，3600r/min離心15min，回收的沉淀物為鮮細胞。將鮮細胞轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入石油醚，用超聲細胞破碎儀進行破碎，然后在室溫下振蕩(120r/min)提取24h，提取液用于測定細胞中紫草素的含量。采用分光光度法測定新疆紫草細胞中的紫草素含量。
3、實驗結果
不同培養(yǎng)基所得細胞生物量如表1所示，不同培養(yǎng)基所得新疆紫草細胞中紫草素產(chǎn)量如表2所示。
表1：不同培養(yǎng)基所得細胞生物量比較
由表1可以看出，在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，生長在本發(fā)明實施例1-3制備的培養(yǎng)基中所得細胞生物量，明顯高于生長在對比例1-3制備的培養(yǎng)基中所得細胞生物量。這說明，本發(fā)明實施例1-3制備的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基，更有利于新疆紫草細胞的生長增殖。
表2：不同培養(yǎng)基所得新疆紫草細胞中紫草素產(chǎn)量的比較
由表2可以看出，在相同的培養(yǎng)時間內(nèi)，生長在本發(fā)明實施例1-3制備的培養(yǎng)基中新疆紫草細胞的紫草素產(chǎn)量，明顯高于生長在對比例1-3制備的培養(yǎng)基中新疆紫草細胞的紫草素產(chǎn)量。這說明，本發(fā)明實施例1-3制備的促進新疆紫草細胞合成紫草素的培養(yǎng)基更有利于紫草素的合成，提高紫草素的產(chǎn)量。